vegfvegfr在洛克沙胂促内皮细胞生长中的调节作用

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1、VEGF／VEGFR在洛克沙胂促内皮细胞生长中的调节作用TheVEGF／VEGFRMechanisminAngiogenesisPromotionofRoxarsoneonRatEndothelialCells研究生：辛文芳专业：基础兽医学导师：张雨梅教授扬州大学兽医学院2014年6月摘要中文摘要㈣一洛克沙胂(Rox)是在世界范围内广泛使用的一种含砷饲料添加剂，对促进养殖业的发展起了很大作用。Rox促进动物生长的机制至今并不完全清楚，可能与增强细胞生长、免疫及能量代谢相关基因的表达有关，也可能与促进

2、血管生长、增加血管通透性有关。目前国内外对这方面的研究甚少。本实验室在体内体外对Rox促血管作用进行了相关研究，在此基础上，本文通过阻断VEGF及其受体KDR／FLT-1，经MTT法、细胞免疫荧光、Elisa法、Westernblot、实时荧光定量PCR，研究Rox促内皮细胞生长作用中VEGF／VEGFR的作用，增加对Rox促血管生成作用VEGF机制的认识，为Rox作为畜禽饲料添加剂使用的安全性评价，以及为有机胂残留潜在的促(致)癌风险评估提供理论依据。大鼠内皮细胞经不同处理12、24、36、48h

3、后，MTT法检测细胞活力：Elisa法测定细胞培养液中的VEGF水平；细胞免疫荧光、Westernblot及定量PCR检测细胞中VEGF、VEGFR(KDR／FLT-1)的表达。不同处理剂量组共11组，分别为PBS阴性对照组(阴)、10ng／mLVEGF阳性对照组(阳)、RoxO．1州、1．0laM、10．0yM、100．0“M、10ng／mLAntiFLT-1、AntiKDR、AntiVEGF、Rox1．00／aM+10ng／mLAntiKDR(Roxl+AntiKDR)、Rox1．00gM+10

4、ng／mLAntiFLT-1(Rox1+AntiFLT-1)。MTT法检测细胞活力的结果表明，Rox0．1～100．00M、阳性对照组细胞活力显著高于PBS(尸<0．05)，1．00M组OD值最高；AntiKDR和AntiVEGF组细胞活力显著低于阴性对照组(P<0．05)，AntiFLT-1与阴性对照组无显著差异tP>0．05)；Rox1肛M+AntiKDR组显著低于1．0山组(P<0．05)，显著高于AntiKDR组；RoxlI．tM+AntiFLT-1组显著高于AntiFLT-1组俨<0．05

5、)，与Rox1．0gM组无显著差异(JP>O．05)。结果表明VEGF、KDR在Rox促内皮细胞生长作用中具有调节作用。细胞免疫荧光分析可以观察至tjRox处理的内皮细胞'

6、_1VEGF、KDR、FLT-1均有表达。Elisa检测细胞培养上清中VEGF的含量，结果显示Rox各剂量组均显著高于阴性对照组、且1．0uMRox组分泌量最高；阻断剂组：AntiKDR组显著高于阴性对照组俨<0．05)，AntiVEGF组显著低于阴性对照组俨<0．05)，而AntiFLT-1组无明显影响；l+阻断剂组：Rox1

7、+AntiKDR组显著高于1．0州Rox组和AntiKDR组俨0．05)。表明RoxN激内皮细胞分泌VEGF，阻断KDR后培养液中的VEGF显著升高，而阻断FLT-1则无明显作用。Westernblot检测内皮细胞中VEGF、KDR、FLT-1的蛋白表达，结果表明：Pox各剂量组的蛋白表达摘要11均高于阴性对照组，且1．0laMRox组表达水平最高；加入VEGF、KDR

8、抗体阻断后VEGF、KDR的表达相应减少，与阴性对照组有显著性差异，而加入FLT-1阻断剂后FLT-l的表达水平与阴性对照组无显著性差异俨>0．05)：Roxl+AntiKDR组显著高于AntiKDR组，显著低于1．0¨MRox组，而Rox1+AntiFLT-1组显著高于AntiFLT-1组，与1．0州Rox组无显著性差异。荧光定量PCR从基因水平上检钡JJRox各个剂量组及加入阻断剂后VEGF、KDR和FL工l的mRNA表达水平。结果表明：Rox各剂量组的VEGF、KDR的mRNA表达均高于阴性对

9、照组，且1．0／aMRox组表达水甲最高；加入VEGF、KDR阻断剂后VEGF、KDR的mRNA表达相应减小：Rox1+AntiKDR组显著高于AntiKDR组，显著低于1．0“MRox组，而Rox1+AntiFLT-1组显著高于AntiFLT-l组，与1．0laMRox组无显著性差异。综上所述，0．1～100．0ⅡMRox对内皮细胞具有明显的促生长作用，1．0IxMRox作用最强，VEGF／KDR在Rox促内皮细胞生长中起重要调节作用。关键词：洛克沙胂；内皮细胞；V