实时荧光定量PCR技术原理

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1、实时荧光定量PCR技术原理王秋泉FieldApplicationScientistTel:8008208982/4008208982什么是实时荧光定量PCR?•一种实时监控核酸扩增的技术在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化对PCR过程进行实时监控，以此实现对初始模板的定量分析。2LifeTechnologies定量PCR如何工作??•PCR反应液加入了各种类型的荧光标记物一个PCR循环3LifeTechnologies定量PCR如何工作??•在扩增过程中,荧光信号随着PCR产物的增加而增强PCRPCRPCR产物

2、大量PCR产产产物物物4LifeTechnologies定量PCR如何工作??•无论是哪个型号,所有的定量PCR仪器都有三个共同的组成部分2.光源3.检测器1.热循环模块5LifeTechnologies定量PCR如何工作??•每个循环结束后,定量PCR仪器通过光学系统记录荧光信号的增加循循循环环环1滤滤滤光片A样样样品品品1Level:6LifeTechnologies定量PCR如何工作??•最后,定量PCR软件计算出数据，用于实验结果的分析7LifeTechnologies定量PCR的化学原理8LifeTechnolog

3、ies两种化学方法TaqMan探针法染料法9LifeTechnologiesTaqMan探针法•TaqMan水解探针：5′端荧光报告基团与靶基因特异性结合的序列3′端荧光淬灭基团报告基团淬灭基团10LifeTechnologiesTaqMan水解探针作用机理•完整的探针：•切断的探针：检测不到报告荧光检测到报告荧光激发光激发光能量荧光共振能量转移，FRET11LifeTechnologies变性(95(95ºC)ºC)12LifeTechnologies退火(60(60ºC)ºC)13LifeTechnologies14Li

4、feTechnologies15LifeTechnologies16LifeTechnologies17LifeTechnologies18LifeTechnologies?19LifeTechnologiesTaqisspecial...
5′-3′外切酶活性
水解探针，，使报告基团和淬，使报告基团和淬灭基团分离20LifeTechnologies21LifeTechnologies22LifeTechnologies23LifeTechnologies24LifeTechnologies25LifeTechnologie

5、s26LifeTechnologies27LifeTechnologies28LifeTechnologies29LifeTechnologies30LifeTechnologies31LifeTechnologies32LifeTechnologies33LifeTechnologies34LifeTechnologies35LifeTechnologies36LifeTechnologies37LifeTechnologies38LifeTechnologies39LifeTechnologiesBurp!40LifeT

6、echnologies实时记录每个循环后荧光信号的变化荧光循环数41LifeTechnologies荧光标记组合报告荧光:6-FAM、JOE、VIC、NED、CY3、TexasRed、CY5淬灭荧光:MGB-NFQ、TAMRA、BHQ参比荧光:ROX常用的荧光组合：FAM目的基因1VIC目的基因2/内对照NED目的基因3ROX参比荧光42LifeTechnologies荧光染料组合•7300实时荧光定量PCR系统ChannelDyeExamplesExcitationWaveLenthghEmissionWaveLenthg

7、h®1FAM™,SYBR~520nm®2VIC,JOE™~550nm455~485nm3NED™，TAMRA™~580nm4ROX™~620nm•7500实时荧光定量PCR系统ChannelDyeExamplesExcitationWaveLenthghEmissionWaveLenthgh1FAM™,SYBR®455~485nm~5202VIC®,JOE™510~530nm~5503NED™,Cy3，TAMRA™540~550nm~5804ROX™,TexasRed®570~590nm~6105CY5Dye™630~650

8、nm~65043LifeTechnologies荧光染料组合•StepOne™实时荧光定量PCR系统ChannelDyeExamplesExcitationWaveLenthghEmissionWaveLenthgh1FAM™,SYBR®455~485nm~5202VIC®,JOE™510