atmct转基因烟草的培育

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1、山东师范大学硕士学位论文AtMCT转基因烟草的培育姓名：李春荣申请学位级别：硕士专业：发育生物学指导教师：王增兰20081010山东师范大学硕士学位论文At肥带基因烟草的培育李春荣(山东师范大学生命科学学院，济南，250014)中文摘要卤代甲烷的生物合成机制已经被发现，由以下酶促反应完成：SAM(S—adenosylmethiomine)+x-(c1一，Br-，r)一CH3X+SAH(S-adenosylhomocysteine)，反应由一种甲基转移酶(MethylChlorideTransferase，MCT)催化完成。模式生物一一拟南芥也产生和释放卤代甲

2、烷，行使此功能的主要的酶是由HOL(HARMLESSTOOZONELAYER)基因编码的，该酶属于甲基转移酶家族，能催化依赖SAM的C1一、Br-、I一的甲基化。线虫是引起植物侵染性病害的四大病原之一，根结线虫更是一种分布广范、严重危害农作物的植物内寄生线虫。目前，对线虫的防治主要以药物(如甲基溴)防治为主，其它防治为辅助手段。甲基溴(CH3Br)一直是作为熏蒸杀虫剂被广泛应用，它可以杀死真菌、细菌、土壤携带的病毒、昆虫、蛾、线虫和啮齿动物。但甲．基溴同时也是一种剧毒农药，如使用不当，会造成人畜伤害和土壤污染。”此外，甲基溴由于会对臭氧层造成破坏，国际组织呼

3、吁尽快淘汰甲基溴。因此，培育出抗病品种是最经济的方法，成为当务之急。本研究以分子生物学和基因工程研究的模式植物——姻草为实验材料，通过农杆菌介导法用含有抗卡那霉素的nptll基因的双元载体将过量表达基因AtMCT导入烟草叶片外植体中，然后在含有卡那霉素的选择培养基上进行筛选培养。对获得的转基因植株进行了PCR检测、Southern和Western杂交鉴定，借以初步探讨过量表达基因AtMCT在植物中的转化和表达情况，是否使转基因烟草能微量、持续产生甲基溴，当病源物侵染时可直接对其作用，从而替代甲基溴土壤熏蒸杀虫剂的作用，为其今后在更多的植物上应用提供依据。同时

4、，本研究把甲基卤化物转移酶基因转化到烟草中，通过加强盐离子代谢，有望提高烟草的钾离子含量，促进光合产物的运输，促进蛋白质和糖类的合成，从而探讨其对改良转基因烟草品质的影响。此技术在国内外首创。山东师范人学硕士学位论文本实验结果如卜．：1)通过直接转化法将At—MCT基因过量表达载体导入农杆菌EHAl05，用50mg／L的Kan作为筛选压，获得的阳性克隆用PCR方法进行验证，获得了和阳性对照一致大小的约750bp条带。2)建立了NC89烟草的遗传转化体系：a)实验中采用无菌苗烟草叶片为外植体，以MS为基本培养基，筛选出适于烟草NC89诱导分化的培养基：MS+6

5、．BA2．0mg／L+NAA0．15mg／L培养基，并于MS生根培养基上获得完整再生植株。b)烟草品种NC89对卡那霉素不敏感，100mg／L的卡那霉素作为烟草叶片转化受体的筛选浓度比较适宜。c)在选择培养中加入500mg／L的头孢霉素能有效抑菌，且不影响外植体的分化，转化率为83．1％。d)对于长到4～6片叶的烟草无菌苗，农杆菌浸染时重悬菌液浓度以OD600=0．5-0．8为宜，长芽的外植体转化率可达96％以上。e)农杆菌的浸染时间对烟草外植体有很大的影响，烟草的浸染时间以∞8min为好。D共培养实验表明，共培养2天是烟草的最佳培养时间，超过3天在以后的培

6、养中无论是水洗还是加大抗菌素的浓度都不能有效抑制农杆菌的生长。3)转化植株的获得：将农杆菌浸染叶盘共培养2天后，转接到筛选诱导培养基上培养，部分愈伤组织白化，具有Kan抗性的愈伤正常生长，2周后就开始出现淡绿色愈伤组织和芽点，最后分化出少量不定芽。转接到含有100mg／LKan和500mg／LCef的抗性芽继代培养基上继续筛选。当抗性芽生长至2-3cm时，置于生根培养基上进行根的诱导，共获得18个AtMCT转化株系，且抗性植株均正常生长。4)转基因植株的分子鉴定：a)为进一步鉴定转基因植株的可靠性，提取卡那霉素抗性植株的叶片总DNA，利用基因的特异引物进行P

7、CR检测，均能扩增出750bp的特异性目的条带，初步表明AtMCT外源基因己整合到受体植物基因组中。b)用CTAB法大量提取烟草叶片的基因组DNA，以野生型植株的DNA作2山东师范大学硕士学位论文对照，用EcoRi酶切后进行Southern印迹，以AtMCT基因的全长为探针进行转基因烟草的Southem杂交分析。Southern杂交结果进一步证实外源基因已整合到烟草的基因组中。c)提取部分转基因植株的可溶性蛋白，用通过树脂层析纯化的在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的AtMCT融合蛋白制备的抗体进行Western杂交：转基因植株均有杂交信号，野生型植株没有杂

8、交信号，表明目的基因在转基因植株中随基因组一起被转录