芽孢杆菌的分离鉴定2

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1、芽孢杆菌的分离与鉴定实验器材：铲子（1）,盆（1）,电子天平（1），洗耳球(1)，接种勾和环（1）,1ml吸管（7）,玻璃涂棒（1）,平皿（12）,250ml带玻璃珠三角瓶（1）,双层纱布（1）,试管（7），标签纸（1）,恒温箱，显微镜（4）。实验试剂：无菌水，1mol/LNaOH、1mol/LHCL、草酸铵结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇、复红液、5%孔雀绿、沙黄、乙醚、吲哚试剂、40%NaOH、肌酸牛肉蛋白胨培养基：牛肉膏1g，蛋白胨2g，Nacl1g，水200ml，ph7.2，琼脂3.0-4.0g；生孢

2、培养基：0.1%蛋白胨，0.1%葡萄糖，0.07%酵母粉，0.02%硫酸镁晶体（七水），0.02%硫酸铵，0.1%磷酸氢二钾（3水），1.5%琼脂；一、土壤中芽孢杆菌的筛选A.培养基配置步骤：（1）称量：按比例称取牛肉膏、蛋白胨、氯化钠，共置于烧杯中；（2）溶解：先加入适量无菌水，加热使其溶解，再补足水至总量；（3）调pH：用1mol/LNaOH或1mol/LHCL调PH至7.6；（4）过滤：用滤纸过滤；（5）融化琼脂：加入3.5克琼脂，继续加热至完全溶解，补足因加热蒸发失去的水分；（6）分装与包扎：摆斜面（7）

3、灭菌：121℃，灭菌20minB.实验步骤：（一）采集土样:每个采样点选取土壤较肥沃、有代表性的地块约0．2cm2，五点法采集。取5～10cm深土壤，每一个土样约500g。将土样放入无菌的纸袋中，并记录采集的时间、地点、植被类型，4℃保存备用。（二）土壤悬液制备：称取10g土样，放入盛有99ml无菌水并带有玻璃珠的250ml三角瓶中，振荡摇晃20min，使土样与水充分混合，将细胞分散，两层纱布过滤，然后将锥形瓶置于90℃水浴锅，加热20min，制备成土壤悬液。（三）土壤悬液稀释：用一支1ml的无菌吸管从锥形瓶吸取

4、过滤的土壤悬液1ml加入盛有9ml无菌水的大试管中，震荡均匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml加入另一只盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同的稀释度。（四）倒平板：将牛肉膏蛋白胨培养基加热融化，冷却至45-50度倒平板，每个梯度两个平行，共12个，每皿15ml左右。平皿凝固后，在平皿底部分别用记号笔用：10-1、10-1、10-2、10-2、10-3、10-3、10-4、10-4、10-5、10-5、10-6、10-6。（五）涂布：用无菌

5、吸管分别将10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的土壤稀释液各吸取0.2ml，将菌悬液小心的对号滴入已写好稀释度的平皿表面中央，再用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻的涂布均匀，倒置放置，待培养。（六）培养：将接种好的平皿倒置于37℃温箱中培养，大约1-2天。（七）平板划线分离纯化：将培养好的单个菌落分别挑取少许细胞接种到牛肉膏蛋白胨培养基斜面培养基上，置于37℃温箱中培养24小时左右，待长出菌苔，镜检其特征是否一致，有杂菌，需再一次分离纯化，直至获得纯培养。(八)生孢培养：再分别挑取单个菌落划线接种

6、于生孢培养基，于37度培养箱培养，直至长出单个菌落。二、纯化菌株的鉴定：（一）观察菌落形态：观察平板菌落形态：菌落为扁平、边缘不整齐、白色、表面粗糙皱褶，（二）观察菌体形态：A.细菌的革兰氏染色　1、涂菌：用无菌操作方法从试管中沾取菌液一环，用接种环在洁净无脂的载玻片上做一薄而均匀、直径约lcm的菌膜。涂菌后将接种环火焰灭菌。　　2、干燥：于空气中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥(温度不宜过高)。　　3、固定：目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色，常用加热法，即将细菌涂片膜向上，通过火焰

7、3次，以热而不烫为宜，防止菌体烧焦、变形。此制片可用于染色。　　4、初染：于制片上滴加结晶紫染液，染lmin后，用水洗去剩余染料。　　5、媒染：滴加卢戈氏碘液，冲去残水，滴两滴卢戈式碘液，覆盖住菌膜。1min后水洗。　　6、脱色：滴加95%乙醇脱色，30s后立即水洗或用卢戈式碘液流加冲洗至流出液刚好无色，立即水洗。　　7、复染：滴加番红或复红液复染lmin，水洗。　　8、滤纸吸干、油镜镜检：革兰氏阳性菌染成蓝紫色，革兰氏阴性菌染成淡红色。B.细菌的芽孢染色　(1)加1～2滴自来水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2

8、～3环培养18～24h的枯草芽孢杆菌菌苔于试管中，并充分混匀打散，制成浓稠的菌液。　　(2)加5%孔雀绿水溶液2～3滴于小试管中，用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。　　(3)将此试管浸于沸水浴(烧杯)中，加热15～20min。　　(4)用接种环从试管底部挑数环菌于洁净的载玻片上，并涂成薄膜，将涂片通过微火3次固定。　　(5)水洗，至流出的水中无孔雀绿颜色为止。　　(6)加