与水稻黑条矮缩病毒p6互作的水稻寄主因子及与南方水稻黑条矮缩病毒cp互作的白背飞虱介体因子筛选

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洳专：j、唼万方数据硕士学位论文⑧与水稻黑条矮缩病毒P6互作的水稻寄主因子及与南方水稻黑条矮缩病毒CP互作的白背飞虱介体因子筛选ScreeningofricehostfactorsinteractingwiththeP6ofRiceblack-streakeddwarfvirusandwhite．backedplanthoppervectorfactorsinteractingwiththeCPofSouthernriceblack-streakeddwarfvirus提交日期尘Q!垒生!目 万方数据论文提交日期与水稻黑条矮缩病毒P6互作的水稻寄主因子及与南方水稻黑条矮缩病毒CP互作的白背飞虱介体因子筛选⑧论文作者签名：指导教师签名：论文评阅人1：篮恒丕评阅人2：奎垂盘评阅人3：毯亚姐答辩委员会主席：施曼硷委员l：周重壬委员2：丢建搓委员3：谢抱答辩日期： 万方数据ScreeningofricehostfactorsinteractingwiththeP6ofRiceblack-streakeddwarfvirusandwhite—backedplanthoppervectorfactorsinteractingwiththeCPofSouthernriceblack-streakeddwarfvirus⑧Author’Ssignature：Supervisor’Ssignature：ExternalReviewers：H曼坠g坠丝圣b曼坠g圣h星坠gh皇Li至萄坠垒堕Qi塑ExaminingCommitteeChairperson：垒堕l坐!i坠g曼hiExaminingCommitteeMembers：K堕星Pi坠g圣hQ坠』i型达i垫g燮堕Y-anXjeDateoforaldefence：2014．03．09 万方数据浙江大学研究生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝’江盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：乡嚣破签字日期：州忤弓月谚日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解澎'江盘堂有权保留并向国家有关部门或机构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝婆盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者张谚威签字日期：砷年弓月谚日谬导师签名：五夏群J签字日期：刚叩年乡月z孑陷 万方数据浙江大学硕士学业论文致谢时光荏苒，转眼两年半的时间就已过去，自己的硕士生涯也将结束。在实验室的这段美好时光，我成长和收获了很多，借此论文完成之际向那些关心支持我的人献上最衷心的感谢!首先要感谢周雪平教授和我的导师吴建祥教授。从论文的选题到论文的结束都离不开两位导师无微不至的关怀和指导。两位导师严谨的治学态度，精深的学术造诣，把握学科前沿的敏锐洞察力，脚踏实地的工作作风，全身心投入科研事业的奉献精神以及豁达宽容的品格，这些都深深的影响着我，是学生今后努力学习的方向。由于学生能力欠佳，实验进展一直很慢，实在愧对导师的栽培和期望。恩师非但没有责备学生，而且总是细心的点拨和鼓励，令学生不甚感激。导师不但授予我理论知识，还教导学生做人，这些将使学生终身受益。再次向思师表达我最真挚的谢意!其次，感谢病毒实验室的所有成员。感谢李正和老师、谢艳老师和钱亚娟老师在实验室管理中所做的工作以及在生活中给予的支持和关心。特别感谢徐毅师兄在实验技术、实验设计和论文撰写过程给予的帮助和建议，真心感谢徐毅师兄两年半来兄长般的关照!感谢孔令芳师姐、侯虎威师兄、包敏师兄、刘欢师姐和倪越群师姐在我刚来实验室时手把手的教我做实验，帮助我更快地融入实验室的集体中。感谢陈莎、王强、顾周杭、李方方、吴礼奇、傅帅、钱莎莎和卢丽娜等众多师兄弟姐妹们在工作和生活上给予的帮助和温暖。衷心祝愿实验室在大家的努力下不断取得新的突破，再创新的辉煌。最后我要特别感谢我的家人。为了我的学业，你们默默的付出了太多太多，是你们的支持和鼓励让我不断前进。在此，我还要特别感谢我的女友胡孜进，谢谢你对我的鼓励和支持。在这两年半的时间里，我有过欢笑也有过迷茫，在涩涩的青春中不断收获和成长。生命之路还很漫长，我将带着自信和感恩的心继续生活，开启人生新的旅程。王震成2014年1月浙江大学紫金港校区启真湖畔 万方数据浙江大学硕士学业论文摘要水稻病毒是水稻生产上一类重要的病原物，在我国水稻种植地区广泛流行，给水稻生产造成了巨大的经济损失。为了解析病毒与寄主和介体的互作机理，本论文利用水稻黑条矮缩病毒(Riceblack．streakeddwarfvirus，RBSDV)的沉默抑制子蛋白P6和南方水稻黑条矮缩病毒(Southernriceblack．streakeddwarfvirus，SRBSDV)的外壳蛋白(coatprotein，CP)为诱饵分别筛选水稻和白背飞虱的cDNA文库，获得与RBSDVP6互作的水稻寄主因子和与SRBSDVCP互作的白背飞虱介体因子。1与RBSDVP6互作的水稻寄主因子筛选构建了pGBKT7．P6(RBSDV)酵母双杂交诱饵质粒，并确定P6在酵母细胞中没有毒性和自激活活性。然后将诱饵质粒与水稻叶片cDNA文库质粒共转化酵母菌株AHl09，经过三缺(SD／．His／．Leu／．唧)和四缺(SD／．HisALeuATrp／．Ade)培养基的筛选，最终获得8个在酵母中与RBSDVP6互作的寄主因子片段。这8个寄主因子分别为：一个具有PHD保守结构域的蛋白、乙醛脱氢酶(aldehydedehydrogenase)、COP9信号转导复合体5b亚基蛋白(COP9signalosomecomplexsubunit5b)、一个未知功能蛋白(以下简称P6．100)、含有类似于葡萄球菌核酸酶(Staphylococcalnucleasehomologues，SNase)保守结构域的蛋白、ATP合成酶6链(putativeATPsynthasedeltachain)、泛素结合催化酶E2(Ubiquitin—conjugatingenzymeE2，catalytic)和己四醇醛酸脱羧酶(UDP．glucuronicaciddecarboxylase)。克隆了水稻P6-100蛋白的编码基因全长，并利用酵母双杂交系统和双分子荧光互补实验验证P6．100蛋白与RBSDVP6的互作。这些初步工作为进一步深入了解该病毒与水稻寄主问的作用机理打下基础。2与SRBSDVCP互作的白背飞虱介体因子的筛选构建了pGBKT7．CP(SRBSDV)酵母双杂交诱饵质粒，并确定SRBSDVCP在酵母细胞中没有毒性和自激活活性。然后将诱饵质粒与白背飞虱cDNA文库质粒共转化酵母菌株AHl09，经过三缺(SD／．His／．Leu／-Trp)和四缺(SD／-His／．Leu／．TrpAAde)培养基的筛选，共获得6个在酵母中与SRBSDVCP互作的蛋白片段。这6个蛋白片段分别是：肌动蛋白(actin)、磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate 万方数据浙江大学硕士学业论文摘要dehydrogenase，GAPDH3)、HIPV(HimetobiPvirus)的外壳蛋白、线粒体蛋白、GMP合成酶(GMPsynthase)以及TCP1伽玛亚基(TCP1subunitgamma)。这些与病毒互作的介体因子片段的获得为深入了解该病毒与昆虫介体问的作用机理以及南方水稻黑条矮缩病的防控具有重要意义。关键词：水稻黑条矮缩病毒；南方水稻黑条矮缩病毒；酵母双杂交实验；RBSDVP6；SRBSDVCP；水稻寄主因子；白背飞虱；介体因子；蛋白互作III 万方数据浙江大学硕士学业论文AbstractRiceviruses，oneofthemostdestructivepathogensinriceproduction，areprevalentinricegrowingareasinChinaandcausegreateconomiclossesinriceproduction．Toelucidatethemechanismofinteractionbetweenvirusandhostandvector,thesilencingsuppressorproteinP6ofRiceblack-streakeddwarfvirus(RBSDV)andthecoatprotein(CP)ofSouthernriceblack-streakeddwarfvirus(SRBSDV)wererespectivelyusedaLsbaitstoscreenthecDNAlibrariesofriceandwhite-backedplanthopper,andsomericehostandwhite-backedplanthoppervectorinteractionfactorswereobtainedinthisstudy．1ScreeningofricehostfactorsinteractingwithRBSDVP6TherecombinationplasmidpGBKT7-P6(RBSDV)usedasabaitforyeasttwo-hybrideassaywasconstructed，andconfirmedthatRBSDVP6hadnotoxicityandnoself-activatedactivityinyeast．ThentheplasmidpGBKT7-P6andriceeDNAlibraryplasmidwereco-transformedintoyeaststrainAH109．AfterscreenedontheSD／-His／-Leu／-TrpandSD／一His／-Leu／一Trp／-Ademediums．eightdifferentriceproteinsegmentsinteractingwiththeRBSDVP6inyeastwereobtained．ThesecandidateswerelistedasaproteincontainingthePHD—typedomain，aldehydedehydrogenase，COP9signalosomecomplexsubunit5b，anunknownfunctionprotein(namedasP6-100)，aproteincontainingtheconservedSNase(Staphylococcalnuclease)domain，putativeATPsynthasedeltachain，Ubiquitin—conjugatingenzymeE2(catalytic)andUDP-glucuronicaciddecarboxylase．Thefull-lengthgeneofP6-100fromricewasclonedandtheinteractionbetweenP6—100proteinandRBSDVP6wasfurtherconfirmedbyyeasttwo-hybridassayandbimolecularfluorescencecomplementationexperiment．ThesepreliminaryworkslayafoundationforfurtherunderstandingthemechanismofinteractionbetweenRBSDVandricehost2ScreeningofvectorfactorsinteractingwithSRBSDVCPTherecombinationplasmidpGBKT7-CP(SRBSDV)usedasabaitforyeasttwo-hybridassaywasconstructed，andconfirmedthatSRBSDVCPhadnotoxicityandIV 万方数据浙江大学硕士学业论文Abstractnoself-activatedactivityinyeast．ThentheplasmidpGBKT7-CPandwhite-backedplanthoppercDNAlibraryplasmidwereco-transformedintoyeaststrainAH109．AfterscreenedontheSD／-His／-Leu／·TrpandSD／-His／-Leu／-Trp／-Ademediums，sixdifferentproteinsegmentsinteractingwiththeSRBSDVCPwereobtained．Thesecandidateswerelistedasactin，glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase(GAPDH3)，thecoatprotein2(CP2)ofHimetobiPvirus(HIPV)，amitochondrialprotein，GMPsynthaseandTCPIsubunitgamma．TheabovepreliminaryresultswillhelpUStofurtherunderstandthemechanismofvirus．vectorinteractionandcontroISouthernriceblack．streakeddwarfvirusdisease．Keywords：Riceblack-streakeddwarfvirus；Southernriceblack-streakeddwarfvirus；yeasttwo-hybridassay；RBSDVP6；SRBSDVCP；ricehostfactor；white-backedplanthopper；insect-vectorfactor；protein·proteininteractionV 万方数据淅江大学硕士学业论文目录致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯I摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。IIAbstract⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．．．．⋯．．．．．．⋯．．．．．．．．．⋯．⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯．⋯．．．．．．．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯IV目录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯vI1文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一11．1水稻病毒概述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．1．1水稻黑条矮缩病毒⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．1．2南方水稻黑条矮缩病毒⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯41．2植物RNA病毒的昆虫介体传播机制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯81．2．1非持久型昆虫介体传播机制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯81．2．2持久循回型昆虫介体传播机制研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯81．3植物病毒沉默抑制子蛋白与寄主因子互作的研究现状⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．101．4酵母双杂交系统⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1l1．4．1酵母双杂交技术的原理及应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1l1．4．2酵母双杂交技术的优点和局限性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一121．4．3酵母双杂交技术在植物病毒学中应用的意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一122与水稻黑条矮缩病毒P6互作的水稻寄主因子的筛选⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一132．1材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．132．1．1植物材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．132．1．2菌株、质粒和cDNA文库⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．132．1．3主要生化试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．132．1．4水稻黑条矮缩病毒P6诱饵质粒的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯132．1．5诱饵蛋白在酵母中表达检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．192．1．6酵母双杂交实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一202．1．7RBSDVP6蛋白互作因子筛选⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2l2．1．8酵母质粒的提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯22VI 万方数据浙江大学硕士学业论文目录2．1．9候选的寄主因子的分离、测序并比对，确定蛋白类型⋯⋯⋯⋯⋯一232．1．10候选的寄主因子基因全长克隆及其酵母双杂交载体的构建⋯⋯⋯232．1．11水稻P6．100同源序列比对⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．242．1．12将构建好的含全长基因重组质粒转化酵母菌株AHl09进行互作验证⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．：142．1．13BiFC验证P6蛋白与P6．100在植物体内的互作⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯252．2结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．272．2．1诱饵质粒的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．272．2．2诱饵蛋白对酵母毒性及自激活活性的检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．272．2．3与P6蛋白互作的寄主因子筛选⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯282．2．4水稻P6-100基因全长克隆及酵母双杂交载体的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯3l2．2．5水稻P6．100蛋白与其他植物同源蛋白的相似性比较⋯⋯⋯⋯⋯⋯3l2．2．6利用酵母双杂交验证P6—100与RBSDVP6的互作⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯322．2．7利用BIFC验证P6．100与RBSDVP6的互作⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．332．3讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．363与SRBSDVCP互作的白背飞虱介体因子筛选⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯383．1材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．383．1．1实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．383．1．2菌株、质粒和cDNA文库⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．383．1．3主要生化试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。383．1．4南方水稻黑条矮缩病毒CP诱饵质粒的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯383．1．5诱饵蛋白在酵母中的表达检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。423．1．6酵母双杂交实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．433．1．7与SRBSDVCP蛋白互作的介体因子筛选⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。443．1．8酵母质粒的提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一443．1．9候选的介体因子的分离、测序并比对，确定蛋白类型⋯⋯⋯⋯⋯。443．2结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．443．2．1pGBKT7一CP诱饵载体的构建验证⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．44VTT 万方数据浙江大学硕士学业论文目录3．2．2诱饵蛋白对酵母毒性及自激活活性的检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一453．2．3诱饵蛋白在酵母中的表达检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一453．2．4与CP蛋白互作的介体寄主因子筛选⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯463．3讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．48参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯50附录A本论文中所用术语缩写词中英文对照⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一57附录B本论文所用病毒名缩写及其中英文对照⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．59附录C常用缓冲液和培养基配方⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一60VIll 万方数据浙江大学硕士学业论文文献综述1文献综述1．1水稻病毒概述水稻是我国最重要的粮食作物之一，种植面积约占粮食作物总面积的三成，产量接近粮食总产量的一半。20世纪60年代以来，水稻病毒病在我国呈间歇性爆发流行发生，导致水稻产量减少、品质下降，病害爆发流行年份损失可达10％．30％，严重威胁着我国农业生产和粮食安全。在我国水稻生产过程中，危害水稻的病毒主要有：水稻黑条矮缩病毒(Riceblack—streakeddwarfvirus，RBSDV)、南方水稻黑条矮缩病毒(Southernriceblack—streakeddwarfvirus，SRBSDV)、水稻条纹叶枯病毒(Ricestripevirus，RSV)、水稻矮缩病毒(Ricedwarfvirus，RDV)re水稻锯齿叶矮缩病毒(Riceraggedstuntvirus，RRSV)等。下文将对RBSDV与SRBSDV这两种病毒进行详细综述。1．1．1水稻黑条矮缩病毒1．1．1．1RBSDV的分布与危害RBSDV于1941年在日本有一次爆发，之后于20世纪60年代在中国、日本、韩国、朝鲜均成为流行病害(Leeeta1．，2005)，此后30年间一度销声匿迹。20世纪90年代后期水稻黑条矮缩病在江浙沪以及安徽和福建北部在内的长江中下游稻区爆发流行，造成巨大的经济损失(Wangeta1．，2009)。自然条件下，RBSDV的寄主植物有水稻、玉米、大麦、小麦和稗草等禾本科植物。RBSDV侵染的水稻植株典型症状为植株矮缩，叶色浓绿，叶片短缩、僵直，叶脉和茎秆上有蜡状隆起，后变为黑色条状隆起，穗小或不抽穗以及结实不良。植株在不同的发育期染病症状略有差异(杨本荣等，1983)。秧苗期发病，叶片僵硬直立，叶色墨绿，根系短而少，生长发育停滞。分蘖期发病，植株明显矮缩，部分植株早枯死亡。拔节期发病，植株高位分蘖、茎节倒生有不定根，茎秆基部表面有纵向瘤状乳白色凸起。1．1．1．2RBSDV生物学特征RBSDV是呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus)的第二组成员。完整的RBSDV病毒粒子为二十面体对称结构，外观呈球形，直径约75nm，具有双 万方数据浙江大学硕士学业论文文献综述层衣壳，外层衣壳表面有12个直径为11nm的A．突起，核心粒子直径大约为50nm，内层衣壳表面有12个长约8nm、宽约12nm的B．突起(Hattaeta1．，1977)。RBSDV侵染寄主植物后，主要存在于韧皮部组织中，但RBSDV在传播介体中的分布无组织特异性。感染RBSDV的细胞内形成内含大量病毒粒体的无包膜的病毒基质(Viroplasm)结构，可能是病毒复制和组装的场所(Redolfieta1．，1973；HaRaeta1．，1977；VanRegenmorteleta1．，2000)。1．1．1．3RBSDV基因组结构和编码的蛋白RBSDV的基因组为10条双链RNA(DoublestrandRNA，dsRNA)基因片段，依据分子量从大到小依次命名为s1．slo，其基因组全序列已被测定。序列结果分析显示：RBSDV的10条基因组dsRNA片段末端序列完全保守，均为5’一AAGTTTTTT⋯⋯CAGCTA(G)T(C／A)T(C)GTC．3’；紧临末端保守序列均存在一个7-11bp的反向重复序列，但各基因组片段的该序列各不相同(Azuhataeta1．，1992；Zhangeta1．，2001；Wangeta1．，2003oRBSDV的全基因组约为30kb，至少包含13个开放式阅读框(OpenReadingFrame，ORF)。RBSDV的基因片段编码蛋白有两种不同的方式：s5、s7和s9为双顺反子(Yangeta1．，2013；Isogaieta1．，1998；Sooeta1．，1998)编码模式，能编码两种蛋白；其余7个基因片段都为单顺反子，只编码一个蛋白。RBSDV的基因组片段s5全长3164bp，包含2个部分重叠的ORF，分别编码蛋白P5．1和P5．2(Yangeta1．，2013)。RBSDV的这种特殊编码方式在斐济病毒属第二组成员MaldeRioCuanovirus(MRCVXDistefanoeta1．，2005)和SRBSDV(Wangeta1．，2010)中也有报道，但在同属病毒Fijidiseasevirus(FDV)(McQualtereta1．，2004)和Nilaparvatalugensreovirus(NLRV)(Nakashimaeta1．，1996)中却耒被发现。羊健(2007a)年利用Westernblot实验发现RBSDV浙江分离物P5．1是一种结构蛋白，P5．2是一种非结构蛋白。方守国等(2007)发现RBSDVs6编码的P6蛋白是一种非结构蛋白。张凌娣等(2005)证实P6是一个RNA沉默抑制子，能够强烈抑制转GFP本氏烟(16C)中由同源序列引起的基因沉默，在沉默的传播和维持过程起作用，但在沉默的起始阶段不起作用。Wang等(2011)通过酵母双杂交和双分子荧光互补试验发现P6能够 万方数据浙江大学硕士学业论文文献综述自身互作；免疫荧光实验发现，P6在洋葱表皮细胞和本氏烟细胞中能聚集成点状的类病毒基质结构(viroplasm．1ikestructure，VLS)。Sun等(2013a)发现P6能与P5．1互作并定位到病毒基质上；同时P6．1还能与P9．1互作，免疫电镜实验发现P6和P9一l共定位在高电子密度的包含体中，这些结果表明P6蛋白是病毒基质的重要组分。s7编码的P7．1和P7．2蛋白是该病毒的非结构蛋白(Isogaieta1．，1998；钟永旺，2003；吕明芳等，2012)。孙宗涛等(2013)通过亚细胞定位实验发现P7—1利用内质网到高尔基体的分泌途径(ER-to．Golgisecretorypathway)和肌动球蛋白的运动系统(actomyosinmotilitysystem)定位在胞间连丝。Sun等(2013b)发现在拟南芥中过量表达RBSDV的P7．1蛋白，相应的转基因植株因花药不能开裂释放花粉而导致雄性不育，而且花药中木质素含量显著降低，这一结果暗示P7．1很可能是RBSDV的致病因子，在病毒的侵染过程起重要作用。s8编码蛋白P8，大小为68．1KD，羊健等(2007b)通过Westernblot实验发现P8是RBSDV的核心结构蛋白。Liu等(2008a)发现P8蛋白通过其N端的l一40位氨基酸定位在昆虫细胞和植物细胞的细胞核上，而且在烟草的BY-2悬浮细胞中具有高效的转录抑制活性；Liu等还发现P8蛋白在昆虫细胞中及细胞外均能形成同源二聚体．s9基因组全长约1900nt，包含两个非重叠的ORF(s9．1和s9．2)，分别编码蛋白P9．1和P9．2。Isogai等(1998)认为P9．1可能在病毒基质形成和病毒形态发生过程起重要作用。Zhang等(2008)研究发现P9．1是热稳定的仅螺旋蛋白，在细胞内外能通过自身互作形成二聚体。Fusamichi等发现P9．1能够形成八聚体结构，与病毒基质的形成和病毒形态维持相关。S10编码的P10蛋白是RBSDV的外层外壳蛋白，Liu等(2008b)利用酵母双杂交和far-Westernblot实验发现P10能够自身互作，并且能体外形成三聚体。RBSDV其余基因组片段编码的蛋白功能研究相对较少。sl编码的P1蛋白推测为病毒的依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)；S2编码的P2蛋白推测为病毒的主要核心结构蛋白；s3编码的P3蛋白推测为病毒的核心结构蛋白；s4编码的P4蛋白推测为B．刺突蛋白(B．spikeprotein)。RBSDV基因组及其功能总结如表1．1。 万方数据浙江大学硕士学业论文文献综述表1．1RBSDV基因组及功能Table1．1ThegenomeorganizationanditsfunctionofRBSDV1．1．1．4RBSDV的昆虫传播介体RBSDV主要传播介体为灰飞虱(Laodelphgaxstriatellus)。灰飞虱在我国分布区域为：南起海南岛，北至黑龙江，东达东部沿海各省，西至新疆。该害虫以刺吸式口器吸食植物汁液的方式危害水稻、玉米、大麦和稗草等禾本科植物。灰飞虱耐低温但对高温适应性差，适宜的生长温度为28℃左右。成虫喜欢在嫩绿、高大茂密的植株上产卵，单头雌虫产卵量一般数十粒，但越冬代产卵量可达500粒左右。灰飞虱以持久性不经卵传播方式传毒，一经获毒能终身传毒。RBSDV可在灰飞虱体内复制增殖，但介体昆虫不表现明显症状。无毒虫子获毒效率以2．3龄期最高，获毒时间最短为1h，一般1．2天可充分获毒。周彤等(2011)发现在25℃恒温条件下病毒在介体内的循回期为12．15天。灰飞虱的传毒时间最短为2h，最长约为48h。1．1．2南方水稻黑条矮缩病毒1．1．2．1SRBSDV的分布与危害南方水稻黑条矮缩病毒于2001年在我国广东省阳西县首次发现，在2008年之前该病害只在我国南方局部地区发生(Zhoueta1．，2004，2008；Wangeta1．，2010)。但 万方数据淅Ⅱ大学硕士学业论文文献综述是，在2009年该病害在越南北部19省和我国南方9省爆发流行，危害水稻面积分别达4．2万公顷和30万公顷。在2010年，越南29个省份和我国13个省份的水稻产区遭到该病害的侵染，危害面积分别为6万公顷和130万公顷，给许多稻区造成了严重的经济损失(Zhouetal，2010；Hoangdal，201l；Zhai就al，2011)。各地针对该病害采取了不同的防控措施，然而在2012年该病害在中国和越南两国稻区遣成的危害仍超过了50万公顷。近年来，在日本的部分地区也发现了南方水稻黑条矮缩病的危害(Matsttkuractal．2013)。自然条件下，SRBSDV的寄主主要是禾本科植物，如水稻、玉米、小麦和看麦娘等。水稻的整个生育期对SRBSDV都十分敏感，感染SRBSDV的水稻症状和感染RBSDV的水稻症状十分类似，典型的症状为：植株矮化，叶色深绿，茎节的倒生颏根，叶脉或茎秆上初为蜡白色后为黑褐色的瘤状突起，发育不良的棕色根。SRBSDV侵染水稻引发的症状和产量损失因侵染时期不同而不同。在苗期感病时，植株矮小，叶片僵直，发病严重的秧苗可能枯萎而死。在分蘖早期感病时，植株明显矮缩，分蘖增多，不抽穗。在拔节期感病时，叶片短小僵直，叶色深绿，叶脉有小的突起形成，结实率低。在孕穗期感病时植株没有明显的症状。醪图1I己报道的南方黑条矮缩病毒在我国的分布Figurel．1ThedistrlbutionofSRBSDVinChina 万方数据浙江大学硕士学业论文文献综述1．1．2．2SRBSDV生物学特征SRBSDV是呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus)的成员(Zhoueta1．，2008；Wangeta1．，2010)。SRBSDV与RBSDV的粒子结构十分相似，完整的SRBSDV病毒粒子呈二十面体对称结构，直径为70一75rim；具有双层衣壳结构，外层衣壳表面有12个直径为11nnq的A．突起，核心粒子直径大约为50nn'l，内层衣壳表面有12个长约8nlll、宽约1211111的B．突起。SRBSDV病毒粒子主要存在于感病植物的韧皮部组织，在植物细胞中聚集形成晶格状结构。1．1．2．3SRBSDV基因组结构和编码的蛋白SRBSDV的基因组包含lo条线性的双链RNA(dsRNA)片段，基因组片段大小从1．8kb到4．5kb不等，依据分子量从大到小依次命名为S1一$10．SRBSDV海南分离物和广东分离物的基因组全序列已被测定。SRBSDV基因序列与RBSDV具有很高的同源性。张恒木等(2008)研究发现SRBSDV的每条dsRNA片段的末端都含有5"-AAGTTTTT⋯⋯CAGCTGATGTC一3、保守序列，紧邻末端保守序列还有一个6-9bp的反向重复序列。SRBSDV的10条基因组片段全长为29124nt，包含13个OR．F：其中S5、s7和S9为双顺反子，分别编码两个蛋白；其余的基因片段都为单顺反子，只编码一个蛋白。s5编码蛋白P5．1和P5．2，Mao等(2013)认为P5蛋白在没有病毒侵染的昆虫介体细胞中能形成丝状的内含体。卢嫣红等(2009)研究发现S6编码蛋白P6是个RNA沉默抑制子，在沉默的起始和信号传导阶段起作用。有实验报道P6蛋白能与P5一l蛋白互作，并且能够共定位到病毒基质中，这意味着P5一l和P6蛋白在病毒基质的形成过程起重要作用(Lieta1．，2013a；Maoeta1．，2013)。S7．1编码蛋白质P7．1，刘瑛等(2011)发现P7．1蛋白能够自身互作，在昆虫sf9细胞中诱导产生管结构，可能与病毒在介体细胞间运动相关。S9—1编码蛋白P9—1，Jia等(2012)在非介体昆虫细胞中表达P9—1能诱导形成类似病毒基质的结构，对病毒在介体细胞中的复制起重要作用。Mao等(2013)研究发现：P9—1通过与P6互作将P6“俘获”到由P9—1形成的点状内含体(granularinclusions)中，据此推测P5、P6和P9．1在丝状内含体和点状内含体的诱导形成及成熟过程是不可缺的。 万方数据浙江大学硕士学业论文文献综述s1一s4和$10编码的蛋白分别为依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)、主要核心结构蛋白、加帽酶(cappingenzyme)、B-刺突蛋白(B-spikeprotein)和外层外壳蛋白。这几个蛋白的功能研究相对较少。现将SRBSDV基因组及其功能总结如表1．2。表1．2SRBSDV基因组及功能Table1．2ThegenomeorganizationanditsfunctionofSRBSDV1．1．2．4SRBSDV的昆虫传播介体SRBSDV主要由白背飞虱(Sogatellafurcifei'a)传播。白背飞虱在东南亚各国均有分布，在我国分布南起海南岛北至黑龙江稻区。该害虫的成虫有长短翅之分，成虫喜欢在嫩绿茂密的稻田中产卵，单头长翅雌虫可产卵300—400粒，短翅雌虫产卵量相对更多。白背飞虱以持久性可循回的方式传播SRBSDV，病毒可以在虫体内复制增殖(Caoeta1．，201l；Pueta1．，2012)。白背飞虱一经获毒可终身带毒，但不能经卵传播。白背飞虱的若虫和成虫均可传毒，若虫获毒相比成虫更容易。白背飞虱若虫和成虫获毒的最短时间分别为5分钟和30分钟，病毒在虫体内的循回期一般为6．14天(Pueta1．，2012)。大部分带毒虫子在传毒前有段间歇期，一般为2-6天。白背飞虱能将水稻上的SRBSDV传播到健康的玉米植株上，但几乎不从被感染的玉米植株上获毒(Zhoueta1．．2010)。 浙江大学硕士学业论文文献综述1．2植物RNA病毒的昆虫介体传播机制在自然界中，约80％的植物病毒需要依赖昆虫介体进行传播(Hohn，2007)。根据昆虫携带病毒时间的长短，可将昆虫对植物病毒的传播分为三类：非持久型传播(nonpersistenttransmission)、半持久型传播(semipersistenttransmission)和持久循回型传播(persistentcirculativetransmission)。昆虫传播的植物病毒每年给全球作物生产造成了数十亿美元的经济损失。要切断昆虫传播，有效控制病毒病的发生，必须了解昆虫的传毒机理。近年来，随着二代测序技术和分子生物学技术的迅猛发展，在分子水平上研究植物病毒与传播介体间互作的报道逐渐增多。下面主要对植物RNA病毒的外壳蛋白(coatprotein，CP)与昆虫介体传播机制研究进行概述：1．2．1非持久型昆虫介体传播机制在非持久型传播中，病毒与昆虫口器或口针接触即可使昆虫带毒，因此介体昆虫的获毒时间极短(Nault，1997)。非持久性传播的病毒仅存在于介体的口针中，介体持毒仅数小时，随着介体携毒时间延长传毒效率急剧下降。目前已经很清楚该类病zkq20160323毒的传播不是因为介体口针被污染，而是受到病毒与昆虫口针间的特异性互作影响。蚜虫是典型的非持久型传播介体，目前对该虫传播的马铃薯Y病毒(Potyviruses)和黄瓜花叶病毒(Cucumoviruses)研究较深。研究发现，许多马铃薯Y病毒属的病毒编码的外壳蛋白N末端一段高度保守的Asp-Ala-GIy(DAG)区域为蚜传所必需。这段保守序列的三个氨基酸中任何一个缺失或者被替换，均能导致蚜虫传播病毒能力下降或完全丧失。Lopez．Moya等(1999)研究发现马铃薯Y病毒属病毒CP蛋白DAG区域附近的序列对蚜虫传毒也具有重要作用。1．2．2持久循回型昆虫介体传播机制研究循回型传播的病毒被昆虫介体摄入后进入肠道，病毒与肠壁上皮细胞相互作用并以一种胞吞的方式穿过细胞膜进入昆虫的体腔(hemocoel)，最终循环运输至唾液腺(salivarygland)。当昆虫再次取食植物时，病毒随着唾液的分泌从植物的伤口侵入。根据病毒能否在昆虫体内复制，持久循回型又可分为非增殖型传播(non-propagativetransmission)-与增殖型传播(propagativetransmission)i丙种。万方数据 浙江大学硕士学业论文文献综述持久循回非增殖型传播(non—propagativetransmission)病毒中，对黄症病毒科(Luteoviridae)病毒介体传播机制研究较深入。该类病毒CP蛋白决定哪种蚜虫能够传播病毒。黄症病毒科病毒包含两个衣壳蛋白，一个主要的cP(majorCP)和一个含量相对较少的CP(minorcP)，后者由主要CP的终止密码子通读产生。vandenHeuvel等(1994)研究发现该类病毒含量少的CP能与蚜虫共生细菌分泌的类似GroEL蛋白互作。在蚜虫传毒前饲喂抗生素杀死其共生细菌，能有效降低蚜虫传播马铃薯卷叶病毒(Potatoleaf-rollvirus，PLRV)的能力(vandenHeuveleta1．，1999)。但这不能解释CP与细菌分泌的共生蛋白互作的特异性，因为该CP也能与非介体昆虫内生细菌分泌的共生蛋白互作(Fitcheneta1．，1995；vandenHeuveleta1．，1997)。Gray等(1999)认为通读产生的CP与蚜虫免疫系统间的互作对介体特异性的影响可能超乎我们的预期。持久循回增殖型传播(propagativet啪smission)的病毒在昆虫体内能够复制增殖，介体一经获毒可以终生带毒。目前，水稻矮缩病毒(RDV)的介体传毒机制研究相对较深入。Yan等(1996)发现用CCl4处理过的提纯的RDV病毒粒子对介体单层zkq20160323细胞培养物侵染率明显降低；通过跑SDS．PAGE胶发现CCl4处理的病毒粒子缺失了基因组片段s2编码的P2蛋白，且该蛋白定位在病毒粒子的外层衣壳；如果在RDV病毒粒子提纯过程使用CCI。，获得的病毒粒子也缺少P2蛋白，丧失了侵染昆虫介体的能力，因而昆虫不能传毒给寄主植物。Omura等(1997)进一步证实RDV的P2蛋白对病毒侵染介体细胞至关重要，而且与昆虫的传毒相关。Omura等(1998)通过免疫电镜实验发现P2蛋白对RDV病毒粒子吸附到昆虫介体细胞表面是必须的。Wei等(2007)发现RDV主要通过受体介导和笼形蛋白介导的胞吞作用进入昆虫介体细胞。Zhou等(2007)证实RDV外层衣壳蛋白P2的诱导膜融合活性对病毒进入昆虫细胞起重要作用。Pu等(2011)将RDV在无性繁殖的水稻上传代培养多年，与此同时与在叶蝉细胞系传代培养6年的RDV进行序列比较，发现RDV的基因组片段s2和SIO中积累了很多无义突变(nonsensemutmions)，不能编码相应的蛋白P2和P10，病毒完全丧失了传播性；如果将突变的RDV在昆虫细胞或昆虫个体中复制后，这些无义突变发生恢复。这一系列的实验结果证实了RDV的外壳蛋白P2确实参与了RDV与昆虫介体的传播。万方数据 浙江大学硕士学业论文文献综述1．3植物病毒沉默抑制子蛋白与寄主因子互作的研究现状植物病毒需要“俘获”寄主因子来帮助自身完成侵染、复制以及在宿主细胞中的运动(Ahlquisteta1．，2003；Whithameta1．，2004)。寄主的防卫反应、组织特异性和显症也都受植物与病毒互作的影响(Whithameta1．，2004)。寄主植物可以通过RNA沉默来抵抗病毒的侵染，而植物病毒则通过编码一个或多个RNA沉默抑制子(viralsuppressorofRNAsilencing，VSR)来抑制植物的基因沉默以逃脱植物的防卫反应。研究病毒沉默抑制子与寄主互作能帮助我们更好的了解病毒侵染和植物防御的分子机制，对病毒病的防控具有重要意义。近年来，随着酵母双杂交实验、GSTpull．down、免疫共沉淀等多种技术的使用，大量与病毒蛋白互作的寄主因子相继被鉴定报道。由于病毒的沉默抑制子在病毒侵染循环过程起着重要作用，病毒沉默抑制子蛋白被广泛用作筛选寄主互作因子的诱饵(Choieta1．，2004)。马铃薯Y病毒属病毒编码的HC．Pro蛋白是最早被鉴定的RNA沉默抑制子之一(Anandalakshmietal．，1998)。Anandalakshmi等(2000)利用酵母双杂交技术发现zkq20160323一个类似钙调蛋白的基因沉默调节子rgs—CaM(regulatorofgenesilencing·calmodulin-likeprotein)能与烟草蚀纹病毒(tobaccoetchvirus，TEV)HC-Pro互作，并首次报道rgs．CaM是植物内源的转录后基因沉默(PTGS)抑制子，作者认为HC．Pro能诱导rgs．CaM表达，进而增强植物自身负向调控基因沉默的活性。Jin等(2007)证明PVY的HC．Pro能与烟草的NtMinD互作，作者推测两者的互作能抑制NtMinD同源二聚体形成(与植物叶绿体分裂相关)，进而干扰PVY侵染的植物细胞中叶绿体的分裂数量。Shen等(2010)研究发现番木瓜环斑病毒(papayaringspotvirus，PRSV)I均HC-Pro蛋白能与番木瓜钙网蛋白(PaCRT)互作；实时定量RT-PCR实验发现在PRSV侵染初期PaCRT的mRNA显著上调，而随着病毒在寄主细胞中的积累PaCRT的mRNA又降至与健康植株相当的表达水平，作者推测两者的互作可能会干扰植物的钙信号通路进而影响病毒的侵染或寄主的防卫反应。Ala．Poikela等(2011)发现马铃薯A病毒(PotatovirusA，PVA)的HC．Pro蛋白能与寄主植物的翻译起始因子elF(iso)4E和elF4E互作，并且在HC．Pro的c端存在一个万方数据 浙江大学硕士学业论文文献综述4E结合保守结构域。有些病毒的CP蛋白同时也具有沉默抑制子功能，如芜菁皱缩病毒(Turnipcrinklevirus，TCV)的CP和番茄黄化曲叶病毒(Tomatoyellowleafcurlvirus，TYLCV)的CP。Choi等(2004)实验发现TCVCP的沉默抑制子活性并不是通过CP与拟南芥的TIP(TCV-interactingprotein)互作引起的。1．4酵母双杂交系统蛋白质与蛋白质的相互作用是很多生命现象的基础。尽管越来越多物种的基因组序列被相继测定，但基因编码的蛋白质功能研究仍然是个难题。酵母双杂交(yeasttwohybrid)技术是一种简便、灵敏和高效的研究蛋白互作的方法。下面将对酵母双杂交系统的原理、应用和优缺点等方面做简要概述。1．4．1酵母双杂交技术的原理及应用酵母双杂交是由Fields等在1989年首次提出建立的。该系统的建立是基于对酵母转录因子GAL4性质的研究。酵母GAL4含有DNA结合域(DNAbindingdomain，DNA．BD)和转录激活结构域(activationdomain，AD)：DNA．BD是N端1．174位氨zkq20160323基酸残基区段，能特异结合位于效应基因上游的激活序列(Upstreamactivatingsequence，UASG)，但不能激活转录；AD是C端768．881位氨基酸区段，能激活UASG下游的基因进行转录，但不能结合到UASG区域。只有当BD和AD通过某种方式在空间上足够接近时才能重新获得转录激活因子的活性，激活UASG下游的启动子，使受调控的报告基因得以表达。在酵母双杂交系统中，将两个待检测互作的蛋白X和Y分别与BD和AD连接构建融合蛋白BD．X和AD．Y。这两个蛋白在同一酵母细胞中表达时，BD和AD因为x和Y互作而在空间上足够接近形成具有活性的转录激活子GAL4，激活下游报告基因的表达，如图1．2所示。图1．2酵母双杂交技术原理图Figure1．2Theprincipleofyeasttwo·hybrid万方数据 浙江大学硕士学业论文文献综述酵母双杂交系统是在模式生物酵母中进行的，能灵敏高效地研究蛋白质之间的互作。该系统主要被应用于以下几方面研究：(1)验证其他方法发现的蛋白质问可能的相互作用；(2)鉴定互作蛋白的关键结构域和氨基酸；(3)筛选cDNA文库寻找与诱饵蛋白相互作用的蛋白质。1．4．2酵母双杂交技术的优点和局限性与传统的检测蛋白互作的方法相比，酵母双杂交系统是在核酸水平操作，省去了纯化蛋白等繁琐的步骤，其优势可以归纳为下几点：(1)真实性：检测是在酵母细胞内进行，一定程度上可以代表细胞内的真实情况；(2)高效性：利用LiAc介导的酵母转化操作简单而且转化效率高，能比较容易地从cDNA文库中直接筛选出与已知蛋白互作的阳性克隆；(3)灵敏度高：融合蛋白在酵母细胞中高水平的表达，可以检测出微弱的互作(4)广泛性：酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库(Melegarieta1．，1998)，能分析不同亚细胞定位及功能的蛋白。酵母双杂交系统尽管被证实是一种有效验证蛋白互作的方法，但也有自身的局zkq20160323限性，具体为：(1)假阳性较高：某些蛋白自身具有激活转录功能，使得BD融合蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录；或某些蛋白自身具有UASG结合功能，使得AD融合蛋白在无DNA结合结构域时能激活转录。(2)并非对所有蛋白适用：由酵母双杂的原理可知，该系统研究的蛋白必须能够进入细胞核，因此不能入核的蛋白质则不适用于此方法。(3)假阴性：某些表达的融合蛋白对酵母有毒使得报告基因表达受抑制甚至完全不表达，或蛋白间互作很弱，致使互作无法被检测而呈现假阴性结果(李先昆等，2009)。1．4．3酵母双杂交技术在植物病毒学中应用的意义随着酵母双杂交技术的不断完善，该技术已经成为研究蛋白质相互作用的强有力的方法之一。将酵母双杂交技术应用到水稻病毒学研究中，将帮助我们更好的了解水稻病毒蛋白间的互作、水稻病毒与昆虫介体间的互作，以及水稻病毒和寄主植物间的互作，更好地解析水稻病毒．昆虫介体．寄主植物三者互作机理，为有效防控水稻病毒病打下坚实的理论基础万方数据 浙江大学硕士学业论文与水稻黑条矮缩病毒P6互作的水稻寄主因子的筛选2与水稻黑条矮缩病毒P6互作的水稻寄主因子的筛选2．1材料与方法2．1．1植物材料实验室保存的感染水稻黑条矮缩病毒的感病叶片、健康水稻。野生型本氏烟(Nicotianabenthamiana)由本实验室保留繁殖。2．1．2菌株、质粒和cDNA文库菌株：大肠杆菌(Ecob)DH5a和农杆菌(Agrobacteriumt"mefaciens)菌株CssCl由本实验室保存；酵母菌株AHl09为Clonteeh公司产品。质粒：克隆载体pMD．18T载体购自Takara公司；酵母双杂交系统的质粒pGBKT7、pGADT7，pGADT7-REC、pGBKT7-53、pGBKT7-Lam和pGADT7-RecT均为Clontech公司产品；BiFC的载体p2YN和p2YC由美国俄亥俄州立大学分子遗传系DavidM．Bisaro教授惠赠。酵母双杂交用水稻叶片cDNA文库由本实验室构建并保存。2．1．3主要生化试剂zkq20160323Trizol购自Invitrogen公司：Taq聚合酶、dNTPMix、T4DNA连接酶、AMV反转录酶、RNA酶抑制剂、DNA限制性内切酶等试剂购自TaKaRa公司；核酸标准分子量(LadderDNA)购自Fregments公司；葡萄糖、DMSO、醋酸锂等试剂购自Sigma公司；胰蛋白胨、酵母提取物购自Oxoid公司；HerringtestescarrierDNA、酵母生长培养基购自Clontech公司；其余试剂为国产分析纯(AR)。2．1．4水稻罴条矮缩病毒P6诱饵质粒的构建2．1．4．1引物的设计与合成根据GenBank中已经登录的水稻黑条矮缩病毒P6蛋白的序列(登录号为KCl34294)设计特异性引物(P6．F和P6．R)，由上海lnvitrogen公司合成，引物序列如表2．I。万方数据 万方数据浙江大学硕士学业论文与水稻黑条矮缩病毒P6互作的水稻寄主因子的筛选2．1．4．2Trizol法提取感病水稻总RNA1)剪取100mg感染RBSDV的水稻病株组织样品，加液氮研磨成粉末；2)将粉末转入预先加好lmLTrizol抽提液的1．5mLRNA．free的离心管中，上下混匀，充分裂解，室温静置5min；3)加入200灿氯仿，盖紧离心管盖，按住管盖激烈震荡15sec，室温静置2min；4)4℃，12000rpm离心15min(溶液分层，底层为酚相，中层为蛋白质，上层为含RNA的水相)，取上清于一新的1．5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min；5)4℃，12000rpm离心10min，弃去上清液，加入lmL75％酒精(DEPC水配制)清洗沉淀两次；6)4℃，7500rpm离心5min，弃去上清，室温干燥，溶于DEPC处理的ddH20中(每管30¨L左右)，用枪头吹打助溶，必要时可在65℃水浴中助溶3-5min。2．1．4．3AMV反转录扩增获得P6的cDNA以提取的总RNA为模板，利用反转录酶AMV进行反转录，反应体系如下：RNA2此5×RTBuffer4此dNTPMixRNaseInhibitorP6一RprimerAMV2gL0．5uL2止2此总体积1420肛L 万方数据浙江大学硕士学业论文与水稻黑条矮缩病毒P6互作的水稻寄主因子的筛选PCR仪中反应：25℃10min42℃1h4℃10min上述反应结束后，获得尸6的cDNA。2．1．4．4利用Phusion高保真酶扩增P6片段以扩增得到的cDNA为模板，利用Phusion高保真酶克隆目的片段，总体积为50uL，反应体系如下：5×PhusionGCbuffer10pLPCR反应条件：10mMdNTPs1止DMS0P6．FP6．RPhusion酶cDNA模板1．5扯L1．5uL1．5止0．5儿1gL总体积98℃30sec50此5987篡30secc)33cycles7272SeC℃}℃J称取1．og琼脂糖于含100mL0．5×TBE溶液的锥形瓶中，制备1％的琼脂糖胶一块。将PCR产物上样，150V，35min。紫外下照相并切取目的条带的胶条，胶条15 万方数据浙江大学硕士学业论文-5水稻黑条矮缩病毒P6互作的水稻寄主因子的筛选越小越好．并将胶条置于2mL离心管中。使用Axygen公司胶回收试剂盒(AxygenDNAGelExtractionKit)，步骤如下：1)在紫外灯下用一锋利刀片从凝胶中割取目的片段带，测定重量(mg)；2)加入3倍胶体积(mg／gL)的BufferDE-A缓冲液；3)悬浮均匀后于75"cho热，每隔2．3rain混合一次，直至凝胶块完全融化(约8min)；4)按BufferDE．A体积的50％加入BufferDE．B，混合均匀。当回收的DNA片段小于500bp时，加入l倍胶体积的异丙醇，混匀；5)将以上样品转至DNA．prepTube离心柱，离心柱置于2mL收集管上，5500rpm离心lmin，弃滤液；6)用500此BufferWl洗柱，5500rpm离心lrain，弃滤液；7)用700此已加无水乙醇的BufferW2洗柱，5500rpm离心1min，弃滤液，用同样的方法再用700rtLBufferW2洗涤一次；8)将DNA．prepTube置于1．5mL离心管中，13000rpm离心1rain，以彻底去除BufferW2：9)将DNA．prepTube置于另一洁净的1．5mL离心管中，在Silica膜中央加25-30IxLEluent以溶解柱中DNA，室温静置1min，12000rpm离心lmin，收集离心液即为DNA溶液。2．1．4．6PCR回收产物加APCR的产物经割胶回收后按如下反应体系加A：回收产物25．5此10×buffer3uLdNTP1儿!垒g乜!丛§Q：主吐总体积30此反应条件为：72。C，放置30min。2．1．4．7加A产物连PMD．1ST载体将PCR的加A产物与pMD一18T载体连接，反应体系(109L)如下：待连片段7¨L16 万方数据浙江大学硕士学业论文与水稻黑条矮缩病毒P6互作的水稻寄主因子的筛选pMD一18T1gLT4ligase1uL!Q兰!垒连接绫韭速!丝!=总体积为10pL反应条件为：16℃连接反应过夜。2．1．4．8热击转化大肠杆菌DH5a及茵落PCR鉴定重组子1)取一管低温保存的DH5a感受态细胞，每管100gL，置冰上；2)加入10“L连接产物，轻搅混匀，冰上静置30min；3)42℃水浴90sec后迅速置冰上，静置2min；4)加入700此液体LB恢复培养基，37℃振荡培养1．5h；5)取200laL培养液涂布于麦康凯培养基(含100lag／mL氨苄青霉素)，37℃培养至红、白斑区分明显为止。茵落长出后挑取单菌落，用pMD．18T通用引物M13F和M13R(引物的序列如表2．2)筛斑(菌落PCR)，PCR反应体系为：dNTP(10raM)0．5止10xpCRbufier2．5山M13F0．5pLM13RTaq酶0．5uL0．2laL总体积25uL裹2．2引物M13F和M13R的序列Table2．2SequencesofMl3FandM13R引物名称序列(5、一3’)M13FM13RCGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACAGCGG』姐AACAArrrrCACACAGGA17 万方数据浙江大学硕士学业论文与水稻黑条矮缩病毒P6互作的水稻寄主因子的筛选PCR反应程序为：95麓445secn卜cycles722min24sec℃≯3℃J72℃10min16℃5min将阳性克隆挑到含相应抗生素的液体LB培养基，37℃振荡培养。2．1．4．9重组质粒的小量抽提质粒提取方法如下(AxygenPlasmidMiniprepKit)：1)收集2．4mL在LB液体培养基中培养过夜的菌液，12000rpm离心lmin，去尽上清：2)用250止已加入RNaseA的BufferS1充分悬浮细菌沉淀；3)加入250laLBuffers2，温和但充分地上下翻转混合6—8次，直至形成透亮的溶液，此步骤不宜超过5min；4)加入350IlLBuffers3，立即轻轻颠倒混匀，此时可见有白色絮状沉淀出现，室温静置2min，12000rpm离心10rain；5)上清转移至制备管(置于2mL离心管中)，12000rpm离心lmin，弃滤液；6)用500止BufferWl洗柱，12000rpm离心30sec，弃滤液；7)用700止已加无水乙醇的BufferW2洗柱，12000rpm离心30sec，弃滤液，用同样的方法再用700止BufferW2洗涤一次；8)12000rpm离心2min，以彻底去除BufferW2；9)将DNA．prepTube置于另一洁净的1．5mL离心管中，在膜中央加80此ddH20，室温静置Imin，12000rpm离心1min，收集离心液即为质粒DNA溶液。2．1．4．10目的片段酶切取一个0．5mLeppendorf，依次加入以下试剂：质粒DNA8“L10x酶反应缓冲液l此18 万方数据浙江大学硕士学业论文与水稻黑条矮缩病毒P6互作的水稻寄主因子的筛选An限制性内切酶o．5止垦堡塑H!限剑性凼翅墼Q：三吐总体积10gL37℃酶切消化3．4h后琼脂糖凝胶电泳检查结果，将质粒DNA酶切的目的片段用凝胶回收试剂盒回收后连至相同酶切的表达载体pGBKT7片段上，构建成pGBKT7-P6重组载体，并转化至大肠杆菌DH5a。2．1．4．11重组质粒的提取与鉴定1)用上述质粒提取试剂盒提取质粒。2)PCR鉴定取1uL溶液作为反应模板，根据2．1．4．4节的PCR反应条件，鉴定目的基因片段是否插入表达载体中。3)酶切鉴定提取的重组质粒用BamHI和风d限制性内切酶，37℃酶切消化3—4h后，琼脂糖凝胶电泳检查结果。4)序列测定PCR、酶切鉴定阳性的重组载体进行基因序列测定，验证其基因序列及ORF的正确性。2．1．5诱饵蛋白在酵母中表达检测2．1．5．1酵母菌株的活化取．70℃保存的酵母菌株AHl09在YPDA平板上划线，30℃培养3-5d。2．1．5．2诱饵质粒pGBKT7．P6(BD．P6)转化酵母菌株AHl09(小量法)1)划线AHl09于YPDA平板上3d后长出菌落，挑一个茵落摇菌(1xYPDA)过夜，OD600=0．5—1．0；2)取1．1．5mL于1．5mL离心管，离心机最高转速5SCc，弃上清；3)加入1mL无菌水重悬，最高转速5sec，弃上清；4)加入lroLl00mMLiAC，30℃水浴5min；5)离心机最高转速5SCC，弃上清；6)按顺序加入以下溶液： 万方数据浙江大学硕士学业论文与水稻黑条矮缩病毒P6互作的水稻寄主因子的筛选PEG3350(50％)(WⅣ)240p．L1．0MLiAC36uLssDNA(2．0mg／mL)50／aLBD-P6(RBSDV)5．0gLpGADT75．0gL无菌去离子水20uL7)激烈涡旋至少lmin，42℃水浴20min；8)离心机最高转速离心10sec，弃上清；9)加入200gL无菌去离子水，取100uL涂板SD／-Trp和SD／一Leu／一Trp；10)30℃培养至菌落出现。2．1．5．3诱饵蛋白对酵母毒性及其自激活活性的检测从SD／-Trp平板上，用无菌平头牙签挑出一个单菌落于5mLSD／．Trp液体培养基中，30℃220rpm振荡培养16h后测菌液OD600。同时，从SD／-Leu／．Trp平板上，用小枪"划g--个单菌落溶于100gL的ddH20中吹打混匀，再吸15pL点滴到三缺(SD／-His／-Leu／-Trp)和四缺(SD／．His／．Leu／-Trp／．Ade)固体培养基，30℃培养箱倒置培养3．5d，观察RBSDVP6在酵母中有无自激活活性。2．1．6酵母双杂交实验2．1．6．1重组质粒的验证和酵母菌株的活化为了后续实验的顺利进行，需要对重组质粒pGBKT7-P6、pGADT7一P6及酵母菌株AHl09进行验证。对构建好的载体进行测序验证；对AHl09也要进行验证，在YPDA固体培养基划线培养，以提高酵母的活性。在确保构建的载体和实验菌株都没问题后，进行后续实验。2．1．6．2酵母感受态细胞的制备(LiAe法)1)挑取直径为2．3mm的酵母单菌落，接种于含有3mLYPDA液体培养基的15mL无菌离心管中；2)30℃，250rpm，振荡培养8h；3)取5肚培养物转接到含50mLYPDA培养液的250mL三角瓶中；4)30℃，230-250rpm振荡培养16-20h，直至OD600达到0．15．0．3；2n 万方数据浙江大学硕士学业论文与水稻黑条矮缩病毒P6互作的水稻寄主因子的筛选5)室温1000rpm离心5min，弃上清，加入100mLYPDA培养液，重悬细胞沉淀，然后于30℃，230—250rpm培养3．5h，直至OD600达到0．4．0．5；6)室温1000rpm离心5min，去上清，加入60mL无菌水重悬细胞沉淀；7)室温1000rpm离心5min，去上清，加入3mL1．1xTE／LiAc溶液重悬细胞沉淀；8)将重悬的细胞分装到两个1．5mL的无菌离心管中，最高转速离心15sec；9)去上清，每管加入600此1．1×TE／LiAc溶液重悬细胞沉淀，即成酵母感受态细胞。2．1．6．3共转化酵母菌株AHl091)制备酵母感受态细胞(方法如上)；2)在无菌的离心管中加入如下成分：pGADT7．Rec．cDNA(水稻的eDNA文库)3¨LpGBKT7一P6质粒DNA(510“L)6¨g变性的HerringTestesCarrierDNA(10mg／mL)20”L3)加入600uL制备好的酵母菌AHl09感受态细胞，轻轻涡旋混匀；4)加入2．5mLPEG／MAc溶液，轻轻涡旋混匀：5)30℃温育45min，每15min混合一次；6)加入160uLDMSO，混匀，42℃水浴20min，每10min混合一次；7)1000rpm离心5min，去掉上清，加入3mLYPDPlus液体培养基(试剂盒配带，可用普通的YPDA液体培养基替代)重悬细胞沉淀；8)30℃，250rpm振荡培养120min；9)1000rpm离心5min，去净上清，加入6mL0．9％的无菌氯化钠溶液重悬细胞。2．1．7RBSDVP6蛋白互作因子筛选1)将共转化菌液涂布于三缺培养基SDAHis／．Leu／．Trp(150gL菌液／150mm板)；2)为计算转化效率：(1)从3mL共转化的菌液中取30uL菌液，加720gLNaCl溶液稀释至终体积为750pL；(2)各取150¨L的稀释液分别涂布于150mm的平板：SD／-Leu／-Trp和SD／-Leu；3)30℃培养箱培养5-8天，忽略直径≤lmm的菌落，挑选直径>2mm的菌落；4)转化效率计算方法：2l 万方数据浙江大学硕士学业论文与水稻黑条矮缩病毒P6互作的水稻寄主因子的筛选a．统计SD／-Leu板上的克隆数，克隆数×1000=转化子／3pgpGADT7一Rec预期值应≥1×106转化子／3lagpGADT7-Recb．统计SD／．Leu／-Trp板上的克隆数，克隆数×1000=所出现的克隆数预期值应：≥5×105克隆数／文库5)用白色小枪头将长出的菌落稀释在100laLddH20中，再吸取15pL点滴SD／．His／．Leu／．Trp／．Ade四缺平板上，30℃培养箱培养3．5d；6)挑取四缺培养基上生长快而且颜色白的酵母菌落(候选阳性)于三缺的液体培养基中，30℃250rpm振荡培养，准备提取酵母质粒。2．1．8酵母质粒的提取用TIANGEN公司(Beijing，China)的酵母质粒小提试剂盒，自备试剂：Lyticase(购自TIANGEN公司)；山梨醇buffer：1．2M山梨醇；100mM磷酸钠缓冲液(pH7．4)。1)挑取在三缺培养基上生长的酵母单菌落，加到5mLSD／．His／．Leu／．Trp液体培养基中，在30℃下振荡培养(230．250rpm)24—36h；2)向吸附柱CP2中(吸附柱放入收集管中)加入500laL的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；3)取3．5mL酵母培养物，12000rpm离心lmin，尽量吸除上清；4)酵母细胞壁的破除：向菌体中加入300laL山梨醇buffer，加入50ULyticas充分混匀，30℃处理1h。4000rpm离心10min，弃上清，收集沉淀。加入250laL溶液YPI(确定已加入RNaseA)重悬沉淀；5)向管中加入250laL溶液YP2，温和地上下翻转6．8次使菌体充分裂解，室温放置5．10rain；6)向管中加入350laL溶液YP3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀，12000rpm离心20rain；7)小心地将上清液加入吸附柱CP2中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30．60$e6，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；8)向吸附柱CP2中加入500laL缓冲液PD，12000rpm离心lmin，倒掉废液； 万方数据浙江大学硕士学业论文与水稻黑条矮缩病毒P6互作的水稻寄主因子的筛选9)向吸附柱CP2中加入600laL漂洗液PW(先确认是否已加无水乙醇)，12000rpm离心lmin，倒掉收集管中的废液；10)向吸附柱CP2中加入700／aL漂洗液PW，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；11)将吸附柱CP2重新放回收集管中置于12000rpm离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。将吸附柱CP2置于室温或50℃温箱放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中的漂洗液；12)吸附柱CB2放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位悬空滴50．100gL洗脱缓冲液EB，室温静置2min，12000rpm离心lmin将质粒溶液收集到离心管中；13)为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，重复步骤(12)。2．1．9候选的寄主因子的分离、测序并比对，确定蛋白类型1)将提取的酵母质粒转化到大肠杆菌DH5aqb，将转化的菌液涂布到含有氨苄青霉素的麦康凯平板上(文库质粒构建在pGADT-Rec—eDNA载体上是氨苄青霉素抗性，诱饵质粒pGBKT7．CP为卡那霉素抗性)，去除所提取的酵母质粒中抗卡那霉素抗生素的诱饵质粒，同时扩繁了抗氨苄青霉素的文库质粒；2)以转化长出的大肠杆菌菌落为模板，以pGADT-Rec．eDNA载体上T7启动子为引物，对插入的eDNA作PCR鉴定，鉴定扩繁的质粒中是否插入eDNA片段以及插入的eDNA大小；3)根据茵落PCR的结果，挑取菌落摇菌，并送英俊公司测序；4)测序所得序列登录NCBI网站利用Blastx进行蛋白质序列比对。2．1．10候选的寄主因子基因全长克隆及其酵母双杂交载体的构建经序列分析，筛选到的克隆P6—100和P6．102为一个功能未知的寄主因子蛋白(以下简称P6一100)，这两个克隆包含编码P6—100蛋白所需的完整ORF并带有部分非编码序列，设计相应的特异性引物(如表2．3示)克隆全长。以克隆P6．100的大肠杆菌质粒为模板，用Phusion高保真酶PCR扩增出P6-100基因的ORF。将目的片段加A反应后，连接到pMD一1ST载体上，转化大肠杆菌DH5a。通过菌落PCR， 万方数据浙江大学硕士学业论文与水稻黑条矮缩病毒P6互作的水稻寄主因子的筛选选择出阳性的菌落。取阳性的菌落，摇菌，提质粒，用于后续的实验。表2．3克隆P6-100基因所用引物Table2．3PrimersusedforP6-100genecloning用凝胶回收试剂盒回收后加A后连至pMD．18T载体上，并转化至大肠杆菌，用pMD一18T载体通用引物测序正确后，分别用引物中的酶酶切后连接到酵母载体pGADT7和pGBKT7上，分别构建成目的载体。2．1．11水稻P6．100同源序列比对为比较水稻的P6．100蛋白和其他物种中已报道的同源蛋白全长氨基酸序列间的同源关系，从NCBI网站的蛋白库中(http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／protein／)查找了以下与水稻P6．100同源的蛋白：小米P6．100(SetariaitalicaP6．100)、马铃薯P6—100(SolanumtuberosumP6．100)、本氏烟P6—100(NicotianabenthamianaP6—100)、二穗短柄草P6一100(BrachypodiumdistachyonP6．100)、短花药野生稻P6．100(OryzabrachyanthaP6．100)、拟南芥P6．100(ArabidopsisthalianaP6—100)。利用DNAStar软件(Madison，WI，USA)软件进行多序列的比较分析，同时利用DNAStar中的MegAlign软件，采用ClustalW方法，通过Phylogenetictree程序生成进化树。2．1．12将构建好的含全长基因重组质粒转化酵母菌株AHl09进行互作验证取．70℃保存的酵母菌株AHl09在YPDA平板上划线，30℃培养3．5d。取YPDA平板上的酵母菌单菌落，在YPDA液体培养基中30℃震荡培养到OD600=o．5．0．8后，取5uL重组质粒，LiAC小量法转化酵母菌株AHl09，转化后涂布在二缺SD／．Leu／．Trp平板上。在二缺培养基上生长三天的酵母，运用点滴培养法，倍比稀释后分别点到三缺培养基SD／一His／一Leu／-Trp和四缺培养基SD／-His／．Leu／．Trp／．Ade上。点滴培养方法为：从二缺培养基中挑取酵母单菌落，悬浮于100uLddH20，使得OD600约为1．0，再倍比稀释成浓度为：1．0×10～，1．o×10之，1．OxlO。；取10I-tL各浓 万方数据浙江大学硕士学业论文与水稻黑条矮缩病毒P6互作的水稻寄主因子的筛选度的菌液点滴于三缺培养基SD／-His／-Leu／．Trp和四缺培养基SD／．His／．LeuATrpAAde上，30℃倒置培养约3—5d，观察酵母生长情况，确定互作结果。2．1．13BiFC验证P6蛋白与P6．100在植物体内的互作2．1．13．1BiFC载体的克隆根据NCBI上已经登录的P6-100的全长序列设计特异性引物，利用PCR技术以pGADT7一P6-100为模板，用BiFC特异性引物(如表2．4)高保真酶分别扩增P6-100和尸6基因，PCR产物经加A连接到pMD．18T载体上，转化DH5a，筛斑、摇菌、测序验证后，P6-100和P6基因分别连接到目的载体2YN(含YFP的N端部分)和2YC(含YFP的C端部分)上，分别得到质粒YFPc．P6．100／YFPS-P6，yFpc-P6／YFPs．P6．100。表2．4BiFC实验的引物Table2．4SequencesofprimersusedforBiFC2．1．13．2电击转化农杆菌C懿Cl菌株将构建好的BiFC质粒组合yFpC-p6．100／YFPS-P6、YFPc—P6／YFPr。-P6—100、yFpc-PHDl077与yFpN．PHDl077(已经证明的互作的蛋白，作为阳性对照)、2YN-P6-100与2YC和2YC．P6与2YN(作为阴性对照)，通过电击的方法转化农杆菌c58c1。电击方法转化农杆菌c58cl的步骤：电击杯放进70％的酒精中浸泡，用之前用吸水纸擦干，放37℃烘干。1)28℃，200rpm培养农杆菌菌株C58C1约16h：2)1．5mL离心管取1．5mL菌液，8000rpm离心30see；3)去残夜，沉淀用lmLddH20充分悬浮，8000rpm离心30sec；4)重复步骤3)三次；’E 万方数据浙江大学硕士学业论文与水稻黑条矮缩病毒P6互作的水稻寄主因子的筛选5)去残夜，沉淀用200laLddH20悬浮，即为获得农杆菌感受态，室温静置2min；6)取6．10皿重组质粒于200灿感受态，轻打混匀，然后转移至电击杯中(预冷，一定要擦干，用后浸洗酒精)，置冰上；7)准备好电击装置，电压为2500V，双手一起按住电击按钮，直到嚓的一声，即为电击完毕；8)电击后室温静置2min，再加入800¨LYEP(LB)培养液，28℃静置lh，然后在28℃下200rpm震荡2h；9)8000rpm离心30sec收集菌液，沉淀用200皿ddH20悬浮，用玻棒涂布于含卡那霉素和利福霉素的固体培养基平板上，28℃培养48h；10)长出的单茵落用特异性引物进行PCR鉴定。2．1．13．3农杆菌浸润接种本氏烟挑取含重组质粒的农杆菌于含相应抗生素Km(50gg／mL)和Rif(5099／mL)的YEP液体培养基中，28℃振荡培养至OD600约为1．0，离心收集菌体，用含终浓度为10mMMgCl2，10mMMES(pH5．7)和200rtM乙酰丁香酮的无菌水溶液重悬浮，调整菌液浓度使其OD600约为1．2左右，室温下放置2．3h，将分别含有2YC-P6-100／2YN-P6，2YC—P6／2YN．P6—100，2YC—PHD1077与2YN—PHD1077，2YN．P6．100与2YC，2YC．P6与2YN重组质粒的农杆菌菌液等体积混合，振荡混匀；用1mL注射器针头在2-4周的本氏烟叶片背部刺2．3个小孔，一手按住叶面小孔处，一手用无针头的针管将菌液沿小孔慢慢注入叶片组织空隙中。浸润接种后的植物置于25℃培养，36—48h后共聚焦显微镜下观察。2．1．13．4激光共聚焦显微镜观察互作结果取浸润36．48h后的本氏烟叶片，在载玻片上滴一滴水，切取烟草叶片浸润部位并背面朝上铺于载玻片上，盖上盖玻片，倒置于共聚焦显微镜(CLSM，LeicaTCSSP5，Mannheim，Germany)，用515nm左右的激发光激发，观察烟草表皮细胞中YFP表达情况并拍照，确定两种蛋白在植物体内的互作情况。 万方数据淅Ⅱ大学硕士学业论文与水稻黑条矮缩病毒P6§作的水稻寄主目子的锥选2．2结果与分析2．2．1诱饵质拉的构楚通过BamHI和Pstl酶切pGBKT7．P6质粒进行酶切验证，酶切产物的电泳结果显示切出了2394bp大小的P6目标条带和pGBKT7载体条带，说明诱饵载体构建正确(图2．1)，进一步将pGBKT7．P6质粒送去测序，序列比对结果证明P6读码框末发生突变，核酸序列正确。M1250020002394bp田2．1诱饵载体pGBK'r7-P6的酶蜘鉴定M10曲棱酸分子量标准；1：用BamHl和Pstl震酶切诱饵质粒．Figure2．1RestrictionenzymedigestionofpGBKT7-P6M：1．OkbDNALadder；,1：DlgPstionofthetargetplasrnidwithBamHIandPstI2．2．2诱饵蛋白对酵母毒性及白澈活活性的检测将pGBKT7一P6诱饵质粒转化到AHl09酵母菌中，涂布到固体培养基SD／-TIp上，30℃倒置培养。涂板2-3d后酵母长出正常茵落形态，挑取单菌落接种于5mLSD／一Tip液体培养基中，30℃230tpm振荡培养16h，测菌液OD鲫=11，酵母生长正常，证明诱饵蛋白P6对酵母AHl09没有毒性。将pGBKT7·P6诱饵质粒与pGADT7空载质粒共同转化酵母AHl09，涂SD／-Leu／一Trp平板．30℃倒置培养约2-4天后能正常长出菌落，再次证明融合蛋白 万方数据斯Ⅱ大学碱士学业话戈与水稻黑条蜃缩病毒P6i作的水稻寄主目子的箭选pGBKT7一P6对酵母菌没有毒性。从二缺平板上挑取单菌落点滴三缺和四缺平板培养，发现pGBKT7-P6和pGADT7共转化的酵母在三缺(SD／-Hisd-Leu／-Trp)和四缺(SD／-His／-Leo／-Trlg-Ade)平板上无法生长，与阴性对照结果相同，而阳性对照pGBKT7-P53和pGADT7-T共转化的酵母生长良好(如图2．2)。这些结果证明诱饵蛋白pGBKT7一P6对酵母没毒性，且没有自激活活性，适合做酵母筛库诱饵蛋白。圈2．2RBSDVP6自激活活性检测Figure2．2Detectionof∞If-acfivationofthebailprotcinP62．2j与P6蛋白互作的寄主因子件选将水稻eDNA质粒和诱饵质粒pGBKT7一P6共转化酵母菌AHl09后，所得的菌液涂布于三缺(SD／-His／-Leu／-Trp)平板上。30℃培养5-8d后，将三缺平板上直径大于2mm的单菌落，先稀释在100止灭菌的双蒸水中，再分别吸取JO止点滴在四缺(SD／-His／-Leu／-Trp／-Ade)平板上进行第二次筛选，获得113个候选阳性克隆(图23)。陛．罗l·；·：：少SDl-I弛l-Leut-TrpSDI-IllsI-Lee／-Trp／-Ade雩_ 万方数据渐Ⅱ^学硬±学Ⅲ论支5水稻黑采矮缩病毒P6§作的水稻寄±目子的筛选田2．3酵母双杂交筛选与RBSDVP6蛋白的互作的寄主因子Figure2,3Sc化eningofhostfactorsinteractingwithRBSDVP6byatwoyeasthybrid挑取SD／一His／一Lcu／一Tqa／-Ade平板上生长快且颜色白的菌落扩繁，提取酵母质粒，并将所提取的质粒转化大肠杆菌DH5ct，涂板LB／Amp，通过氨苄抗生素筛除诱饵质粒(pGBKT7．P6，载体筛选标记为卡那霉素)，再经过蕾落PCR鉴定(图2．4)。田2．4转化辞母质柱的大肠杆茁苗落PCR检测7：7个不同的酵母苗落提取的质粒转化DH5Ct后的菌落PCR检测，每种酵母质粒转化后拴剥三个不同的大肠杆菌苗落。Figare2APCRdetectionofE．coliwansformedwithyeastplasmidsl·7：PCRdetectionofDH5fttcansformedwithyeastplasmids．ThreedifferentE．colicloneswe陀dctectedforeachyeastplasmidtransfommnt将上面PCR筛斑条带特异单一对应的大肠杆菌DH5ct用含Apm的LB液体培养基过夜摇茵培养，并用试剂盒少量抽提质粒(文库质粒AD—X)。用质粒共转化酵母的方法，将抽提的文库质粒与诱饵质粒(pGBKT7一P6)共转酵母AHl09验证互作，排除假阳性，一共转化了50个文库质粒。实验发现P6—100、P6—102和P6—166号等共10个克隆能和诱饵蛋白在酵母中互作，其余克隆部分不能和诱饵蛋白互作或者和pGBKT7空载体互作(如图2．5)。 万方数据淅Ⅱ大学萌±学Ⅱ论文与水稻黑齐矮缩病毒P6§作的水稻寄主西子的筛选囤ApGBⅡ’7pGBKT7—ⅣpG．^DT7DC^DT■SDHis；LeuT∞Ade圈2．5酵母双杂交实验进一步排除假阳性Figure2．5Removingfalsepositivehostfactorswithyeasttwo-hybrideassay将P6—100、P6—102和P6—166等10个克隆所对应的大肠杆菌送英俊公司测序，测序所得序列登录NCBI网站，利用Blastx翻译比对。序列分析发现，P6．100和P6—102克隆与水稻(日本晴品种)一个功能未知的蛋白(以下简称P6一100)序列相同，这两个克隆序列包含编码P6．100蛋白的完整ORF，并包含部分非编码序列；P6．166克隆与水稻(日本晴品种)一个含有类似于葡萄球菌核酸酶(Staphylococcalnucleasehomologues，SNase)的保守结构域的蛋白同源性最高，该蛋白的功能还没有报道。其余几个比对蛋白分别为：一个具有PHD保守结构域的蛋白、乙醛脱氢酶 万方数据淅Ⅱ^学硬±学Ⅱ论xS水％￡枭矮缩病毒P6E镕∞^稻寄±目子的饰选(aldehydedehydrogenase)、COP9信号转导复合体5b亚基蛋白(COP9signalosomecomplexsubunit5b)、ATP合成酶6链(pumtiveATPsynthasedeltachain)、泛素结合催化酶E2(Ubiquitin—conjugatingenzymeE2，catalytic)和己四醇醛酸脱授酶(UDP-glueuronicaciddecarboxylase)．2．2．4水稻P6-100基因全长克隆及酵母双杂交栽体的构建根据剥序结果，从NCBI上Blastx比对出水稻基因组中P6—100蛋白的全长序列，根据比对出的全长序列设计特异性引物。用克隆P6．190的大肠杆菌质粒为模板，用Phusion高保真酶扩增得到特异性目的片段(图2．6)，回收目的片段后，连接到pMD—IgT载体上。转化大肠杆苗DH5a，菌落PCR后摇菌、测序。核酸测序经英俊测序公司测序正确后，酶切得到目的片段，回收连接到载体pGBKT7和pGADT7上。重组质粒转化大肠杆茴DH5a，菌落PCR筛选得到阳性苗落。摇茴提质粒，得到重组质粒pGADT7．P6—100和pGBKT7．P6．100。495bp750bp500bp圈2．6质粒pGBKT7·P6-100的酶切鉴定M：10kb核酸分子量标准；INdeI和BamHl双酶切诱饵质粒。Figure2．6RestrictionenzymedigestionofpGBKT7·P6-100M10kbDNALadder；】：DigestionoftheplasmidwithNdel肌dBamHl2．2．5水稻P6．100蛋白与其他植物同尊蛋白的相似性比较水稻P6-100蛋白基因全长为483bp，预测编码一个160aa、约176kD的蛋白。DNAStar软件聚类分析表明水稻P6．100蛋白与短花药野生稻的同源蛋白氨基酸序列 万方数据浙江大学硕士学业论文与水稻黑条矮缩病毒P6互作的水稻寄主因子的筛选相似性最高，达95．6％；与小米的同源蛋白氨基酸序列相似性达95％，另外，与二穗短柄草也有较高的同源性，达90．6％；此外，水稻P6．100还与本氏烟、拟南芥和马铃薯的同源蛋白有较高的同源性(图2．7)。7．O——————1—————————————_r—————————————r———————————]6420AminoAcidSubs籍lulions{x100)l砌ZaSa尉a啊OOmabrachyan缃文科。OSe|酬aitalicaj口ro&翟由ypOd融mdista功yoa．proNicotJanabenthandaria．proSolatlumtuberosum，proArabidoDSiS蜘aiiana．Pro图2．7水稻P6．100蛋白与其他植物同源蛋白的相似性比较Figure2．7ComparisonofP6-100poteinofricewithhomologousproteinsofotherplants2．2．6利用酵母双杂交验证P6-100与RBSDVP6的互作将水稻P6-100全长基因构建到pGADT7载体上，P6构建到pGBKT7载体上，将得到的重组质粒共转化进酵母菌株AHl09，涂在二缺培养基SD／．Leu／-Trp上生长。生长3d后，挑二缺平板上生长较好的酵母菌株稀释于100皿ddH20中吹打混匀，再取15pL点滴培养在四缺培养基SD／一His／．Leu／-Trp／-Ade上。转化pGADT7-P6-100和pGBKT7．P6质粒的酵母在四缺培养基SD／．His／-Leu／．Trp／．Ade生长情况与阳性对照(转化pGBKT7-P53和pGADT7-T质粒的酵母)差不多；而转化pGADT7-P6—100和pGBKT7质粒的酵母以及pGBKT7·Lam和pGADT7-T质粒的酵母(阴性对照)在四缺培养基上不能生长(图2．8)，这一结果说明P6—100蛋白与RBSDVP6蛋白在酵母系统中有较强的互作。 万方数据淅Ⅱ大学顶±学业论文与水稻黑荣矮缩病毒P6i作的水稻寄±因子的筛选pGBKT"7-P53+pGADT7TpGBKT7一Lam+pGADT7-TpGBKT7一P6+pGADT7一P岳100pGBKT7+pGADT7-P6-100j■nr吲●oo●SD／HisJLteJTrp／Ade田2．8酵母双杂交验证RBSDVP6蛋白与寄主园子P6-100的互作Figure2．8IdentificationofRBSDVP6interactigwithhostfactorP6-100byyeasttwohybrid2．2．7利用BIFC验证P6-100与RBSDVP6的互作2．2．7．1BIFC截体的构建在酵母双杂交结果的基础上，我们通过BIFC实验进一步研究RBSDV1'6与筛选到的寄主因子P6—100在植物体内的互作关系。首先利用所设计的引物，将P6和P6-100基因序列克隆到PMD．18T载体上(公司测序确认克隆正确)，再用限制性内切酶PacI和Ascl消化回收含有相同粘性末端的目的片段和2YC／2YN载体。将P6和P6-100分别连接到载体2YC／2YN上，PCR及酶切验证(如图2．9)均与预期的大小一致，说明重组表达质粒2YC—P6和2YN．P6以及2YC．P6—100和2YN-P6—100构建成功。 万方数据淅Ⅱ大学萌士学业论支与水稽黑条矮缩病毒P6i作的水稻寄主因子的筛选—2YC-—F6竖!兰L2坚：!!缈』!!11”医r田2．9质粒2YC-P6，2YN．P6，2YC-P6-100和2YN-P6-100的酶切鉴定M：1．0kb核醺分子量标准。Figure2．9Restrictionenzymedigestionsof2YC-P6，2YN-P6，2YC-P6—100and2YN-P6-100M：10kbDNALaddec2．2．7．2BIFC互作验证将构建好的重组质粒通过电击导入农杆菌C5sCI中，将两种菌液等量混合，共浸润5-6叶的本氏烟，36—48h后通过激光共聚焦显微镜观察两种蛋白的互作情况。结果表明，P6蛋白和P6—100蛋白在植物细胞内也可以互作，互作发生在细胞膜、细胞质和细胞核中，而且P6—100有很强的自身互作，互作发生在细胞膜、细胞质和细胞核中(图2lO)。 万方数据淅Ⅱ★学硬±学业论文与水稻黑枭墙缩病毒P6i作的水稆寄主目子的精选bC田]]lightfieldYFPMerge田2．10BiFC验证RBSDVl76与P6．109蛋白在植物体内的互作a：2YC-PHDl077+2YN·PHDl077；b：2YC-P6+2YN；c：2YC+2YN-P6-100；d：2YC-P6+2YN-P6-100；e：2YN-P6·IOO+2YC·P6·100。Figure2·10BiFCvis岫lizationoftheintemetionbetweenRBSDVP6andP6一100inagro-infiltratedⅣbenthamianak—a：Co-expressi∞of2YC-PHDl077+2YN-PHDl077inⅣbenthamianaleaves；b：Co-expmssionof2YC-P6and2YNinⅣbenthamianaleaves；cCo-expressionof2YCand2YN-P6-100inMbenthamianaIeaves；d：Co-expressionof2YC-P6and2YN-P6·100inⅣbenthamianaleaves；e：Co-expressionof2YN-P6-100andYC-P6-100inⅣbenthamianaleaves 万方数据浙江大学硕士学业论文与水稻黑条矮缩病毒P6互作的水稻寄主因子的筛选2．3讨论RBSDVP6是该病毒的沉默抑制子，与基因沉默的传播和维持相关联，而且能够完全抑制GFPDNA的甲基化作用；同时P6蛋白还是致病因子，可以使PVX感染的症状加重，使本氏烟新生叶片卷曲进而萎蔫枯死(张凌娣等，2005)。P6在植物体内如何发挥抑制子的功效以及如何协助症状的产生有待进一步的研究。本研究以RBSDVP6蛋白为诱饵，利用酵母双杂交技术筛选水稻cDNA文库，获得与P6互作的水稻寄主因子。Fields等于1989年首次提出酵母双杂交系统(Fieldsetal．，1989)，随着该技术不断的完善和改进，逐渐成为研究蛋白互作的主要工具之一。与其他研究蛋白互作的技术相比，酵母双杂交技术具有互作真实、操作简单、快速便捷、灵敏度高和成本低等多种优点。鉴于酵母双杂交系统的特性，我们将P6连接到pGBKT7载体上构建成诱饵质粒，进一步实验证明pGBKT7．P6蛋白在酵母细胞中没有毒性，也没有自激活活性，可以用作酵母双杂交筛库实验的诱饵。但酵母双杂交系统也具有本身的局限性，假阳性高就是该系统最大的缺陷之一。酵母菌株自身报告基因编码蛋白的背景渗漏、文库质粒的自结合活性(文库质粒AD—X能结合到DNA-bindingdomain上直接激活报告基因的转录)以及多个文库质粒共同转化一个酵母细胞等多种原因，能够在酵母筛库实验中造成假阳性。为避免这些假阳性，我们采用了如下的实验方法：(1)选用Clontech公司的BDMatchmakerTMyeastTwo．Hybridsystem，AHl09是该系统的宿主酵母菌株，AHl09具有LacZ、MELl、HIS3和ADE2四个报告基因，能有效降低因菌株报告基因编码蛋白的背景渗漏引起的假阳性；(2)实验先后进行了三次筛选排除假阳性：首先用SD／．His／．Leu／一Trpe三缺培养基进行初步筛，再将三缺培养基上直径大于2toni的单菌落点滴培养于SD／-His／．Leu／-Trp／Ade四缺培养基上进行二次筛选，最后将氨苄抗生素分离获得的文库质粒(AD—X)与诱饵质粒(BD．P6)共转化酵母进行第三次筛选阳性克隆，经过这三步筛选大大降低了假阳性率；(3)酵母质粒转化大肠杆菌DH5a后，先用pGADT7载体通用引物筛斑，将PCR条带单一特异的克隆送公司测序，这一步能减少因为多个文库质粒与诱饵质粒共转化一个酵母细胞而引起的假阳性；(4)分析测序确定的 万方数据浙江大学硕士学业论文与水稻黑条矮缩病毒P6互作的水稻寄主因子的筛选cDNA序列，看文库质粒是否以正确的读码框与AD融合，如果发现移码则当作假阳性排除(沈庆汤，2010)。我们利用双分子荧光互补实验进一步验证RBSDV-P6与筛选获得的P6．100蛋白的互作情况，最后确定P6蛋白-9水稻P6．100蛋白在植物细胞内可以直接互作。通过酵母双杂交系统和BIFC实验，我们确定水稻P6．100蛋白是与RBSDVP6互作的寄主因子，但这种互作在病毒侵染过程中对病毒．寄主间的博弈起何种作用，有待进一步研究。 万方数据浙江大学硕士学业论文与SRBSDVCP互作的白背飞虱介体因子因子筛选3与s衄sDvcP互作的白背飞虱介体因子筛选3．1材料与方法3．1．1实验材料实验室保存的感染南方水稻黑条矮缩病毒的感病叶片、健康水稻。健康和带毒的白背飞虱由本实验室保留繁殖。3．1．2菌株、质粒和cDNA文库大肠杆菌(Ecoli)DH5a由本实验室保存；酵母菌株AHl09、酵母双杂交质粒pGADT7．Rec、pGADT7和pGBKT7均购自Clontech。酵母双杂交用白背飞虱cDNA文库由本实验室构建并保存。3．1．3主要生化试剂Trizol购自Invitrogen公司；Taq聚合酶、dNTPMix、T4DNA连接酶、AMV反转录酶、RNA酶抑制剂(RNaseInhibitor)、DNA限制性内切酶等试剂购自TaKaRa公司；核酸标准分子量(LadderDNA)购自Fregments公司；葡萄糖、DMSO、醋酸锂等试剂购自Sigma公司；胰蛋白胨、酵母提取物购自Oxoid公司；HerringtestescarrierDNA、酵母生长培养基购自Clontech公司；其余试剂为国产分析纯(AR)。3．1．4南方水稻黑条矮缩病毒CP诱饵质粒的构建3．1．4．1引物的设计与合成根据GenBank里已经登录的南方水稻黑条矮缩病毒外壳蛋白CP的序列(登录号为JF803456)设计特异性引物(cP．F和cP．R)，由上海Invitrogen公司合成，引物序列如表3．1。表3．1构建诱饵所用引物序列Table3．1Sequencesofprimersforbaitconstruction 万方数据浙江大学硕士学业论文与SRBSDVCP互作的白背飞虱介体因子因子筛选3．1．4．2Trizol法提取感病水稻总RNA根据2．1．4．2节的方法提取感病水稻总RNA。3．1．4．3AMV反转录扩增获得eDNA以提取的总RNA为模板，利用TaKaRa反转录酶AMV进行反转录，反应体系如下：PCR仪中反应：RNA5×RTBu仃erdNTPMixRNaseInhibitorCP-RprimerAMV2V-L4oL2此0．5rtL2此2gL总体积25℃10min42℃1h4℃10min20止上述反应结束后，获得的即为南方水稻黑条矮缩病毒侵染的水稻eDNA。3．1．4．4利用Phusion高保真酶扩增CP片段以扩增得到的水稻cDNA为模板，利用Phusion高保真酶从水稻中扩增出目的片段，总体积为50uL，反应体系如下：5xPhusionGCbu疏r10mMdNlPSDMSOCP．FCP．RPhusion酶eDNA模板39虬忆虬此虬0●5●1l1O 万方数据浙江大学硕士学业论文与SRBSDVCP互作的白背飞虱介体因子因子筛选PCR反应条件：总体积98℃30sec98℃53℃72℃10sec30sec55sec72℃10min16℃5min1．0％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。3．1．4．5PeR产物纯化50LLL]}35cyclesj用Axygen公司胶回收试剂盒(AxygenDNAGelExtractionKit)纯化PCR产物。3．1．4．6PCR回收产物加APCR的产物经割胶回收后按如下反应体系进行末端加A反应回收产物10×bu缅玎dNTP25．5I．tL3vL1止总体积30儿反应条件为：72℃，放置30rain。3．1．4．7加A产物连PMD．18T载体将PCR的加A产物与pMD．1ST载体连接，反应体系(10pL)ioV：待连接片段pMD一18TT4ligase7uL1pL1肚L!Q兰坠连接绫韭速!些L总体积为lo止反应条件为：16"C连接反应过夜。 万方数据浙江大学硕士学业论文与SRBSDVCP互作的白背飞虱介体因子因子筛选3．1．4．8热击转化大肠杆菌DH5ct根据2．1．4．8节的方法转化大肠杆菌DH5a，37℃培养至红、白斑区分明显为止。菌落长出后挑取单菌落，用pMD一18T通用引物M13F和M13R筛斑(菌落PCR)，PCR反应体系为：dNTP(10mM)0．5uLM13F0．5止PCR反应程序为：M13R0．5皿ddH20Taq酶20．8LLL0．2[tL总体积25止94℃2min94℃50sec50℃50sec72℃1min50sec72℃10min16℃5min]}32cyclesJ将阳性克隆挑到含有相应抗生素的液体LB培养基，37℃振荡培养。3．1．4．9重组质粒的小量抽提根据2．1．4．9节的方法用AxygenPlasmidMiniprepKit提取质粒。3．1．4．10目的片段酶切取一个o．5mLeppendorf管，依次加入以下试剂：质粒DNA8LLL10x反应缓冲液1ttLNdel限制性内切酶o．5儿旦型H!医剑世卤翅鳖Q：主吐总体积10uL41 万方数据浙江大学硕士学业论文与SRBSDVCP互作的白背飞虱介体因子因子筛选37℃酶切消化3．4h后琼脂糖凝胶电泳检查结果，将质粒DNA酶切的目的片段用凝胶回收试剂盒回收，再连接到表达载体pGBKT7上，构建成pGBKT7-CP重组载体，并转化至大肠杆菌DH5a。3．1．4．11重组质粒的提取与鉴定1)用上述质粒提取试剂盒提取质粒。2)PCR鉴定取1皿质粒溶液作为反应模板，PCR反应条件同上，鉴定目的基因片段是否插入表达载体中。3)酶切鉴定提取的重组质粒用BamHI和NdeI限制性内切酶，37℃酶切消化3．4h后琼脂糖凝胶电泳检查结果。4)序列测定PCR、酶切鉴定阳性的重组载体进行基因序列测定，验证其基因序列及ORF的正确性。3．1．5诱饵蛋白在酵母中的表达检测3．1．5．1酵母菌株的活化取．70。C保存的酵母菌株AHl09在YPDA平板上划线，30。C培养3．5d。3．1．5．2诱饵质粒pGBKT7．CP(BD．cP)(SRBSDV)转化酵母菌株AHl09(小量法)根据2．1．5．2节的方法进行pGBKT7．CP转化酵母菌株AHl09．3．1．5．3诱饵蛋白对酵母毒性及其自激活活性的检测从SD／-Trp平板上，用无菌平头牙签挑出一个单菌落于5mLSD／-Trp液体培养基中，30℃220rpm振荡培养16h后测菌液OD600。同时，从SD／-Leu／-唧平板上，用小枪头挑一个单菌落溶于100gL的ddH20中吹打混匀，再吸15laL点滴到三缺(SD／．His／-Leu／．Trp)和四缺(SD／．His／-Leu／．Trp／-Ade)固体培养基，30℃培养箱倒置培养3．5d，观察BD．CP(SRBSDV)有无自激活活性。3．1．5．4Westernblot检测诱饵蛋白在酵母中表达情况1)从SD／-Trp平板上挑取新鲜的酵母菌落到5mL的SD／一Trp液体培养基中，30℃220rpm振荡过夜培养；4， 万方数据浙江大学硕士学业论文与SRBSDVCP互作的白背飞虱介体因子因子筛选2)取4mL长起来的酵母溶液于2mL离心管中，12000rpm离心10see；3)往收集的酵母中加入60pL2×的loadingbuffer，吹打混匀，再加热煮沸10min后，12000rpm离心1min，吸取上清至新的o．5mL离心管，获得酵母总蛋白；4)取20uL酵母蛋白提取液进行SDS．PAGE电泳；5)SDS．PAGE电泳结束后用湿法转膜，100V转膜70min；6)将上面的硝酸纤维素膜放入培养皿中，加入30mL5％的脱脂奶粉过夜封闭；7)用封闭液稀释一抗(稀释的倍数由单抗的效价决定)，室温下孵育1．5h；8)用PBST漂洗膜3次，每次10min；9)漂洗结束后加入30mL5％的脱脂奶粉，按一定比例加入二抗，室温下结合1．5h；10)用PBST漂洗膜4次，每次10min；11)漂洗后放入显色液中显色10．30min，用水洗去显色液，终止反应。3．1．6酵母双杂交实验3．1．6．1重组质粒的验证和酵母菌株的活化为了后续实验的顺利进行，需要对重组质粒pGBKT7一CP、pGADT7一CP及酵母菌株AHl09进行验证。对构建好的载体进行测序验证；对AHl09也要进行验证，在YPDA固体培养基划线培养，以提高酵母的活性。在确保构建的载体和实验菌株都没问题后，进行后续实验．3．1．6．2酵母感受态细胞的制备(LiAc法)根据2．1．6．2节的方法制备酵母感受态细胞。3．1．6．3共转化酵母菌株AHl091)制备酵母感受态细胞(方法如上)；2)在无菌的离心管中加入如下成分：pGADT7-Rec-eDNA(白背飞虱的cDNA文库)3p,LpGBKT7-CP质粒DNA(S10gL)6lag变性的HerringTestesCarrierDNA(10mg／mL)20uL3)加入600laL制备好的酵母菌AHl09感受态细胞；轻轻涡旋混匀；4)加入2．5mLPEG／LiAc溶液，轻轻涡旋混匀；5)30℃温育45rain，每15rain混合一次；43 万方数据淅Ⅱ大学《±学m论x-7SRBSDVCP§#∞自背1A舟体目}固}茆选6)加入160uLDMSO，混匀，42℃水浴20min，每10min混合一次：7)1000rpm离心5min，去掉上清，加入3mLYPDPIus液体培养基(试剂盒配带，可用普通的YPDA液体培养基替代)重悬细胞沉淀；8)30℃，250rpm振荡培养120min；9)1000rpm离心5min，去净上清，加入6mLo9％的无菌氯化钠溶液重悬细胞．3．1．7与SRBSDVCP蛋白互作的舟体因子饰选与SRBSDVCP蛋白互作的水稻因子筛选参照2I7节的方法。3．1．8酵母质粒的提取根据218节的试剂和方法进行酵母质粒的提取。3．1．9慎选的夼体因子的分高、测序并比对，确定蛋白类型根据219节的方法进行候选的寄主因子的分离、坝峙，序列比对、蛋白类型确定。3．2结果与分析3．2．1pGBKT7-CP诱饵载体的构建验证利用NdeI和BamHl内切酶对构建好的pGBKT7一CP质粒进行酶切验证，酶切产物的电泳结果显示切出了1674bp大小的CP目标条带和pGBKT7载体条带，说明诱饵载体构建正确(图31)，进一步将pGBKT7一cP质粒送去测序，序列比对结果证明CP读码框没有发生突变。口圈31诱饵载体pGBKT7-CP的蜂切鉴定M：l0kb核酸分子量标准；1用Ndel和BamHI酶切诱饵质粒． 万方数据浙Ⅱ大学硬士学业论支与SRBSDVCPi作的自背飞虱舟体园子目子捧选M：1．0kb棱酸分子量标准，1：用Ndel和Bamtll酶切诱饵质粒．Fkum0Resmctionenzymed"stionofpGBKT7-CPwithNdelandBamHIM1．0kbDNALadder；1．DigestionofpOBKT7-CPwithNdelandBamHl3．2．2诱饵蛋白对酵母毒性及自澈活活性的检测将pGBKT7一cP诱饵质粒转化到AHl09酵母菌中，涂布到固体培养基SD／-Trp上，30℃倒置培养。2-3夭后酵母长成正常菌落形态，挑取单苗落接种于5mLSD／-Trp液体培养基中，30℃230rpm振荡培养16h，两次重复试验测菌液OD600结果分别为118和l20，酵母生长正常，证明诱饵蛋白CP对酵母AHl09没有毒性。将pGBKT7一CP诱饵质粒与pGADT7空载体共同转化酵母AHl09，涂SD／-Leu，一Trp平板．30℃倒置培养约2-4天后能正常长出菌落，再次证明融合蛋白pGBKT7一CP对酵母菌没有毒性。从二缺平板上挑取单菌落点滴三缺和四缺平扳验证，发现pGBKT7．CP和pGADT7共转化的酵母在三缺(SD／-His／-Leu／-Trp)和四缺(sD^Hl“L“T州一Ade)平板上无法生长，与阴性对照结果相同，而阳性对照pGBKT7．P53和pGADT7-T共转化的酵母生长良好(如图3．2)。这些结果证明诱饵蛋白pGBKT7．CP对酵母没毒性，且没有自激活活性，适合做酵母筛库诱饵蛋白。sD№Ⅶ如pGBKT7一P53+pGADT7·TpGBKT7-Lam+pGADT7-TpGBKT7一CP+OGAD]F／001∽10210310‘∞·№·L∞啦-^“田3．2在三缺和四缺培养基上检潮诱_弭蛋白pGBKT7-CP自激活活性n夸虹e3-2IⅦemlouofsetf-activatiottofbaltpro试“pGBKT7-CPinsD，-Hi小k“。TmmediumandSD／-Hisd-Leu／-Trp／-Ademedium 万方数据淅Ⅱ大学硕士学业论文5SRBSDVCPi作的自背飞虱女啉园子园子缔选3．2．3诱饵蛋白在酵母中的表达检测为了分析SRBSDVCP蛋白在酵母中的表达情况，将pGBKT7．CP和pGBKT7空载体分别转化酵母AHl09菌株，提取相应酵母的总蛋白，利用SRBSDVCP特异单抗3FI(本实验室制备)作为一抗，进行westernblot分析，结果显示在pGBKT7一CP转化的酵母总蛋白中能特异性检测到一条约83KD大小的条带(如图3．3)，这与融合蛋白pGBKT7一CP大小(CP约63KD，pGBKT7载体标签蛋白约20KD)一致；而阴性对照(pGBKT7空载转化的酵母)未检测到该特异条带。这一结果可以表明，诱饵质粒pGBKT7．CP在酵母AHl09中能够融合表达。KD田3．3Westemblot检测CP蛋白在酵母中的表达1、3和5：分别转入pGBKT7-CP后提取酵母总蛋白：2、4和6：分别转入空载体pGBKT7后提取酵母总蛋白．Figure3．31)eteetionoftheCPexpressioninyeastAHl09strainbyWestcmblotLane1、3and5：ProteinsextractedfromyeaststransformedwithplasmidpGBKTT-CP；Lane2、4and6：ProteinsextractedfromyeaststramfoxedwithplasmidpGBKT73．2．4与CP蛋白互作的介体寄主因子筛选将白背飞虱eDNA质粒和诱饵质粒pGBKT7．CP共转化酵母菌AHl09后，所得的菌液涂布于SD／-His／一Leu／一Trp平扳上，30"C培养5-8d后，回收直径大于2mm的克隆。筛库共获得约131个候选克隆，在SD／-His／-Leu／-Trp／-Ade平板上2次筛选后，获得约109个候选克隆(图3．4)。 万方数据淅Ⅱ大学硕士学业论文与SRBSDVCP§作的自背飞§舟体因子因子掉选SD／-His／-Lea／-TrpSDl-Itisl-Leu／-TrpI-Ade田3．4酵母双杂交筛选与SRBSDVCP互作的介体园子Figure3．4Screeningofvcctorfactorsinteracting”mSRBSDVCPbytheyeast‰^ybrids“∞Ⅻ《experiment挑取SD／-His／-Lcu／-Trp／-Adc平板上生长快且颜色白的菌落扩繁，提取酵母质粒，并将所提取的质粒转化大肠杆菌DHSct，涂板LB／Amp，通过氨苄抗生素筛除诱饵质粒(pGBKT7一cP，载体筛选标记为卡郝霉素)，再经过菌落PCR鉴定(图3．5)。挑取只有单一条带的菌落摇菌，送菌液搠i序。将得到的82个序列通过NCBI网站的blastx翻译比对，将确定的序列总结归纳如表3．3。围3．5转化酵母质粒的大肠杆菌苗落PCR检测结果12、30、”、40和52：以5个不同的酵母苗落提取的质粒转化DH5a后进行菌落PCR拴测结果14：每种酵母质粒转化后拴划四个不同的大肠杆菌苗落；+：阳性对照；．：阴性对照。Figure3-5ResultsofPCRamplificationofE．colitransformedwithyeastplasmids 万方数据浙江大学硕士学业论文与SRBSDVCP互作的白背飞虱介体因子因子筛选12、30、33、40and52：PCRdetectionresultsofDH5atransformedwithyeastplasmidsrespectively．1—4：FourdifferentE．coficlonesforeachyeastplasmidweredetected．十：Positivecontrol：一：Negativecontr01．表3．3与SRBSDVCP互作的蛋白片段Table3．3ProteinsegmentsinteractingwithSRBSDVCP克隆编号Blast比对结果一致匹配物种性23．2gbIEUl79848．196％褐飞虱Nilaparvatalugensacfm1variant2mRNANilaparvatalugens39．3gbIADQ73875．1199％褐飞虱GAPDH3Nilaparvatalugens46．1gblFJ360695．199％褐飞虱L．striatellusmitochondrion，completegenomeNilaparvatalugens86．1dbjlBAD27585．1}97％HimetobiPviruscapsidproteinprecursor134．3reflXP002427615．1l67％体虱GMPsynthase，putativePediculushumanuscorporis135．1gbIABNll961．1I81％桑粉介壳虫putativeTCPIsubunitgammaMaconellicoccushirsutus3．3讨论白背飞虱是传播SRBSDV的主要昆虫介体。解析白背飞虱传毒的分子机制对防控南方水稻黑条矮缩病具有重要意义。本研究以SRBSDVCP蛋白为诱饵，通过酵母双杂交的方法筛选白背飞虱文库以获得能与该病毒CP互作的介体因子。通过酵母筛库最终获取了6个互作蛋白片段，这些片段分别属于肌动蛋白(actin)、磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde一3一phosphatedehydrogenase，GAPDH3)、HIPV(HimetobiPvirus)外壳蛋白、线粒体蛋白、GMP合成酶(GMPsynthase)以及TCP1伽玛亚基(TCP1subunitgamma)。已经有相关研究报道actin和GAPDH3蛋白参与了植物病毒和昆虫介体的互作48 万方数据浙江大学硕士学业论文与SRBSDVCP互作的白背飞虱介体因子因子筛选现胞吞作用又受actin细胞骨架结构和激活的蛋白激酶c(activatedproteinkinaseC，PKC)调控。近年来有报道水稻病毒，如水稻条纹病毒(RSV)和普通水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)通过植物的肌动蛋白细胞骨架进行转运(Yuaneta1．，2011；Suneta1．，2013)。磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH3)是一种多功能蛋白，不仅是糖酵解过程的一种关键酶，在生物膜上还能促进膜的融合、参与膜转运等(尚海旭等，2011)。Seddas等(2004)、Li等(2011)和Xu等(2013)先后报道GAPDH能与甜菜西黄病毒(beetwestemyellowvirus，BWYV)、水稻条纹病毒(RSV)和普通水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)的蛋白互作。据此推测病毒的CP与昆虫介体acitin和GAPDH互作可能与病毒在昆虫细胞中的运动相关。Xu等(2013)通过二代测序技术以及对病毒来源的小RNA(smallinterferingRNAs，siRNAs)拼接，在室内培养的灰飞虱(Laodelphaxstriatellus)、褐飞虱(Nilaparvatalugens)以及白背飞虱(Sogatellafurcifera)虫体内发现了HimetobiP病毒(HimetobiPvirus。HiPV)；如果沉默灰飞虱体内的AG02蛋白，能够引起虫体内HiPV病毒含量的提高，导致昆虫死亡率增加，这些结果为飞虱利用RNAi途径来防御HiPV病毒提供了有力的证据。进一步研究SRBSDVCP与HIPVCP的互作，能帮助我们进一步了解昆虫与病毒的防卫及进化关系。近年来有文章报道线粒体在防御病毒侵染过程中起到重要作用，许多病毒通过病毒蛋白与线粒体蛋白的互作来调控寄主细胞的应答机制(Ohmeta1．，2011)。Gao等(2013)研究发现一种称为环．GMP．AMP合成酶是针对HIV的免疫感应器，能够在第一次感染迹象时拉响警报，继而触发一种针对它的先天性免疫反应，该反应涉及干扰素的产生。SRBSDVCP与线粒体蛋白以及GMP合成酶互作，可能与介体识别和防御该病毒相关。进一步验证SRBSDVCP与介体白背飞虱的actin、GAPDH3、HIPVCP、线粒体蛋白及GMP合成酶的互作以及它们的互作机制，能帮助我们更深入地了解介体与病毒间的博弈关系，为最终有效的防控南方水稻黑条矮缩病毒病害打下基础。 万方数据浙江大学硕士学业论文参考文献1．AhlquistP，NoueiryA0，LeeWM，eta1．Hostfactorsinpositive—strandRNAvirusgenomereplication【J】JournalofVirology,2003，77(15)：8181-81862．AkitaF'HigashiuraA，ShimizuT’eta1．CrystallographicanalysisrevealsoctamerizationofviroplasmmatrixproteinP9—1ofRiceblack-streakeddwarfvirus【J】．JournalofVirology,2012，86(2)：746-756．3．AnandalakshmiR，MaratheR，GeX，eta1．Acalmodulin—relatedproteinthatsuppressesposttranscriptionalgenesilencinginplants【J】tScience，2000，290(5489)：142—1444．AnandalakshmiR，PrussGJ，GeX，eta1．Aviralsuppressorofgenesilencinginplants【J】ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences，1998，95(22)：13079·130845．AzuhataF'UyedaI，ShikataE．ConservedterminalnucleotidesequencesinthegenomeofRiceblack·streakeddwarfvirus[J】．TheJournalofGeneralVirology,I992，73：15936．BaRenJS，YoshinariS，HemenwayC．PotatovirusX：amodelsystemforvirusreplication，movementandgeneexpression[J】．MolecularPlantPathology,2003，4(2)：125—1317．BolJF．Roleofcapsidproteins[M]／／PiantVirologyProtocols．HumanaPress，2008：21-3I8．CallawayA，Giesman—CookmeyerD，GiliockET，eta1．ThemultifunctionalcapsidproteinsofplantRNAviruses[J】．AnnualReviewofPhytopathology,2001，39(1)：419·4609．CaoYPanF，ZhouQ，eta1．TransmissioncharacteristicsofSogatella#rcifera：avectorofthesouthernRiceblack-streakeddwarfvirus【J】．ChineseJournalofAppliedEntomology,2011，481314-1320．10．ChoiCW'QuF'RenT，eta1．RNAsilencing-suppressorfunctionofTurnipcrinkleviruscoatproteincannotbeattributedtoitsinteractionwiththeArabidopsisproteinTIP【J】JournalofGeneralVirology,2004，85(1I)：3415-342011．DeckeNM，TicchioniM，BernardA．EndocytosisofGPI-anchoredproteinsinhumanlymphocytesroleofglycolipid-baseddomains，actincytoskeleton，andproteinkinases【J】．TheJournalofCellBiology,1996，133(4)：791-79912．DistefanoAJ，HoppHE，delVasM．SequenceanalysisofgenomesegmentsS5andS10ofMal50 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万方数据浙江大学硕士学业论文附录A附录A本论文中所用术语缩写词中英文对照英文缩写英文全名中文名AdeAdenine腺嘌呤Ampampicillin氨苄青霉素BiFCbimolecularfluorescence双分子荧光互补实验complementationassaybpbasepairs碱基对CDNAcomplementaryDNA互补DNACPcoatprotein外壳蛋白dday天ddH20dobledistilledWater双蒸水DNAdeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸dNTPdeoxyribonucleosidetriphosphate脱氧核糖核苷三磷酸dsRNAdouble．S仃andedRNA双链RNAGaIgalactose半乳糖GFPgreenfluorescentprotein绿色荧光蛋白hhour小时HC-prohelpercomponent—proteinaseHC—pro蛋白Hi8Histon组蛋白KanKanamycin卡那硫酸霉素kbkilobase千碱基kDKilodolton千道尔顿LBLuria．BertanimediumLB培养基LeuLeucine亮氨酸mlnminute分钟ntNucleotide核苷酸PAGEpolyacrylamidegeleletrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳PBSphosphate-bufferedsaline磷酸盐缓冲液PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链式反应PTGSpost-transcriptionalgenesilencing转录后基因沉默RdRpRNAdependentRNApolymerase依赖于RNA的RNA聚合酶 万方数据浙江大学硕士学业论文附录ARifRifampicin利福平RNAribonucleicacid核糖核酸RT_PCRReversetranscriptionPCR反转录PCRSDSsodiumdodecylsulfate十二烷基磺酸钠SeCsecond秒siRNAsmallinterferingRNA小干扰RNATrpTryptophane色氨酸VSRviralsuppressorofRNASilencing病毒基因沉默抑制子58 万方数据浙江大学硕士学业论文附录B附录B本论文所用病毒名缩写及其中英文对照病毒缩写病毒全称中文名AMVAlfalfamosaicvirus苜蓿花叶病毒BWYVBeetwesternyellowvirus甜菜西黄病毒CMVCucumbermosaicvirus黄瓜花叶病毒PLRVPotatoleaf-rollvirus马铃薯卷叶病毒PRSVPapayaringspotvirus番木瓜环斑病毒PVAPotatovirusA马铃薯A病毒PVXPotatovirusX马铃薯x病毒PVYPotatovirusY马铃薯Y病毒RBSDVRiceblack．streakeddwarfvirus水稻黑条矮缩病毒RDVRicedwarfvirus水稻矮缩病毒RRSVRiceraggedstuntvirus水稻锯齿叶矮缩病毒RSVRicestripevirus水稻条纹病毒SRBSDVSouthernriceblack．streakeddwarfvirus南方水稻黑条矮缩病毒TCVTurnipcrinklevirus芜菁皱缩病毒TEVTobaccoetchvirus烟草蚀纹病毒TYLCVTomatoyellowleafcurlvirus番茄黄化曲叶病毒59 万方数据浙江大学硕士毕业论文附录C附录c常用缓冲液和培养基配方LB液体培养基Bacto一蛋白胨10g酵母抽提物5gNaCl10g]／P950ml水溶解，用2MNaOH调pHi7．0，再定容到1000mL，高压灭菌后保存。LB固体培养基在上述LB液体培养基中加入15g琼脂粉，高压灭菌后即可。麦康凯固体培养基每1000mL水中加48g培养基粉，煮沸溶解后分装三角瓶，高压灭菌后保存。YEP液体培养基蛋白胨10g酵母提取物10g氯化钠5g加950mL水溶解，用2MNaOH调pH至7．0，定容到1000mL。YEPI固体培养基在上述YEP液体培养基中h,A15g琼脂粉，高压灭菌后即可。YPDA液体培养基蛋白胨20g酵母抽提物10gJJ0900mL水溶解，用浓盐酸调pH至5．8，定容E935mL，高压灭菌后再加入50mL已灭菌的40％葡萄糖以及15mL已灭菌的o．2％Adenine，4℃保存即可。 万方数据浙江大学硕士毕业论文附录CSD／-Trp液体培养基MinimalSDBase26．7g—TrpDOsupplementO．74g加950mL水溶解，用2MNaOH调pH至5．8，定容至1000mL，高压灭菌后4℃保存。SD／-Trp固体培养基在上述SD／-Trp液体培养基中加入15g琼脂粉，高压灭菌后即可。SD／．Leu／．Trp固体培养基MinimalSDBase26．7g-Leu／-TrpDOsupplement0．64g加950mL水溶解，用2MNaOH调pH至5．8，定容至1000mL，再加入15g琼脂粉，高压灭菌后4℃保存。SD／-His／-Leu／．Trp固体培养基MinimalSDBase26．79-His／-Leu／-TrpDOsupplement0．62g加950mL水溶解，用2MNaOH调pH至5．8，定容至1000mL，加入15g琼脂粉，高压灭菌后保存。SD／．His／-Leu／-Trp固体培养基MinimalSDBase26．79—His／-Leu／-TrpDOsupplement0．62g加950mL水溶解，用2MNaOH调pH至5．8，定容至1000mL，加入15g琼脂粉，高压灭菌后保存。61 万方数据浙江大学硕士毕业论文附录CSD／一His／一Leu／．Trp／-Ade固体培养基MinimalSDBase26．7g—His／一Leu／一rrp／-AdeDOsupplement0．60g加950mLddH20溶解，用2MNaOH调pH至5．8，定容至1000mL，加入15g琼脂粉，高压灭菌后保存。1．0kbMarker(生工)100pL1．0kbMarker原液加入200pL6xLoadingBuffer，700¨LddH20，混匀保存于40C6xDNA上样缓冲液溴酚蓝二甲苯青FF甘油5xTBE缓冲液1、ris硼酸0．5MEDTA(pH8．0)54927．5920mL用水定容至1000mL，用时稀释10倍。0．25％O．25％30％10mg／mLEB在10mLddH20中加入100mgEB，混匀溶解后用铝箔包裹，保存于室温。碱性磷酸酶底物缓冲液lo％乙二醇铵50mL，加水至500mL，HCI调pH至9．8。4×浓缩胶缓冲液Tris12．1lgSDS0．8g加水溶解，用浓盐酸调pH至6．8，定容至200mL。62 万方数据浙江大学硕士毕业论文附录C4x分离胶缓冲液Tris90．83gSDS2g加水溶解，用浓盐酸调pH至8．8，定容至500mL。30％丙烯酰胺溶液：丙烯酰胺87．6g甲叉双丙烯酰胺2．4g用水溶解后定容至300mL，4℃保存。5×Tris一甘氨酸缓冲液：Tris15．1g甘氨酸94g10％SDS5mL用水定容至1000mL，用时稀释5倍。Western电转移缓冲液：甘氨酸2．9gTris5．8gSDS0．37g甲醇200mL加水定容至1000mL。