peg修饰人重组粒细胞集落刺激因子的制备工艺及性质研究

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1、1万方数据2万方数据摘要粒细胞集落刺激因子（granulocytecolonystimulatingfactor，G-CSF）是一种谱系特异性生长因子,主要功能为促进嗜中性粒细胞的产生和分化。其作为药物主要应用于由于接受化疗而导致中性粒细胞减少的病人，有效提升病人体内的白细胞数量，增强病人的免疫力。类似于很多蛋白质药物，rhG-CSF体内半衰期短，易被酶水解和肾消除，因此实际应用时需要多次注射维持血药浓度。聚乙二醇化是一种对蛋白质药物进行PEG共价修饰的技术，通过增加蛋白质药物分子的流体动力学体积，减少了肾清除，从而延长了蛋白质药物的血浆半衰

2、期。本文的研究致力于PEG-rhG-CSF的制备工艺，在保持rhG-CSF活性的同时延长其体内半衰期。本文的研究主要包括以下几个方面：1、rhG-CSF在大肠杆菌中表达多以包涵体形式存在，而外源蛋白形成的包涵体必须经过变性、在折叠复性，才能得到有活性的蛋白产物，因此，包涵体的复性成为大规模制备rhG-CSF的关键技术之一。本研究针对影响包涵体复性的因素，包括pH值、温度、尿素含量、反应时间等进行考察优化。同时，摸索复性液配方中尿素浓度，精氨酸浓度，氧化型/还原型谷胱甘肽比例，甘油所占比例，以提高包涵体的复性效率。2、由于rhG-CSF易被酶水

3、解和肾消除，因此体内半衰期短。本研究采用PEG修饰的方法扩大rhG-CSF分子的流体动力学体积，在不影响rhG-CSF活性的同时，增大其体内半衰期，并对修饰后分子的活性进行检测。3、制备的PEG-rhG-CSF由于分子结构和理化特性有些微改变，因此其保存条件与原型相比要做出改变。因此，选择对温度、pH值，缓冲液成分、赋形剂选择等条件，并结合各种强制降解实验，对制备的PEG-rhG-CSF进行稳定性检测，最终得到该蛋白最适合的保存条件。经过该论文的研究，成功制备并纯化了rhG-CSF和PEG-rhG-CSF，并对两者的生物活性及后者的稳定性进行

4、研究，实现了rhG-CSF的长效化，为长效化rhG-CSF药物的研发提供数据支持。关键词：rhG-CSF，PEG，复性，修饰，稳定性I万方数据AbstractGranulocytecolony-stimulatingfactor(G-CSF)isakindoflineage-specificgrowthfactorthatprimarilyinfluencestheproductionanddifferentiationofneutrophils,anditsuseinmedicinesometimesresultsinshortenedpe

5、riodsofneutropeniainpatientsreceivingintensivechemotherapy.Likemanytherapeuticproteindrugs,becauseofenzymolysisandrenalclearance,rhG-CSFshowsshortserumhalf-life,whichnecessitatesmultipleinjectionstomaintainitsblooddruglevel.PEGylation,thecovalentmodificationoftherapeuticpro

6、teinswithPEG,canprolongtheplasmaserumhalf-lifeofproteinsbyincreasingtheirhydrodynamicvolumeandhencedecreasingtheirrenalclearance.SothepreparationofPEGmodifiedrhG-CSFiscontritudedinthisarticletoprolongtheshorthalf-lifeofrhG-CSFwithoutloweringitsbiologicactivity.rhG-CSFformsa

7、sinclusionbodyduringexpressinginE.coli.Thetypicalstrategyusedtorecoveranactiveproteinfrominclusionbodiesusuallyinvolvesisolation,washing,solubilizationandfinallyrefolding.Therefoldingprocessshouldbeconsideredtobethekeyparttopromoterecoveryofthebioactiveprotein.Toimprovethee

8、fficiencyofrefolding,weoptimizedthepH,time,temperatureandtheformulaofrefoldingsolu