温度、水稻生育期和白背飞虱态对南方水稻黑条矮缩病毒传播的影响

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万方数据图表目录表1．1不同发育阶段的稻飞虱传播水稻病毒病的能力⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．5表2．1温度、水稻生育期和白背飞虱若虫龄期对介体获毒SRBSDV影响的三因素方差分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．17表3．1温度、水稻生育期和白背飞虱若虫成虫状态对介体接毒SRBSDV影响的三因素方差分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．22表4．1各处理感病稻苗内SRBSDV粒子滴度⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯30表4．2取食稻苗后白背飞虱的存活率和获毒率⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．30图1．1循回增殖型病毒在叶蝉体内的循回增殖方式⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6图1．2烟草花叶病毒在番茄植株中的扩散过程⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6图1．3南方水稻黑条矮缩病毒病症状⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7图2．1温度、水稻生育期和白背飞虱若虫龄期对白背飞虱若虫取食带SRBSDV稻苗24h后的获毒率的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．18图3．1温度、水稻生育期和自背飞虱成虫状态对带毒白背飞虱成虫接毒率的影响．23图4．1琼脂糖凝胶电泳分析试验用感病稻苗经RT-PCR检测结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．29图4．2琼脂糖凝胶电泳分析取食感病稻苗后48h的白背飞虱经RT-PCR检测后的结果．．．。．．．．．．．．．．．．．．．．．．。．．。．．．．．．．．．．．．．。。。．．．。．。．。。。．。。．．。．．．。．．。。。。。．。。。。．．．。。。。。。。。。．．．．．．．。。。。。。。．．．．．．．．．。。．．．．．．．．．．．．．。。。。。。。．．．．．．．．．。：31]IVI 万方数据中国农业科学院硕士学位论文第一章引言第一章引言1．1白背飞虱稻飞虱是我国水稻上的主要害虫之一，主要通过刺吸、产卵、传播病毒病等方式为害水稻(曹婷婷，2013；沈君辉等，2003；刘芹轩等，1982)。稻飞虱通过口针刺探和刺吸直接危害水稻，并分泌凝固性唾液形成口针鞘留在稻株内，影响稻株正常的光合作用，当飞虱种群密度较大时，可造成稻苗青枯萎蔫直至死亡(王荣富等，1998)；稻飞虱产卵时刺破叶鞘或叶片表皮，使稻株失水，还可引起菌核病等病害，排泄物滋生的霉菌严重影响稻苗的光合和呼吸作用(王思铭等，2011；沈君辉等，2003)；一些水稻病毒病还可随飞虱取食进行传播，如褐飞虱(Nilaparvatalugens)传播的水稻草状矮化病毒(Ricegrassystuntvires，RGSV)病(林丽明等，1999)和水稻齿叶矮缩病毒(Riceraggedstuntvirus，RRSV)病(林奇英等，1984)、灰飞虱(Laodelphaxstriatellus)传播的水稻条纹叶枯病毒(Ricestripevirus，RSV)病(林奇英等，1990)和水稻黑条矮缩病毒(Riceblack-streakeddwarfvirus，RBSDV)病(陈声祥等，2005)、白背飞虱(Sogatellafurciera)传播的南方水稻黑条矮缩病毒(Southemriceblack-streakeddwarfvirus，SRBSDV)病(Zhoueta1．，2008)。水稻是中国14亿人口乃至全球人口的主要粮食作物(王艳青，2006；Macleaneta1．，2002)，水稻产量的高低直接影响人类的温饱问题，而水稻病虫害是影响水稻产量的主要因素。目前，由白背飞虱作为唯一传播介体的南方水稻黑条矮缩病毒病已成为水稻上的主要病害，此病毒对各生育期稻苗均有致病能力，发病严重的田块整田绝收，严重威胁着我国的水稻生产，己引起人们的广泛关注(周国辉等，2008)。白背飞虱属半翅目(Homoptera)飞虱科(Delphacidae)，一年发生2～11代，在不同地区完成一个世代所需时间不同，平均约30d左右，每世代经历卵、若虫、成虫三种虫态。白背飞虱卵香蕉型，多产于水稻叶鞘或叶片中脉组织内，初产卵乳白色，后变淡黄色并可见红色眼点，卵期约7d；若虫分5龄，若虫期约为14d；成虫期约为12d(黄次伟等，1991；罗肖南等，1986；刘芹轩等，1982)。白背飞虱成虫翅二型，分为长、短翅两类，但短翅型雄虫很少见(沈君辉等，2003；胡国文等，1981)。白背飞虱具有迁飞习性。长翅型白背飞虱为迁出型，短翅型白背飞虱为居留型。当环境条件适宜、营养来源充足时可见短翅型雌虫，若田间出现大量的长翅型白背飞虱，则意味着白背飞虱的迁入或迁出(姚青等，1999)。自背飞虱多食性，除取食水稻外还可依玉米等禾本科作物及杂草为寄主，但仅能完成世代发育(黄次伟等，1985)。温度显著影响白背飞虱种群的增长，在15～30℃之间，白背飞虱均能正常发育，28℃为白背飞虱发育的最适温度，当温度高于35℃或低于20℃均不利于其生长发育和繁殖(冯炳灿等，1985)。白背飞虱对不同生育期稻苗的取食量不同，其内禀增长率以取食圆杆拔节期稻苗为最大，分蘖期和秧苗期次之，再者为孕穗期，随着稻苗苗龄的增长，稻株内营养物质越来越不利于自背飞虱的生长发育和繁殖(黄次伟等，1991)。白背飞虱对不同水稻品种的取食量差异尤为明显，甚至有些水稻品种对白背飞虱表现出抗性(邓伟等，20121肖英芳等，2001)。水稻叶鞘表皮结构，主要表现在叶鞘表皮的刚毛、刺毛、硅细胞的形状及排列方式、木栓层及蜡被层的综合效应，决定了水稻品种对白背飞虱的抗性(叶海芳，1989)，同时，水稻对白背飞虱的抗性还与稻株内 万方数据中国农业科学院硕士学位论文第一章引言总氮和游离氨基酸的含量有关(俞晓平等，1989)。白背飞虱雌雄成虫全期取食量相近，羽化后第15d取食量达到高峰，日均取食量随发育阶段而异，成虫取食量大于若虫，若虫取食量又随龄期的增加而增大(黄次伟等，1993)。一种类似于水稻黑条矮缩病(Riceblack-streakeddwarfdisease，RBSDD)的水稻病害于2001年在广东省阳西县首次发现，此病害表现出不同于RBSDD症状的高位分蘖和倒生气生须根(Zhouetal．，2008)。据报道此病害已在越南中南半岛及我国南方广大稻区大发生，并扩散至日本、韩国等地(Ha甜a1．，2009；Zhoueta1．，2008；Matsukuraeta1．，2013)。调查发现不同发病田块发病程度各异，轻者发病率不足2％，重者几乎全田发病，并造成整田绝收(Zhoueta1．，2008)。由于SRBSDV的S7～S10核酸序列与斐济病毒属(Fij'ivirus)第二组成员水稻黑条矮缩病毒(Riceblack-streakeddwarfvirus，RBSDV)和玉米粗缩病毒(Maizeroughdwarfvirus，MRDV)对应的基因组片段序列一致性(<85％；Dist6fanoeta1．，2002)此病原被建议划分为斐济病毒属第二组成员的一个新种(Zhangeta1．，2008)。由此病害的发病区域及此病毒基因组的S9和S10序列与RBSDV基因组核苷酸序列的一致性(<80％)将此病害命名为南方水稻黑条矮缩病毒(Southemriceblack．streakeddwarfvirus，SRBSDV；Zhoueta1．，2008)。SRBSDV海南和广东分离物的基因组全序列的测定从分子方面对SRBSDV这一斐济病毒属新种分类进行支持(Wangeta1．．2010)。1．2．1南方水稻黑条矮缩病毒病原特性电子显微镜下观察感病稻株超薄切片，发现稻株韧皮部细胞内存在大量大小相当于细胞核的病毒基质。病毒基质无明显边界，其内密集分布着病毒粒体。在未成熟的病毒基质中存在管状结构，病毒粒体排列在管状结构中；成熟的病毒粒子球状，直径约70～75am，呈晶格状排列于病毒基质中。病毒原质和包裹病毒粒体的小管结构形成电子致密内含体(Zhoueta1．，2008)。从基因组结构与功能来看，SRBSDV的基因组共由10条dsRNA组成，依分子量大小或电泳迁移速率分别命名为s1、s2、⋯、S10(周国辉等，2008；Zhangeta1．，2008)，分别编码P1、P2、P3、P4、P5．1、P5—2、P6、P7．1、P7．2、P8、P9—1、P9—2、P10共13种蛋白(Heeta1．，2013；李向阳等，2014)。在病毒的植物寄主水稻和昆虫寄主白背飞虱内P3、P7．1、P9．2的表达量均较高，在另一寄主玉米内也表现出相同的基因表达方式，这说明此三种蛋白对SRBSDV的侵染至关重要(Heeta1．，2013)。由目前对水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)的研究及RBSDV与SRBSDV的同源性推测，Pl、P2、P3、P4、P8、P10为病毒编码的结构蛋白；P6、P7．1、P7．2、P9．1、P9—2为病毒编码的非结构蛋白(贺鸣等，2013)。通过电子共聚焦显微镜可以观察到SRBSDv病毒原质包含一个由病毒RNA、P6和P9．1聚集形成的颗粒状区域，及一个由病毒RNA、病毒粒子、P5和P6聚集成的丝状区域，此丝状区域可能是病毒粒子复制的场所，丝状包含物主要由P5形成，颗粒状包含物主要由P9．1形成，P5与P9．1的相互作用需要P6的参与，而P5、P6和P9．1的共同作用是病毒成功侵染所必需的(Maoeta1．，2013)。采用农杆菌介导技术得出SRBSDVP6蛋白为寄主RNA沉2 万方数据中国农业科学院硕士学位论文第一章引言默抑制子，在沉默的起始和信号传导中起作用，靶标为蛋白，抑制寄主相关基因沉默，促进病毒复制(卢嫣红等，2011)。SRBSDVP7．1为白背飞虱体内包裹病毒粒子的管状结构蛋白，可能为病毒在细胞内运输和扩散的通道；P9一l形成病毒原质，是病毒粒子复制与组装的场所(郑爱玲，2012)。针对SRBSDVP7．1采用RNA干扰技术构建植物表达载体，通过农杆菌导入法得到转基因水稻，但此转基因水稻并不抗病；以子一代稻苗进行传毒试验，发现白背飞虱获毒率显著降低，这表明P7．1不影响病毒在稻苗内的传播，却阻碍病毒在白背飞虱体内扩散(戴兆基等，2012)。S10为斐济病毒最保守的片段之一，编码的P10为外壳蛋白，影响病毒的致病性和介体传播特性(Zhoucta1．，2008)。由同源病毒RBSDV的基因功能推NSRaSDV的Pl蛋白为RNA复制酶，P2为核心蛋白，P4为外壳13一刺突蛋白，P3为内壳蛋白，P8为一个假定的核心蛋白(贺鸣等，2013)。由于斐济病毒属各病毒成员具有一定比率的核苷酸同一性，成员间各基因组片段相比较发现，SRBSDV的s1、S2和S10片段相对保守，s5、s6片段最不保守，说明斐济病毒属成员中各基因片段是独立进化的，易于变异的片段决定了病毒的寄主范围(沈灿章等，2013)。同时，介体昆虫也决定虫传病毒的传播，因为病毒适应新的植物寄主的速度远高于介体昆虫适应新植物寄主的速度，病毒粒子与介体昆虫的作用方式约束了病毒核酸由突变或重组产生的基因多样性(Power，2000)。1．2．2白背飞虱的传毒特性1．2．2．1最短获毒期和量短接毒期最短获毒期是指介体昆虫获得病毒所需的最短取食时间，最短接毒期是指介体昆虫传播病毒所需的最短取食时间(Arneodoeta1．，2002)。不同发育阶段白背飞虱的获毒时间不同，白背飞虱初孵若虫获毒时间为11～19min、三龄若虫6～12min、五龄若虫3～9min、长翅成虫2～8min、短翅成虫2～8min，以最短获毒时间饲毒后的白背飞虱经过循回期后其获毒率达100％；不同发育阶段的白背飞虱对不同生育期稻苗的接毒取食时间也不同，五龄若虫、长翅白背飞虱和短翅白背飞虱在三叶一心期稻苗上的接毒时间分别为4。8min、5～10min、6～11min；在分蘖初期稻苗上的接毒时间分别为5～10min、7～12min，经过接毒时间和循回期后白背飞虱的传毒率为100％(曹杨等，2011)。可见，不同发育阶段白背飞虱的获毒时间随虫龄的增加而缩短，而白背飞虱五龄若虫对三叶期和分蘖期稻苗的接毒取食时间均最短。另有研究报道白背飞虱成、若虫最短获毒期均为5min，随着获毒取食时间延长，获毒率逐渐提高，取食带毒稻苗24h后的白背飞虱成、若虫获毒率分别达25．9％和50．0％；白背飞虱成、若虫的最短接毒期均为30min，随着接毒取食时间延长，接毒率逐渐提高，接毒24h后白背飞虱的接毒率为42．9％和54．3％。可见，经过24h后的接毒或获毒时间后，白背飞虱成虫的传毒率约为获毒率的二倍，而白背飞虱若虫的传毒率和获毒率几乎相等(Pueta1．，2012)。还有研究发现白背飞虱取食带毒稻苗5d后，获毒率达40％(Matsukuraeta1．．2013)。1．2．2．2循回期循回期是指介体昆虫从获得病毒到能传播病毒所需的时间(Anhalteta1．，2008)。SRBSDV在 万方数据中国农业科学院硕士学位论文第一章引言白背飞虱体内的循回期为6～14d，多数为8～12d；循回期后，多数个体终身带毒，但部分个体呈间歇性传毒，间歇期为2～6d(Pueta1．，2012)。另有研究报道SRBSDV在白背飞虱体内的循回期随温度和白背飞虱发育龄期而异，20℃时在初孵若虫、三龄若虫、五龄若虫、长翅成虫及短翅成虫体内的循回期分别为11～19d、10～17d、8～16d、6～14d和5～12d，26℃时循回期分别为6～9d、5～7d、3～6d、4～8d和3～6d，32℃时循回期分别为11～17d、10～16d、9～16d、4～6d和4～5d，在不同温度下SRBSDV的循回期几乎均随白背飞虱龄期的增大而缩短(曹杨等，2011)。1．2．2．3单头白背飞虱传毒株数初孵白背飞虱取食带毒水稻2d后，整个世代内可使22～87株稻苗感病，单头白背飞虱平均可使48．3株水稻感病(曹杨等，2011)。带毒白背飞虱单头成虫在5d内可感染稻苗8～25株，雌、雄成虫平均感染稻苗17．6和15．3株(Pueta1．，2012)。不同研究者报道的白背飞虱传毒参数的差异，可能由毒源水稻的差异引起(Matsukuraeta1．，2013；Pueta1．，2012；曹杨等，2011)。虽然白背飞虱的迁飞习性促进了SRBSDV的大面积传播，但是不同地理种群SRBSDV的基因组并非完全相同，广东和海南SRBSDV种群的核酸相似性和氨基酸相似性分别为97．3％和96．8％(Wangeta1．，2010)。Matsukura等(2013)、Pu等(2012)和曹杨等(2011)所采用的带毒稻苗分别来自日本、广东和湖南，因此毒源稻菌上的SRBSDV可能存在种内差异。同时，不同研究者所采用的白背飞虱的生理状态可能存在差异。温度、湿度及白背飞虱种群密度等外界因素均影响白背飞虱的存活率、世代时间及生殖力等各种生命参数(黄次伟等，1993)。此外，不同研究者对白背飞虱龄期、水稻生育期等试验因子的判定不能确保完全一致。这些均会影响白背飞虱对SRBSDV的传毒参数。1．2．2．4白背飞虱传播SR髓W的方式以病毒粒子在介体昆虫内的循回情况将病毒的传播模式分为非循回型传播和循回型传播两类(旋艳等，2013；Andret—Linketa1．，2005)。非循回型传播的病毒其昆虫介体获毒后能直接进行病毒传播，但传毒能力持续时间较短(Uzesteta1．，2007；Manoussopoulos，2001)，循回型病毒粒子在介体内的滞留时间较长，介体昆虫获毒后不能立即将病毒粒子传到寄主植物内，需经过一定时间的循回期，但一旦开始传毒，能保持较长时间的传毒能力(Hogenhouteta1．，2008；Cohenetal．，1989)。以病毒粒子在介体内的滞留时间和滞留位点将非循回型病毒进一步分为非持久性传播和半持久性传播病毒(Ngeta1．，2006；Palacioseta1．，2002)。非持久性传毒也称口针携带式传毒，介体昆虫取食毒源后，口针上的病毒粒子不进入介体内，直接随昆虫取食进行传播，这种传毒方式的介体获毒所需时间短，传毒所需时间也较短，但病毒传播能力不持久(Hohn，2007：Palacioseta1．，2002)；半持久性传毒也称前肠保留式传毒，昆虫介体取食毒源后需经过一定的时间才具备传毒能力，病毒传播时间相对较长(Froissarteta1．，2010；Ghanimeta1．，2001)。依病毒粒子在介体内是否增殖进一步分为循回增殖型和循回非增值型病毒(Hibino，1996：仵发静等，2012)，循回型传毒又称持久性传毒(Hogenhouteta1．，2008)，病毒粒子必须穿越介体昆虫的中肠屏障和唾4 万方数据中国农业科学院硕士学位论文第一章引言液腺屏障才能随介体取食传播，此类介体昆虫获毒后可终身带毒(Hohn，2007：Garyeta1．，2003)。3种稻飞虱均以循回增殖型方式传播水稻病毒，但不同发育阶段的介体对病毒的传播能力存在差异(表1．1，杨德卫和叶新福，2011；叶永发，2007；林奇英等，1991；谢联辉等，1991，1980：阮义理等，1981)。SRBSDV不能经水稻种子传播(王康，2010)。表1．1不同发育阶段的稻飞虱传播水稻病毒病的能力Table1．1Virustransmissionabilityofplanthoppersatdifferentstadium采用昆虫细胞培养技术和免疫荧光标记的方法研究发现SRBSDV在白背飞虱中肠和唾液腺内复制(郑爱玲等，2012)，另有研究发现灰飞虱能携带南方水稻黑条矮缩病毒，却不能传毒(Pueta1．，2012)，采用荧光免疫技术发现SRBSDV在灰飞虱体内由于不能穿越中肠屏障而无法到达唾液腺，进一步验证灰飞虱仅能获得SRBSDV而不能传播SRBSDV(Jiaeta1．，2012)。1．2．3SRBSDV在白背飞虱和水稻内的传播机制白背飞虱和水稻分别是SRBSDV的昆虫寄主和植物寄主，病毒在二者体内均以持久循回增殖型方式复制增殖(Pueta1．，2012)。采用荧光定量PCR技术对SRBSDV在不同寄主(水稻、玉米和白背飞虱)内的表达水平进行了实时荧光定量检测，发现SRBSDV的13种蛋白在不同寄主内的表达方式相似，推测SRBSDV在昆虫寄主和植物寄主内具有相同的侵染方式(Heeta1．，2013)。介体昆虫取食带毒植株后，病毒粒子随口针进入虫体内，然后进入中肠肠腔，克服中肠上皮细胞进入血淋巴，随体液循环扩散至唾液腺，并在唾液腺内大量增殖，进而随介体昆虫取食将病毒传给植物寄主(Jiaeta1．，2012；Saskiaeta1．，2008，图1．1)。 万方数据中国农业科学院硕士学位论文第一章引言图1．1循回增殖型病毒在叶蝉体内的循回增殖方式Fig．1．1Virustransmissioninaleafhopperbyacirculativeandpropagativemanner带毒昆虫取食寄主植物后，病毒先通过胞间连丝移动到维管束鞘，通过韧皮部进行长距离运输，先到达植物根部，再由根部到达植株心叶，然后病毒从植株形态学的上端向下端扩散，最终使整株植物带毒(谢联辉等，2011：图1．2)。图1．2烟草花叶病毒在番茄植株中的扩散过程Fig．1．2Tobaccomosaicvirustransmissioninatomatoplant1．2．4SRBSDV检测方法1．2．4．1形态学观察植物被病毒感染后会表现出病害症状，从形态上进行植株病害类型和发病情况的鉴定是许多植物病毒病诊断的常用方法(谢联辉等，1984；裘维蕃，1984)。被SRBSDV感染的不同生育期稻苗表现出不同的症状，最明显的特征就是越幼嫩的稻苗矮缩越明显。不同生育期感病稻苗典型的病害特征是严重矮缩，叶尖卷曲，叶片僵直，茎秆和叶背上有蜡状突起，茎节间存在倒生气生须根，分蘖增多，根系褐色且不发达(周国辉等，2008，2013；Hoangeta1．。2011；图1．3)。6 万方数据中国农业科学院硕士学位论文第一章引言图1．3南方水稻黑条矮缩病毒病症状A：植株矮化；B：叶尖卷曲；C：叶尖卷曲、叶片僵直；D：茎秆生有蜡状突起Fig．1．3Symptomsofsouthernriceblack—streakeddwarfdiseaseA：stuntplants；B：twistofleaftips；C：twistandstiffleaves；D：waxyswellingsonthestalks由于RBSDV与SRBSDV发病症状相似，病株高位分蘖和倒生气生须根是南方水稻黑条矮缩病的典型症状(周国辉等，2008)，但另有研究者认为茎杆上白色蜡状突起才是南方水稻黑条矮缩病的独特症状(沈灿章，2013)。1．2．4．2血清学检测血清学反应就是利用抗原与抗体的特异性结合产生的颜色反应来证明病毒的存在，此方法采用固相吸附与免疫酶相结合的技术，使酶与抗体相结合形成酶标记抗体，与相应的抗原反应时形成酶标记的免疫复合物，酶遇到相应底物时降解底物产生颜色反应，从而凭肉眼即可观察实验结果(Engvalleta1．，1972)。用于SRBSDV检测的血清学方法是酶联免疫吸附测定法(enzyme—linkedimmunosorbentassay，ELISA)。利用原核表达的方法可以得到SRBSDV的P10蛋白，并制备PIO蛋白的抗血清，构建出检测SRBSDV的酶联免疫方法(张蔚明等，2011)。此方法可以检测不同来源的感病水稻和介体昆虫，适合SRBSDV的田间诊断。但是，由于RBSDV的S10与SRBSDV的S10在氨基酸水平上具有较高的同源性，所以PIO蛋白的抗血清对这两种病毒并无特异性。RBSDV和SRBSDV的P8抗血清能同时检测这两种病毒，但由于二者同源性较高，所表达的P8存在免疫学交叉反应，因此也不能区分这两种病毒(吴为奇等，2012)。1．2．4．3分子生物学检测目前，检测SRBSDV常用的分子生物学方法主要有反转录环介导等温扩增法(R1：L舢仰)，一步法反转录PCR(RT-PCR)和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)。RT-LAMP是利用DNA聚合酶和依目的片段的6个不同区域设计的4条特异性引物在恒温(65"C左右)条件下进行核酸扩增的方法(Notomieta1．，2000)。RT-LAMP是采用反转录与环介导等温扩增技术相结合对RNA模板进行扩增的方法。目前已建立检测9种水稻病毒病的RT-LAMP方法，其灵敏度并不低于RT-PCR方法(Dungeta1．，2010)。由SRBSDV的s9片段的保守区域设计引物，构建了能区分SRBSDV和RBSDV的RT-LAMP方法(杜琳琳等，2012)。由于RT-LAMP技术操作简便，结果易于观察，整个检测过程不需要精密仪器，较适用于SRBSDV7 万方数据中国农业科学院硕士学位论文第一章引言的田间诊断。采用SRBSDV和RBSDV的$10片段也建立了能区分这两种病毒的RT-LAMP检测方法(吴为奇等，2012)。聚合酶链式反应是由Kau等人于1985年研发的新技术。一步法RT-PCR是在聚合酶链式反应的基础上以RNA为模板，在反转录酶、DNA聚合酶、特异性引物等的作用下扩增，实现反转录与PCR一步完成。通过琼脂糖凝胶电泳、EB染色后即可观察到目的条带，从而实现对样品的定性检测。由于SRBSDV基因组的S10片段保守性较强，采用RT-PCR对SRBSDV的检测时大都以S10序列(EU784840)为基础设计引物。据此已设计出一对能够快速检测感病水稻和带毒白背飞虱的引物(上游引物5'-cgcgtcatctcaaactacag·3’，下游引物5'-tttgtcagcatctaaagcgc一3’)，目标片段682bp(王强等，2010)。另有研究者也设计出一对用来快速检测感病水稻组织的引物序列(上游引物5’．ttaagtttattcgcaacttcgaag．．3’，下游引物5’一gtgatttgtcagcatctaaagcg-3’)，目标片段为477bp(周倩等，2010)。能同时检测RBSDV和SRBSDV的RT-PCR方法也被建立，分别以各自的外壳蛋白S10基因序列设计引物I(RBSDV上游引物：5'-actaagcttatttgctacctccaaac．3’，RBSDV下游引物：5'-attagtrcgcaamgtggacaaactg--3’(R=A，G；M=A，C)；SRBSDV上游引物：5’．cgctttagatgctgacaaatcactttta一3’，5'-ctccttttctaagtgcagacagtcc一3’)，目的片段分别为592bp和142bp(吴为奇等，2012)。根据RBSDV和SRBSDV的S9序列(Eu523359)也设计出两对简并引物(RBSDV上游引物：5'-grtagacaggcaaaymtaagcgt-3’，SRBSDV下游引物：5'-ttacaycaagcactttgcgagg．3’，下游引物：5'-ggattacaacahacacamcgaaa--3’)，这两对简并引物具有前引物各异、后引物相同的特点，可以同时、特异地检测这两种病毒(季英华等，2011)。实时荧光定量PCR技术即RT-qPCR，是由美国AppfiedBiosystems公司于1996年研发出来的一种核酸定量技术，这种技术在RT-PCR的基础上加入一种与目的片段特异结合的荧光物质，通过对荧光物质实时监测形成的扩增曲线，计算出模板DNA或RNA的拷贝数。1999年首次将RT-qPCR技术应用于植物病原的研究(B6hmeta1．，1999)。利用RT-qPCR研究感染SRBSDV水稻的病毒粒子滴度和病毒所在组织与白背飞虱获毒的关系发现，在27℃条件下，带毒白背飞虱取食水稻7d，20d后检测水稻，发现水稻叶鞘中病毒量激增，并可观察到典型的植株矮缩与叶尖卷曲症状(Matsukuraeta1．，2013)。采用RT-qPCR对不同寄主内SRBSDV全基因组mRNA的相对表达水平进行定量检测，发现在白背飞虱、水稻和玉米内P3、P7—1和P9—2的表达量均较高，P6和P10的表达量相对较低(Heeta1．，2013)。以同一株感病水稻和同一头带毒白背飞虱为材料，比较ELISA和RT-PCR两种检测SRBSDV的方法的灵敏性，通过对样品进行稀释发现RToPCR检测方法较Dot-ELISA方法灵敏；但是二者对样品原液的检测结果一致(刘珊珊等，2014)。ELISA方法不需要精密的仪器，成本较低，因而更适用于大量样品的检测。由于SRBSDV和RBSDV的S10序列氨基酸同源性较高，所以采用S10片段序列设计的抗血清无法区分这两种病毒；而RT-PCR方法可以凭借特异性引物高效特异地检测SRBSDV。采用SRBSDV的S9序列设计引物，比较这几种常用分子检测方法的灵敏性，发现RT-LAMP的灵敏性是RT-PCR的10倍，RT-qRCR的灵敏性是RT-PCR的100倍，而且RT-qPCR检测方法还可以准确测定病毒RNA的拷贝数(杜琳琳等，2014)。 万方数据中国农业科学院硕士学位论文第一章引言1．2．5影响白背飞虱传播sRBsDV的因子按植物病毒能否经介体昆虫的卵进行传播将其传播方式分为垂直传播和水平传播两类(Naulteta1．，1989；Sylvester，1985)。垂直传播是指病毒粒子可经母代传给子代，即卵传，如灰飞虱可经卵将RSV传给下一代(谢联辉等，1991；林奇英等，1991)；水平传播是指病毒粒子不能经卵传播，如白背飞虱传播的SRBSDV，下一代自背飞虱通过取食毒源植物才能获毒(Pueta1．，2012)。病毒的水平传播过程包括介体昆虫取食感染病毒的寄主植物后获得病毒，即获毒过程；携带病毒的介体昆虫经取食将病毒传给健康的寄主植物，即接毒过程。植物病毒的传播就是病毒介体的获毒与接毒过程。影响介体昆虫获毒与接毒过程的各种因子均将影响病毒的传播。依靠介体昆虫传播的植物病毒其植物寄主由介体昆虫决定，即植物病毒的扩散传播被传毒介体限制，植物病毒与其介体的特异性互作要高于病毒与寄主的特异性，比如很多植物病毒虽然只有几种传毒介体，但却有较多的寄主种类，病毒对新的植物寄主的适应速度要高于传毒介体对寄主的适应速度(Power，2000；Powereta1．，2000)。白背飞虱可以在水稻、玉米、稗草等禾本科植物上取食，但水稻是其最适宜的寄生(黄次伟等，1985)。虽然SRBSDV是首先在水稻上发现的，但研究发现，SRBSDV能够侵染白背飞虱的其他寄主，比如玉米(蒲玲玲，2012)，稗草、看麦娘和油草(曹杨等，2012)。但是，带SRBSDV的白背飞虱在不同寄主间表现出不同的传毒率，这可能与白背飞虱的取食偏好性有关(Power，2008：何晓婵等，2014)。不同品种水稻氮含量、氨基酸与可溶性糖的种类和数量存在差异(肖英方等，2001：刘光杰等，1995，1993；吴刚等，1993；)，而且不同品种间叶片蜡被层、木栓组织等表皮结构及内部维管束细胞壁等结构不同(邓伟等，2012；叶海芳等，1989)，这些因素均影响白背飞虱对水稻的选择，从而影响SRBSDV的传播，使不同品种水稻对SRBSDV表现出不同的感病率。有研究报道白背飞虱对不同品种水稻的传毒率不同，认为可以依水稻品种对SRBSDV的敏感性进行抗病毒水稻品种的筛选(曹杨等，2012)。研究24个水稻品种对SRBSDV的抗性，并按照全国水稻病毒病科研协作组统一制定的抗性分级标准，得到了3个中抗品种(刘琳琳等，2012)。苗期到返青分蘖期是水稻对病毒病最敏感的阶段(谢联辉等，1988)。稻苗被SRBSDV侵染时生育期越早，感病稻苗症状表现就越明显(Zhoueta1．，2013)。还有研究报道稻苗苗龄越低，带毒白背飞虱的传毒力越强(曹杨等，2012)。说明不同生长状态的稻苗对白背飞虱和病毒的抗性不同，使带毒白背飞虱对不同生育期的稻苗的传毒能力不同。白背飞虱的迁飞借助气流进行，迁飞过程中处于禁食状态。对带毒白背飞虱长翅成虫进行不同时间的饥饿处理后测定白背飞虱的传毒率和传毒株数，发现带毒白背飞虱在禁食24h或更长时间时，传毒能力下降、传毒株数显著减少(曹杨等，2012)。这说明南方水稻黑条矮缩病的发生面积和发生严重程度与白背飞虱的迁飞路线及迁入地点有关。温度影响多种传毒介体的传毒效率，主要是因为不同温度下，介体昆虫的取食等生理行为受到影响，其发育历期发生变化(冯炳灿等，1985；罗肖南等，1986)，病毒在介体内的循回期也发生变化(曹杨等，2012)，温度的升高使介体内解毒酶的活性增强或活性丧失，而影响病毒粒子的复制增殖(仲崇翔，2007)。带SRBSDV稻苗上孵化2d的白背飞虱在不同温度下生命参数发生变化，20℃下带毒白背飞虱若虫龄期延长，存活率下降，取食过带毒稻苗的白背飞虱在25℃9 万方数据中国农业科学院硕士学位论文第一章引言时成虫寿命变短，28。C时产卵量下降(Tuetal．，2013)。温度影响昆虫的取食等行为，25"C时Culisetaincidens(Diptera：Culicidae)的取食率高于20℃和30℃时取食率(Sueta1．，2000)。传播马德里约柯托病毒(MaldeRioCuartovirus，MRCV)同一龄期的DelphacodeskuscheliFennah若虫经过不同时间的循回期后获毒率不同，1龄若虫获毒后经过17d的循回期获毒率为28．9％，而经过9d的循回期时获毒率为11．1％；3龄若虫经过17d的循回期时获毒率为20％，而经过9d的循回期时无获毒个体(Arg矗elloCaroeta1．，2013)。灰飞虱在不同温度下带毒率不同，随着温度的升高，携带水稻条纹病毒的比率降低(仲崇翔等，2007)。白背飞虱不同发育阶段取食量不同，整个世代中日均取食量随发育阶段而异，雌性成虫取食量大于雄虫，并且成虫取食量大于若虫，若虫取食量又随龄期的增加而增大(黄次伟等，1993)。白背飞虱若虫对SRBSDV的传毒率高于成虫，成虫中短翅型的传毒率高于长翅型成虫的传毒率，这可能是由白背飞虱的取食行为和扩散行为综合作用的结果(曹杨等，2012)。黑面叶蝉(Grarminellanigrifrons)雌虫对玉米褪绿矮缩病毒(Maizechloroticdwarfvirus，MCDV)的传毒率高于雄虫(Gingeryeta1．，2004)。D．kuscheli雌雄成虫对MRCV的传毒率无显著差别(Ameodoeta1．，2002)。传播番茄斑萎病毒(Tomatospottedwilttospovirus，TSWV)的西花蓟马(Frankliniellaoccidentalis)仅能在1龄时获毒(Toddeta1．，2010)、在成虫时传毒(Rotenbergeta1．，2009)。低病毒载量的雄性成虫的传毒株数要高于高病毒载量雌虫数倍，这不仅与雌雄成虫的取食行为有关，即雌虫由于需要产卵，常固定一个部位进行取食，而雄性成虫比雌虫活跃，常多处取食，从而使多株寄主植物感病成了可能；还与雌雄成虫与传毒相关组织内病毒量的多少有关，雌性成虫的卵和生殖器内也含有较高滴度的病毒，而病毒的传播主要与介体昆虫唾液腺内病毒含量有关(Rotenbergeta1．．2009)。由于不同种蓟马在不同发育阶段N蛋白积累方式各异使不同传毒介体对TswV的传毒效率有较大差异(Inoueeta1．，2004)。1．3席I研究的目的由于白背飞虱是目前发现的SRBSDV的唯一传毒介体，白背飞虱对SRBSDV的获毒率决定了其接毒率，明确白背飞虱的传毒率有助于我们进一步了解SRBSDV的流行规律，为田问病害防治提供参考。带毒的不同发育阶段的白背飞虱在不同温度下对三叶一心稻苗至孕穗期稻苗5种生长阶段稻苗的接毒率各异，短翅型成虫的接毒率高于长翅型成虫的接毒率，而且温度、水稻生育期和白背飞虱发育阶段均影响白背飞虱对SRBSDV的接毒率，各因子对白背飞虱接毒率作用大小依次是温度、水稻生育期、白背飞虱发育阶段、温度和白背飞虱发育阶段的交互、温度和水稻生育期的交互、白背飞虱发育阶段和水稻生育期的交互，最后为三者的交互作用(曹杨等，2012)。但其试验用水稻品种为两优981，水稻生育期未精确到日龄，供试白背飞虱成虫未考虑性别及交配状况。另有研究报道带毒白背飞虱雄虫对稻苗的接毒率较其他生长状态的飞虱高，但未给出证据(Matsukuraeta1．，2013)。有关温度、水稻生育期和白背飞虱若虫龄期对白背飞虱获毒率影响的研究还未见报道，同时，本文采用易感白背飞虱的水稻品种TNl，不同水稻生育期稻苗分别采用三叶期(30日龄)、分蘖期(45日龄)和孕穗期(65日龄)，进一步研究羽化后6d的带毒白背飞虱雄虫、已交配雌虫和未交配雌虫对不同生育期稻苗的传毒率。马德里约柯托病毒传毒介体的病毒含量与成功传毒成正相关(Arg_(]elloCaroeta1．，2013)，而白背飞虱带毒量与传毒率10 万方数据中国农业科学院硕士学位论文第一章引言的关系还未见报道。灰飞虱能从经低温保存的带RBSDV的水稻叶片上获得RBSDV，并能对RBSDV进行再传播(Zhouetal．，2011)。RBSDV币11SRBSDV基因组序列同源性较高，有关SRBSDV能否低温保存的研究也待开展。因此，本文借鉴前人对植物病毒传毒介体的研究，从生态学角度进一步探讨白背飞虱、SRBSDV及水稻间的互作关系，为后续研究和南方水稻黑条矮缩病的防控提供理论基础和参考依据。本文的主要研究内容：温度、水稻生育期和白背飞虱若虫龄期对介体获毒SRBSDV的影响温度、水稻生育期和白背飞虱成虫状态对介体接毒SRBSDV的影响白背飞虱对低温保存带毒稻苗内SRBSDV的传毒能力 万方数据中国农业科学院硕士学位论文第二章温度、水稻生育期和白背飞虱若虫龄期对介体获毒SRBSDV的影响第二章温度、水稻生育期和白背飞虱若虫龄期对介体获毒SRBSDV的影响温度影响病毒的传播是许多虫传病毒的共同特征(Daughertyeta1．，2009)。传播水稻条纹病毒的灰飞虱在17～33℃下获毒率随温度升高而降低(仲崇翔，2007)；传播卷心菜花叶病毒(Cabbagemosaicvirus，CMV)的桃蚜(Myzuspersicae)在16～27℃下获毒率较高，高于或低于此温度范围获毒率均降低(Sylvester，1964)：尖音库蚊(@，既pipiens)在18～30℃时对西尼罗河病毒(Westnilevirus，WNV)的获毒率随温度的升高而升高(Dohmetal．，2002)。温度对介体昆虫获毒率的影响，一方面是由于温度升高增强昆虫自身酶活性，从而使病毒降解(仲崇翔，2007)，另一方面是温度影响病毒粒子在传毒介体内的复制增殖，使病毒在昆虫介体内的循回期发生变化，从而影响介体的获毒率(Dohmeta1．，2002；曹杨等，2012)。白背飞虱以循回增殖型方式传播SRBSDV，循回期为乱14d(Pueta1．，2012)，在26。C时循回期较短，温度过高过低循回期均延长(曹杨等，2012)，如马德里约柯托病毒同一龄期的D．kuscheli若虫获毒率随循回期的延长而升高(Arg矗elloCaroeta1．，2013)。寄主植物自身对病毒的传播也存在影响。SRBSDV可侵染水稻、玉米及多种禾本科杂草，但以水稻的带毒率较高(曹杨，2012)。不同水稻品种上白背飞虱种群的增殖能力不同，对SRBSDV表现出不同的抗性(曹杨，2012；刘琳琳等，2012；黄次伟等，1991)。寄主植物及其品种所含可溶性糖和和氨基酸种类不同，植物的表皮结构及维管束细胞壁等结构也存在差异(邓伟等2012；叶海芳等1989)，这些因素影响介体昆虫的刺探、取食等行为，进而影响植物病毒的传播。白背飞虱对SRBSDV的传毒率随水稻生育期而异，对三叶一心期稻苗的传毒率高于其它生育期(曹杨等，2012)。但水稻生育期是否影响白背飞虱对SRBSDV的获毒率尚不清楚。植物病毒的传播还与介体昆虫的虫态或龄期有关。白背飞虱日均取食量随发育阶段而异，成虫取食量大于若虫，若虫取食量又随龄期的增加而增大(黄次伟等，1993)。白背飞虱饲毒24h后，若虫对SRBSDV的获毒率高于成虫(Pueta1．，2012)，白背飞虱成虫的获毒率随饲毒时间的延长而升高(Matsukuraeta1．，2013)。进一步的研究发现刺吸次数和刺吸持续时间对白背飞虱能否获毒存在影响，成功获毒的白背飞虱刺吸持续时间显著长于未获毒的个体(雷文斌，2014)。黑面叶蝉若虫对玉米细条纹病毒的获毒率高于成虫(Toddeta1．，2010)，而传播番茄斑萎病毒的西花蓟马仅能在1龄时获毒(Weteringetal．，1996)。白背飞虱若虫龄期对其获毒率的影响还未见报道。本文采用多因素试验，测定温度、水稻生育期和白背飞虱若虫龄期对白背飞虱传播SRBSDV的获毒率的影响，以便进一步明确SRBSDV的流行规律，为田间南方水稻黑条矮缩病的防控提供指导。12 万方数据中国农业科学院硕士学位论文第二章温度、水稻生育期和白背飞虱若虫龄期对介体获毒SRBSDV的影响2．I实验材料2．1．I供试稻苗健康稻苗获取。取TNI水稻种子适量，经温水浸种1d后，平铺于白瓷盘中，以湿纱布覆盖，置于37℃的人工气候箱中催芽2d，露白后播种于温室(304-5℃、RH75％～80％、15L：9D)育秧盘(60cm×40cm×8cm)中。其中，育秧盘内平铺2～3cm厚的花卉营养土，适量浇水后将催芽的水稻种子均匀的撤播在营养土上，再覆盖一层营养土(依刚刚覆盖水稻种子为宜)，以后适时适量浇水至水稻长至三叶期。每桶3穴，每穴5株移栽于塑料桶(h=10cm，d=8cm)中种植。分批次播种，确保有足够量的试验用不带SRBSDV的稻苗。带毒稻苗获取。首批带毒水稻于2014年5月在云南芒市田间采集。室内由吸虫管吸取带毒虫源中的白背飞虱5龄若虫，饥饿饲水3h后接于parafilm小袋(3．5cm×3．5cm)，每小袋内接虫3～4头，小袋固定于无毒水稻稻茎上，每株水稻接一个小袋(使小袋撑开，以便飞虱有足够的空间活动和取食)。5d后移除虫子和小袋，15d后RT-PCR检测水稻带毒情况，带毒株作为实验材料。不断地对无毒稻株接带毒白背飞虱，确保有足够的试验用带毒水稻。2．1．2供试虫源不带毒白背飞虱获取。取不带SRBSDV的分蘖期水稻和各虫态白背飞虱，置于防虫笼(80目，50cm×50cm×50cm)中，并与带毒种群分室(温室：304-5℃、RH75％～80％、15L：9D，人工气候箱：27土l℃、RH75％～80％、15L：9D)饲养，确保无毒白背飞虱种群不染毒。带毒白背飞虱种群获取。RT-PCR检测田间采集的疑似病株，将带毒株置于80目防虫笼(50cm×50cm)中，接入各虫态白背飞虱，人工气候箱(274-1℃、RH75％～80％、15L：9D)中连续培养，15d后RT-PCR检测白背飞虱种群带毒率。待种群带毒率达到80％时即可进行试验。2．1．3主要试剂RNAisoPlus：TakaraBiotechnology(Dalian)Co．，LtdTaKaRaPrimeScriptOneStepRNART-PCRKitVer．2：TakaraBiotechnology(Dalian)Co．，Ltd50×TAE：TiangenBiotech(Beijing)Co．．LtdDL2000DNAMaker：TakaraBiotechnology(Dalian)Co．，Ltd6xLoadingBuffer：TakaraBiotechnology(Dalian)Co．，LtdSRBSDV的检测引物：生工生物工程(上海)股份有限公司琼脂糖：西班牙进口芳洁牌花卉营养土：吉林省德惠市芳洁花土厂氯仿，异戊醇，异丙醇，无水乙醇：北京中保科农生物科技有限公司水稻无土栽培营养液配方(雷文斌，2014)： 万方数据中国农业科学院硕士学位论文第二章温度、水稻生育期和白背飞虱若虫龄期对介体获毒SRBSDV的影响大量元素I含量mg／L大量元素II含量mg／L微量元素含量mg／LNH4N03l14．3NaH2P04‘2H2050．4MnCl2‘4H201．8CaCl2110．8Na2Si03‘9H20568Na2M004。2H200．126K2SOa89．3／／H38031．145MgS04-7H20405／ZnS04‘7H200．044／FeS04·7H209．93每种药品单独溶解后再混匀，加水定容至1L，PH调至5．8左右即可。2．1．4主要仪器HP400GS—C02型智能人工气候箱：武汉瑞华仪器设备有限责任公司BCD．281WDXCCNR-C28VDX)冰箱：无锡松下冷机有限公司MM400德国莱驰(Retsch)混合型球磨仪：北京博力飞科技发展有限公司Eppendorf5417R型冷冻高速离心机，德国eppendorf公司9700PCR仪：伯乐(Bio—rad)基因有限公司ImageQuant300UVP凝胶成像系统：美国IE公司DYY-6C型电泳仪：北京市六一仪器厂移液器(0．1uL)：德国eppendorf公司Delta320pH计：梅特勒一托利多仪器(1-海)有限公司G8023YSL．V1微波炉：佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有限公司Q／OAFA天平(0．0019)：梅特勒一托利多仪器(上海)有限公司2．2实验方法2．2．1实验设计此实验为3X2×3因素试验，包括3种温度(22、27和32℃，分别模拟春季、夏初和夏季温度)，2种白背飞虱虫态(3龄、5龄)和3种水稻生育期(三叶期、分蘖期、孕穗期，分别为30日龄、45日龄和65日龄稻苗)，共分为18种处理。取带毒(SRBSDV)稻株上扩繁的第二代白背飞虱3龄若虫，以parafilm小袋(4．5cm×4．5cm)每株3头接于不带毒水稻(包括三叶期、分蘖期和孕穗期)稻茎上，5d后收集白背飞虱于带毒种群中，并取下小袋，15d后，一步法RT-PCR检测(Wangeta1．，2010)各株水稻带毒状况，各带毒株水稻用于试验。取不带毒白背飞虱种群中的3龄若虫，饥饿饲水3h(曹杨等，2011)，以已编号的parafilm小袋(4．5cm×4．5cm)每株1头白背飞虱接于各生育期(三叶期、分蘖期和孕穗期)带毒稻苗上。接虫后立即将各生育期水稻随机分配到不同温度的人工气候箱(224-1℃、RH75％～80％、15L：9D，274-1℃、RH75％～80％、15L：9D，324-1℃、RH75％～80％、15L：9D)中培养。14 万方数据中国农业科学院硕士学位论文第二章温度、水稻生育期和白背飞虱若虫龄期对介体获毒SRBSDV的影响在带有营养液的玻璃管(d=2cm，h=15cm)中接入不带毒三叶期稻苗2株，离水稻根部约4cm处用海绵塞固定稻苗，海绵塞下方为营养液(约15rid)，上方为白背飞虱取食及活动空间，玻璃管管口以海绵塞封口，对玻璃管编号后置于玻璃管架上备用。接虫24h后将各温度下处理的白背飞虱转移至对应编号的备用玻璃管接三叶期稻苗上于人工气候箱(27士1℃、RH75％～80％、14L：10D)中继续饲养，适时补加营养液至玻璃管下海绵塞处，确保水稻正常生长。15d后，按编号收集各自背飞虱，并统计白背飞虱羽化情况。经液氮冷冻后于．80℃冰箱中保存。采用一步法RT-PCR检测白背飞虱带毒状况。每处理每次接虫15头，重复4次。采用白背飞虱3龄、5龄若虫按上述方法测定不同温度下不同虫态白背飞虱在带毒的各生育期水稻上的获毒率。2．2．2SRBSDV检测方法采用一步法RT-PCR进行SRBSDV检测(Wangeta1．，2010)。具体方法如下。RNA提取：1．剪取50～100mg幼嫩感病水稻叶片(收集待检测的自背飞虱)于2．0ml离心管中，加4粒钢珠(d=1mrn)，再加600lalRNAisoPlus(400p1)，在组织研磨机中研磨3min左右；2．加入300ul氯仿异戊醇，漩涡振荡30s，静置4min，有明显分层即可。4℃，12000rpm，离心15rnin，小心吸取200lal上清液至新的1．5ul离心管，切勿吸到杂质；3．加入200“1的异丙醇，缓慢颠倒几次，．20℃冰箱静置15rain；4．4℃，12000rpm离心15rain后弃上清；5．加入1000lal75％冷无水乙醇，4℃，7500rpm离心5min；6．弃上清，用移液枪吸取除去离心管内残留的乙醇，加入30plDEPCH20，振荡溶解。一步法RT-PCR反应体系：堡盛堕坌签墼尘12x1StepBuffer7．5上游引物682一S10一F1．0下游引物682．S10-R1．0模板RNA1．1TaKaRaPrimeScript1StepEnzymeMix0．4RNase-freewater至15．0一步法RT-PCR反应程序： 万方数据中国农业科学院硕士学位论文第二章温度、水稻生育期和白背飞虱若虫龄期对介体获毒SRBSDV的影响反应温度／'C反应时间／min循环数RT-PCR扩增产物电泳：取检测样品RT-PCR产物5ul与1gl6×LoadingBuffer混匀后于1％琼脂糖凝胶上电泳，DL2000DNAMarker作为条带对照，电泳仪120V电压工作30rain，EB染色15min后采用uvP凝胶成像系统进行拍照并记录结果。2．3数据分析白背飞虱获毒率数据经平方根反正弦转换后，采用数据分析软件SPSS16．0中的FactorAnalysis分析温度、水稻生育期和白背飞虱若虫龄期对白背飞虱获毒率的影响，运用TukeyHSD多重比较法确定各水平间的差异显著性。2．4结果与分析在温度、水稻生育期和白背飞虱若虫龄期的组合试验中，白背飞虱若虫取食带SRBSDV水稻24h后的获毒率介于4．6％～48．7％。温度、水稻生育期和白背飞虱若虫龄期对白背飞虱若虫的获毒率均存在显著影响(温度F=3．603，df=2，72，P=0．032；水稻生育期F=8．546，df=2，72，P<0．001；白背飞虱若虫龄期F=9．972，df=l，72，P=0．002)，温度、水稻生育期和白背飞虱若虫龄期之间的交互作用对白背飞虱若虫获毒率均没有显著影响伊<1．807，P>0．172；表2．1、。16●弱踮●／∞o吣，加／的虬叭跖他埔 万方数据中国农业科学院硕士学位论文第二章温度、水稻生育期和白背飞虱若虫龄期对介体获毒SRBSDV的影响表2．1温度、水稻生育期和自背飞虱若虫龄期对介体获毒SRBSDV影响的三因素方差分析Table2．1Three-wayanalysisofvarianceforexperimenttestingtheeffectsoftemperatureandricegrowthstagesonSRBSDVacquisitionbynymphsofplanthoppers变异来源自由度离均差平方和均方FSig．温度20．442O．2213．603O．032水稻生育期21．0480．5248．546<0．001飞虱若虫龄期l0．6llO．6119．972O．002温度×水稻生育期40．255O．0641．0390．393温度×飞虱若虫龄期20．2220．1ll1．8070．172水稻生育期×飞虱若虫龄期20．0820．04lO．670．5l5温度×水稻生育期×飞虱若虫龄期4O．1660．0410．6770．61误差724．4140．06l／总变异897．214／在不同温度(22、27、32℃)下，白背飞虱若虫获毒率在22℃最低(15．4％)，显著低于32℃下的获毒率(P=0．0323)：22与27℃、27与32℃下的获毒率之间没有显著差异(P>0．109；图1B)。在不同生育期(三叶期、分蘖期、孕穗期)水稻上，白背飞虱若虫在分蘖期稻苗上的获毒率最高(32．2％)，显著高于其在三叶期和孕穗期稻苗上的获毒率(P<0．05)，而在三叶期与孕穗期稻苗上的获毒率之间没有显著差异(P=0．319；图1C)。从白背飞虱若虫龄期之间来看，3龄若虫的获毒率(28．8％)高于5龄若虫(16．5％，图1D)。 万方数据中国农业科学院硕士学位论文第二章温度、水稻生育期和白背飞虱若虫龄期对介体获毒SRBSDV的影响C42I-33龄固5龄三叶期tre．1eafstage分蘖期tilleringstage孕穗期bootingstage水稻生育期Ricegrowthstages222732温度／'CTemperature垂蘸吐垂；i|雌图2．1温度、水稻生育期和白背飞虱若虫龄期对白背飞虱若虫取食带SRBSDV稻苗24h后的获毒率的影响A：温度、水稻生育期和白背飞虱若虫龄期的组合效应；B：温度主效应；C：水稻生育期主效应；D：白背飞虱若虫龄期主效应。柱形图上不同字母表示处理间差异显著(P0．3734；表3．1)。表3．1温度、水稻生育期和白背飞虱若虫成虫状态对介体接毒SRBSDV影响的三因素方差分析Table3．1Three-wayanalysisofvarianceforexperimenttestingtheeffectsoftemperatureandricegrowthstagesonSRBSDVinoculationbyadultsofplanthoppers变异来源自由度离均差平方和均方FSig．温度20．0770．0381．6460．199水稻生育期20．0620．03l1．3350．269飞虱成虫状态20．3040．1526．5070．002温度×水稻生育期4O．2750．0692．940．025温度×飞虱成虫状态40．0270．0381．6460．199水稻生育期×飞虱成虫状态40．0950．0241．0140．405温度×水稻生育期×飞虱成虫状态80．2050．0261．0980．373误差811．8940．023／总变异1072．94／在不同温度(22、27和32℃)下，白背飞虱成虫的接毒率在22℃最低(4．7％)，27℃最高(7．9％)，三种温度下的接毒率之间没有显著差异(P>0．191；图IB)。在不同生育期(三叶期、分蘖期、孕穗期)水稻上，白背飞虱成虫对三叶期稻苗的接毒率最高(7．4％)，孕穗期最低(5．1％)，白背飞虱成虫对各生育期稻苗的接毒率亦无显著差异(P>0．317；图1C)。从白背飞 万方数据中国农业科学院硕士学位论文第三章温度、水稻生育期和白背飞虱成虫状态对介体接毒SRBSDV的影响虱成虫状态来看，白背飞虱雄虫的接毒率最高(8．9％)，显著高于交配和未交配雌虫(P<0．05)，而雄虫和未交配雌虫、未交配雌虫和交配雌虫的接毒率间无显著差异(尸>0．138；图1D)。Ao毫皇赛墨艚g辎．暑已岁C10Q盘皇蔷墨爨童已罗0日杏口早未交配口早交配Btre-leaffilletingbootingstage水稻生育期RicegrowthstagesD鋈料精鲻。瓮口瓤j>娄。专6jg4口l2>0a222732温度／'CTemperature杏unmatedmated早Q白背飞虱成虫状态AdultstatusofWBPH图3．1温度、水稻生育期和白背飞虱成虫状态对带毒白背飞虱成虫接毒率的影响A：温度、水稻生育期和白背飞虱成虫状态的组合效应；B：温度主效应；c：水稻生育期主效应；D：白背飞虱成虫状态主效应。柱形图上不同字母表示处理间差异显著(P<0．05)Fig．3．1VirusinoculationratesbyviruliferousWBPHadults(unmatedfemale，matedfemaleandmale)toriceplantsofdifferentgrowthstagesatvaryingtemperaturesA：combinedeffectsoftemperature．ricestageandadultstatus；B：maineffectoftemperature；C：maineffectofricestage；D：maineffectofadultstatus．Differentlettersoverthebarsindicatesignificantdifference(P<0．05)3．5讨论此实验结果表明温度过高过低均影响白背飞虱的接毒率。白背飞虱成虫在27℃时的接毒率高于32℃时的接毒率，22℃时的接毒率最低，这与香蕉交脉蚜成虫对BBTV的接毒率类似(Anhalteta1．，2008)。而与草翅叶蝉、黑面叶蝉、禾谷缢管蚜的接毒率不同(Daughertyeta1．，2009；Gingerycta1．，2004；Smymioudiseta1．，2001)。后者均被认为温度通过影响介体昆虫的取食行为而影响了介体昆虫的接毒率。接毒成功的白背飞虱对稻苗的刺吸次数和刺吸持续时间较不成功的个23a且工¨¨Ua工一血a^㈠Ua卜[㈠U 万方数据中匡I农业科学院硕士学位论文第三罩湿度、水稻生育期和自背飞虱成虫状态对介体接毒SRBSDV的影响体长(雷文斌，2014)。由于供试飞虱均为初孵时饲毒且饲毒时间相同，并在同一日龄接毒，接毒率的不同则可能由不同温度处理下白背飞虱的刺吸次数和刺吸持续时间的不同引起。22℃时白背飞虱接毒率最低也表明即使带毒白背飞虱能顺利越冬，对水稻的危害也大大降低。但随着全球气候变暖，毒源昆虫及植物的增加将导致南方水稻黑条矮缩病的大流行。白背飞虱成虫对三叶期稻苗的接毒率最高，依次为分蘖期稻苗和孕穗期稻苗。这与曹杨等(2012)的实验结果类似，即稻苗苗龄越小，越易被接毒。这可能与水稻的抗性有关。被水稻条纹叶枯病毒侵染的稻苗内与RNA干扰途径及JAK．STAT信号转导途径相关的基因表达增加，产生抗病毒反应(Zhangeta1．，2010)。水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)等能够诱导被病毒侵染的植物内相关抗性基因的表达(任萍等，2009；张金锋等，2004：陈建明等，2000)。南方水稻黑条矮缩病的矮缩现象与水稻内源赤霉素的合成量密切相关(黄炎霞等，2014)。感染SRBSDV的白背飞虱内RNA干扰途径被激活以防御病毒的侵染(Xueta1．，2012)。通过对带毒的水稻、玉米和飞虱内SRBSDV基因表达水平进行定量，发现SRBSDV在水稻、玉米和飞虱内的侵染途径相同(Heeta1．，2013)。所以，带毒白背飞虱对不同生育期稻苗接毒率的不同及各生育期稻苗的低接毒率可能是由于稻苗自身的防御反应在起作用，如RNA干扰途径和植物激素调控。这种推测需进一步证实，并可用于水稻品种的抗性筛选研究。白背飞虱雄虫的接毒率高于雌虫的接毒率，这与Matsukura等(2013)研究的白背飞虱的接毒率结果类似。与Arg(ielloCaro等(2013)，Ameodo等(2002)关于Dkuscheli雌雄成虫对MRCV的接毒率无显著差别的研究结果不同。白背飞虱雌虫的交配状态亦影响白背飞虱的接毒率，已交配自背飞虱的接毒率低于未交配白背飞虱的接毒率。实验中所用已交配白背飞虱为羽化后6d的雌虫，已经过产卵前期(张建新等，1990)，此时白背飞虱已开始产卵，实验中也观察到此现象，并可见产卵痕。由于白背飞虱即可营两性生殖，又可孤雌生殖(张建新等，1990)，羽化后的白背飞虱雌虫可能因繁殖后代的需要而减弱了对病毒的传播能力，同时，不同的生殖方式也表现出不同的接毒率。有研究报道D．kuscheli的接毒率与不同生理状态飞虱内病毒粒子滴度和病毒粒子在飞虱内的循回期有关(Argi]elloCaroeta1．，2013)。本实验中供试白背飞虱均为带毒稻苗上饲养相同时间的飞虱若虫，可认为病毒在飞虱内的循回时间相同，接毒率的差异则由个体的发育状态所致。迁飞的白背飞虱成虫在迁入地进行交配(姚青等，1999)，雄虫和未交配雌虫相对高的传毒率增加了SRBSDV的传播。虽然温度和水稻生育期对白背飞虱的接毒率均无显著影响，但二者的交互作用存在显著影响。Anhal等(2008)报道的温度和介体发育阶段对香蕉交脉蚜传播BBTV的效率和Gingery等(2004)报道的温度和性别对黑面叶蝉传播MCDV效率的影响结果相反。但有研究报道温度、水稻生育期和介体发育状态对SRBSDV的传播均存在显著影响，而且它们间的交互作用亦存在显著影响，并推测这种影响主要通过病毒在昆虫介体和植物寄主内的复制及介体的取食和扩散行为而发挥作用(曹杨等，2012)。由此看来，不同性别的白背飞虱接毒率不同，交配影响白背飞虱成虫的接毒率，除此之外，仅温度和水稻生育期的交互作用影响白背飞虱的接毒率。单头D．kuscheli传播MRCV的效率仅1％～2．5％(Omaghieta1．，1999)。黑面叶蝉对MFSV24 万方数据中国农业科学院硕士学位论文第三章温度、水稻生育期和白背飞虱成虫状态对介体接毒SRBSDV的影响的接毒率与棒状病毒属的其他病毒的传毒率相比，低于这些病毒的主要传毒介体的接毒率，而与次传毒介体的接毒率类似，但田间未发现MFSV的其他传毒介体，这种现象可能是实验室内饲养的带毒黑面叶蝉种群与田间种群相比病毒基因发生漂移引起(Todd等，2010)。有研究报道白背飞虱接毒2d后的接毒率为3．3％～41．2％(曹杨等，2012)，接毒1d后的接毒率为42．9％～54．3％(蒲玲玲，2012)，而实验中自背飞虱接毒24h后的接毒率为0．0％～15．6％，相对二人研究的传毒率结果偏低，但各试验所用水稻品种不同，白背飞虱接毒率的差异可能是由水稻品种引起。实验中供试昆虫是以田间采集经检测确认带毒的稻苗饲养得到的，实验还发现延长白背飞虱接毒时间至5d时，接毒率可达50％(未发表)。可见，实验中白背飞虱的低接毒率可能也与接毒时间较短有关。通过对寄主植物多次重复接毒，并加大接毒浓度能有效提高接毒率(Anderson，1993)，结合本实验结果可以通过采用多头雄虫在27℃下对三叶期稻苗进行较长时间的接毒，以提高带毒稻苗的获得率，这与Matsukura等(2013)的研究结论相同。运用此方法可以加快水稻品种抗性筛选进程。25 万方数据中国农业科学院硕士学位论文第四章白背飞虱传播低温保存带毒稻苗内SRBSDV的能力在SRBSDV-介体昆虫一寄主植物的互作研究中，由于带毒白背飞虱和带毒稻苗的存活时间有限，及白背飞虱对SRBSDV的有限的传播能力，科研工作者经常遇到带毒材料不足的问题。由灰飞虱以循回增殖型方式传播的RBSDV也遇到过类似情况，然而，灰飞虱能从．70℃冷冻保存十个月的带RBSDV的稻苗上获毒，并进行接毒，其传播能力与灰飞虱对正常生长的带毒稻苗内的病毒的传播能力相近(Lieta1．，2010)。灰飞虱同样能从．20℃保存约两年的带RSV的稻苗上获毒并进行接毒，其传毒能力与灰飞虱对正常生长的带毒稻苗内的病毒的传播能力也相近(Zhangeta1．，2007)。所以，本文采用．80℃保存140d和45d的感病稻苗，研究白背飞虱从低温保存的感病稻苗上的获毒和接毒能力。4．1实验材料4．1．1供试稻苗2014年6月在云南芒市(24。25753．02”N，98。34’35．74”E)田间采集疑似南方水稻黑条矮缩病的稻苗，一步法RT-PCR检测(Wangetal，，2010：Leieta1．，2014)筛选出带毒株。挑选长势相似的感病稻苗，从分蘖基部剪去并收集于10号自封袋中，保存于．80℃冰箱140d，余下稻苗种植于温室(304-5℃、RH75％～80％、15L：9D)。与此次采集感病稻苗相隔95d时再次采集感病稻苗，方法同上，保存于一80℃冰箱中用于45d低温处理稻苗。4．1．2供试虫源取不带SRBSDV的分蘖期稻苗和白背飞虱雌雄成虫，置于人工气候箱(274-1℃、RH75％～80％、15L：9D)的防虫笼(80目)中饲养，确保自背飞虱种群不带SRBSDV。待第二代白背飞虱发育至2龄时备用。4．1．3主要试剂TIANgelMidiPurificationKit：TiangenBiotech(Beijing)Co．，LtdTIANpureMiIliPlasmidKit：TiangenBiotech(Beijing)Co．，LtdSuperRealPreMixPlus(SYRBGreen)：TiangenBiotech(Beijing)Co．，LtdpGEM@-TEasyVectorSystemhPromegaBiotech(Beijing)Co．，LtdGoScriptTMReverseTranscriptionSystem：PromegaBiotech(Beijing)Co．，Ltd其他试剂同2．1．3。4．1．4主要仪器NanoDrop一2000：NanoDropTechnologies，USAABl7500Real—TimePCRSystem：AppliedBiosystems，USA其他仪器同2．1．4。26 万方数据中国农业科学院硕士学位论文第四章白背飞虱传播低温保存带毒稻苗内SRBSDV的能力4．2实验方法4．2．1实验设计以．80℃保存45d和140d的带毒稻苗为处理组，以新鲜的感病稻苗作对照组，以不带毒的新鲜稻苗作空白对照组。首先将冷冻保存的稻苗在4℃放置4h，使叶片自然展开。将各处理的水稻茎叶分段，每段长约6cm，取8段平铺于已灭菌的200ml锥形瓶中，瓶底铺有2层吸水纸，并保持吸水纸湿润。每锥形瓶每段稻苗茎叶接白背飞虱2龄若虫约8头，白背飞虱取食48h后统计各处理白背飞虱的存活量，转移取食稻苗茎叶后并存活的白背飞虱于不带毒三叶期稻苗上单独饲养，20d后收集此飞虱，一步法RT-PCR检测白背飞虱的获毒状况，35d后检测饲养此白背飞虱的稻苗的带毒状况。每处理重复3次。由于取食低温保存的带毒稻苗48h并经过20d循回期的白背飞虱经一步法RT-PCR检测无获毒个体，试验进一步检测获毒期(取食低温保存稻苗48h)刚结束的白背飞虱是否获得病毒，除了试验所用稻苗低温保存时间增加了97d，白背飞虱带毒状况检测时一个重复中所有白背飞虱作为一个样品外，试验方法与上述相同。4．2．2SRBSDV检测方法SRBSDV定性检测同2．2．2．SRBSDV定量检测提取待定量样品RNA，以反转录产物为模板，含有目的片段的重组质粒为标准品进行定量检测(ArgiielloCaroeta1．，2013；Rotenbergeta1．，2009)。具体方法如下：质粒标准品制备按照2．2．2中RNA提取步骤提取已知感病水稻叶片的总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，微量紫外分光光度计测所提RNA的纯度与浓度，对RNAA260／280在1．9～2．1之间，A260／230大于2．0的一个样品按反转录试剂盒说明书进行反转录，采用PrimerPremier5设计的S9片段上目标片段长820bp的引物(上游引物S9一F．-5'-gaatcacagaaacccacc一3’，下游引物S9一R：5’．ccgaatcagacaaaggac一3’)按如下反应体系和反应程序对反转录产物进行扩增：反应体系：27 万方数据中国农业科学院硕士学位论文第四章白背飞虱传播低温保存带毒稻苗内SRBSDV的能力反应程序：按琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书对PCR产物进行切胶回收，对回收产物进行连接转化至大肠杆菌(EscherichiacoliDH5a)，挑取重组质粒(白斑)进行摇菌扩繁，按高纯度质粒小提试剂盒说明书提取质粒，微量紫外分光光度计测标准品纯度及浓度，得RT-qPCR标准品。以公式4．1(Zhoueta1．，2014)计算质粒标准品中的病毒s9片段的拷贝数。拷贝数c。。pt。s，rtL)=善冀喾象蚩器c公式4．1，样品准备按照2．2．2中RNA提取步骤提取各处理感病水稻叶片的总RNA，微量紫外分光光度计测所提RNA的纯度与浓度，对RNAA260／280在1．9～2．1之间，A260／230大于2．0的样品按反转录试剂盒说明书进行反转录，反转录产物作为定量检测模板。引物筛选对标准品进行10倍系列梯度稀释，同时挑选一个样品的反转录产物亦进行10倍系列梯度稀释，并通过荧光定量引物设计软件BeaconDesigner7．9在上述引物片段内设计目的片段长约100～200bp的定量用引物r(Maronicheeta1．，2011)，按RT-qPCR说明书通过RT-qPCR仪进行RT-qPCR引物筛选，选取特异性强、扩增效率在标准品和样品中相近的引物作为RT-qPCR反应引物(上游引物：5'-tcagaggtatcaacggtagtg-．3’，下游引物：5’-gtcggacttaataacgctatcag．3’)。样品定量检测1．待荧光定量PCR试剂盒内试剂溶解后缓慢振荡，简短离心。2．RealTimePCR反应液冰上配制。qPCR反应体系：组成成分体积／B12×SuperRealPreMixPlus上游引物下游引物50×ROXReferenceDyeRNase—freeddH20lO．0O．80．4至20．03．彻底混匀，分装到PcR管中。4．加入反转录后的样品模板。28 万方数据中国农业科学院硕士学位论文第四章白背飞虱传播低温保存带毒稻苗内SRBSDV的能力5．缓慢混匀反应液(使反应液不产生气泡)。6．将PCRdx管放入荧光定量PCR仪，启动反应程序。qPCR反应程序：由己知标准品10倍系列梯度稀释的质粒标准品拷贝数的对数及对应ct值做标准曲线，根据样品的Ct值，计算出样品中病毒粒子的拷贝数。4．3数据分析采用SPSS16．0One—WayANOVA分析各处理中病毒粒子的拷贝数及平方根反正弦转换后的白背飞虱存活率和获毒率差异，运用TukeyHSD多重比较法确定各水平间的差异显著性。4．4结果与讨论试验前采用RT-PCR检测方法进一步确认低温保存140d和45d及新鲜的带毒稻苗的带毒状况。通过琼脂糖凝胶电泳，所检测样品的RT-PCR产物中均出现长约682bp目的条带(图4．1)。这说明．80℃处理140d和45d的带毒稻苗中SRBSDV仍可检测出，其RNA并未被降解。123456789】0图4．1琼脂糖凝胶电泳分析试验用感病稻苗经RT-PCR检测结果1：DL2000Marker，2-4：一80℃保存140d感病稻苗样，5．7：．80℃保存45d感病稻苗样，8．10：新鲜感病稻苗样Fig．4．1DetectionofSRBSDVinSRBSDV-infectedriceplantsbeforeexposuretoplanthoppersusingelectrophoresisanalysisofRT-PCRproducts．Lanel：DL2000Marker；Lanes2-4：infectedriceplants丘ozenat一80oCfor140d：Lanes5．7：infectedriceplants丘ozenat-80。Cfor45d：Lanes8—10：infectedfleshriceplants．经RT-qPCR检测，试验用低温保存和新鲜的带毒稻苗内病毒粒子含量并无显著差异(F=0．32；df=2，7；P=0．740；表4．1)。这说明低温保存处理的带毒稻苗内存在病毒粒子，并且病毒粒子含量与新鲜稻苗内的无显著差别，进一步表明低温保存后的带毒稻苗是有作为SRBSDV’9 万方数据中国农业科学院硕士学位论文第四章白背飞虱传播低温保存带毒稻苗内SRBSDV的能力毒源的可能的。表4．1各处理感病稻苗内SRBSDV粒子滴度Table4．1VirustiterinSRBSDVjnfectedriceplantsfromdifferenttreatment病毒粒子拷贝数copies／uL．80℃保存140d的感病稻苗1．80×105士0．78×104．80℃保存45d的感病稻苗3．34×1054-1．99×105新鲜感病稻苗2．45×1054-1．04×105白背飞虱取食一80℃保存的稻苗茎叶与新鲜稻苗茎叶后存活率差异显著(F=96．493，df=3，8，P<0．001；表4．2)。白背飞虱取食140d和45d的稻苗茎叶48h后的存活率无显著差异(P=0．999)，分别为40．1％、41．1％，不到取食新鲜带毒稻苗茎叶平均存活率(95．7％)的一半。这与灰飞虱取食一70℃处理10个月的感RBSDV稻苗茎叶后的存活率结果类似(Zhoueta1．，2011)，与灰飞虱取食．20℃处理约两年的感RSV稻苗茎叶后的存活率亦类似(Lieta1．，2010；Zhangeta1．，2007)。无论稻苗带毒与否，白背飞虱取食新鲜茎叶后的存活率无显著差异(P=0．139)。表4．2取食稻苗后白背飞虱的存活率和获毒率Table4．2．Survivalandvirusacquisitionrates(means士SE)ofwhite—backedplanthoppersfedonriceplants数据后不同的字母表不处理间存在显著差异(Tukey检验，P=0．05)。Differentlettersfollowingmeallswithinacolumndenotesignificantdifferencebetweentreatments(TukeyHSDtest，P=0．05)．存活的白背飞虱经过病毒循回期后低温处理组无获毒个体，而新鲜带毒稻苗茎叶处理组的获毒率为50．4％(表4．2)。这说明白背飞虱不能从低温保存的带毒稻苗茎叶上获毒，而灰飞虱取食低温保存的带毒稻苗(感RBSDV和感RSV稻苗)后不但能获毒还能接毒，接毒率与新鲜带毒稻苗上的无显著差异(Zhoueta1．，2011；Lieta1．，2010；Zhangeta1．，2007)。然而，经过48h获毒期的取食低温处理感病稻苗的白背飞虱若虫已携带SRBSDV(图4．2)，这说明白背飞虱若虫取食低温处理的带毒稻苗后获毒，但病毒粒子不能在白背飞虱体内完成侵染循环。12345678910图4．2琼脂糖凝胶电泳分析取食感病稻苗后48h的自背飞虱经RT-PCR检测后的结果30 万方数据中国农业科学院硕士学位论文第四章白背飞虱传播低温保存带毒稻苗内SRBSDV的能力1：DL2000Marker，2-4：一80"C保存140d感病稻苗样，5．7：．80"C保存45d感病稻苗样，8一10：新鲜感病稻苗样Fig．4．2DetectionofSRBSDVinwhite—backedplanthoppersfed48honSRBSDV-infectedriceplantsusingelectrophoresisanalysisofRT-PCRproducts．Lane1：DL2000Marker；Lanes2-4：planthoppersfedoninfectedriceplantsfrozenat一80。Cfor237d：Lanes5-7：planthoppersfedoninfectedriceplantsfrozenat-80。Cfor142d：Lanes8-10：planthoppersfedONinfectedfreshriceplants．RBSDV属呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(尉ivirus)第2组成员，RSV是纤细病毒属(Tenuivirus)的代表成员，二者均由灰飞虱传播(邓金奇等，2012；蔡小卫等，2011)，经低温保存后这两种病叶中的病毒对灰飞虱均具有侵染能力(Zhoueta1．，2011；Lieta1．，2010；Zhangeta1．，2007)；SRBSDV亦属呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus)第2组成员，与RBSDV具有较高的同源性(Zhoueta1．，2008)。同是作为植物病毒的主要传播介体，灰飞虱能够传播经低温保存的RBSDV和RSV，而白背飞虱不能从低温保存的带SRBSDV稻苗上获毒。经检测，低温保存的感SRBSDV稻苗仍有目的条带，说明病毒粒子RNA未降解，获毒期刚结束的白背飞虱能从低温保存的带毒稻苗上获毒，说明SRBSDV已随白背飞虱取食进入白背飞虱体内，但经过循回期后白背飞虱无获毒个体。SRBSDV在白背飞虱体内进行循回增值型传播，这种特性不受白背飞虱蜕皮的影响(Pueta1．，2012)。与其他循回增殖型病毒一样，SRBSDV若能成功传播，病毒粒子必须成功穿越介体白背飞虱的中肠屏障和唾液腺屏障(Jiaeta1．，2012)。SRBSDV进入白背飞虱虫体后由于不能完成侵染循环，在循回期内被介体白背飞虱消化代谢，才使得取食后获毒的白背飞虱经过循回期后无获毒个体。因此，经低温保存后的带毒稻苗内的病毒粒子不能经白背飞虱传播。由于白背飞虱对SRBSDV的接毒率较低，在SRBSDV-水稻．白背飞虱的研究中，工作人员经常面临着毒源不足的问题。目前，研究人员主要从出现SRBSDV病症的稻田里采集疑似稻苗和白背飞虱。但是这种方法成本较高，费时费力，而且所采集的疑似毒源易于死亡，不能保证毒源的及时供给。尽管采用大量黑面叶蝉对玉米多次接毒可提高玉米褪绿矮缩病毒的传毒率(Louieeta1．，1993)，这种方法对白背飞虱．SRBSDV-稻苗的作用不大。综上所述，本实验结果表明，经低温处理的带毒稻苗内的SRBSDV不能经白背飞虱传播。这可能是因为病毒粒子达到白背飞虱唾液腺之前已被白背飞虱消化代谢。 万方数据中国农业科学院硕士学位论文第五章全文结论南方水稻黑条矮缩病的病原为SRBSDV，于2001年在广东省阳西县首次发现。近年来，南方水稻黑条矮缩病严重地发病程度及迅速扩大地发病面积引起了人们的广泛关注。白背飞虱是目前发现的SRBSDV的唯一传播介体，研究影响白背飞虱对SRBSDV传播的因子有助于进一步了解SRBSDV的流行学规律，为南方水稻黑条矮缩病的防治提供理论指导。本文研究了温度、水稻生育期和白背飞虱虫态对白背飞虱传播SRBSDV能力的影响，所得结论如下：1．温度、水稻生育期和白背飞虱若虫龄期对白背飞虱若虫获毒率的影响。设计3×3×2三因子试验研究在22、27和32℃三种温度，三叶期、分蘖期和孕穗期三种生育期稻苗上白背飞虱3龄和5龄若虫两种龄期的白背飞虱对SRBSDV的获毒率，共分为18种处理。试验结果表明，温度显著影响白背飞虱若虫的获毒率，温度越高，白背飞虱的获毒率也越高，并且白背飞虱在27和32℃下的获毒率显著高于22℃下的获毒率，这可能是因为27和32℃较22℃更适于白背飞虱的取食等生长发育行为，同时，适当的高温也有利于病毒的复制增殖，白背飞虱对带毒稻苗取食量的增加及适宜的病毒增殖条件均提高了飞虱成功获毒的可能性；水稻生育期也显著影响白背飞虱的获毒率，白背飞虱在分蘖期稻苗上的获毒率高于三叶期和孕穗期稻苗的获毒率，这可能与白背飞虱的偏好性有关，因为分蘖期稻苗氮含量及氨基酸种类更适于白背飞虱的生长发育；白背飞虱若虫龄期也显著影响其获毒率，3龄若虫获毒率高于5龄若虫，这可能与飞虱3龄若虫中肠屏障与唾液腺屏障间的距离相对较短，自身免疫代谢相对较弱有关；但这些因素的交互作用对白背飞虱的获毒率无显著影响，在这三种因子相互作用下，取食带毒稻苗24h的白背飞虱经过循回期后获毒率介于4．6％～48．7％之间，在27℃下取食三叶期带毒稻苗的3龄白背飞虱的获毒率最高，而在27℃下取食孕穗期带毒稻苗的5龄若虫的获毒率最低，说明27℃下带毒的三叶期稻苗最有利于自背飞虱获毒，而白背飞虱在孕穗期稻苗上的获毒率较低，这可能与食料的恶化有关。2．温度、水稻生育期和白背飞虱成虫状态对白背飞虱成虫接毒率的影响。设计3×3×3三因子试验研究在22、27和32℃三种温度，三叶期、分蘖期和孕穗期三种生育期稻苗上羽化后6d的白背飞虱雄虫，已交配雌虫和未交配雌虫对SRBSDV的接毒率，共分为27种处理。试验结果表明，白背飞虱成虫状态显著影响白背飞虱的接毒率，白背飞虱雄虫的接毒率高于未交配雌虫的接毒率，未交配雌虫的接毒率高于已交配雌虫的接毒率，但均无显著差异，这说明不同性别的白背飞虱及交配与否均影响白背飞虱对SRBDSV的传播，而雄虫的接毒率显著高于已交配雌虫的接毒率，这说明交配显著影响白背飞虱雌虫的接毒率；温度和水稻生育期的交互作用显著影响白背飞虱的接毒率，在27℃下白背飞虱对分蘖期稻苗的接毒率较高，这说明适宜的温度条件和稻苗生长时期有助于病毒的传播；其他单因子或因子间的交互作用对白背飞虱的接毒率均无显著影响。在这三种因子的交互作用下，带毒白背飞虱取食稻苗24h后的接毒率介于0．0％～15．6％之间，其中，在27℃下雄虫对分蘖期稻苗的接毒率最高，而在32℃下已交配雌虫不能对分蘖期稻接毒，这可能与己交配雌虫由于产卵的需要常选择长势旺盛、营养充足的稻苗有关，而雄虫由于交配的需要，常较雌虫活跃，从而增加了接毒的机会。综合比较温度、水稻生育期和白背飞虱虫态对SRBSDV传播的影响发现，白背飞虱虫态不仅影响白背飞虱的获毒率也影响其接毒率，温度和水稻生育期单因素作用影响白背飞虱的获毒32 万方数据中国农业科学院硕士学位论文第五章全文结论率，但不影响接毒率，而交互作用不影响获毒率，影响接毒率，其他交互作用均不影响白背飞虱的获毒率，也不影响其接毒率。同时，与白背飞虱的获毒率相比，其接毒率较低，有时，带毒的白背飞虱并不能向水稻接毒。3．低温保存的SRBSDV带毒稻苗作为白背飞虱传毒毒源的可行性。采用．80℃保存45d和140d的带毒稻苗及新鲜的带毒稻苗与新鲜不带毒稻苗用于试验以测定低温保存的带毒稻苗内的病毒能否经白背飞虱传播，以解决有关白背飞虱一SRBSDV-水稻的研究工作者经常遇到带毒的白背飞虱或稻苗数量不足的问题。试验结果表明，低温保存的带毒稻苗内的病毒RNA未降解，其病毒粒子滴度与对照组新鲜带毒稻苗内的病毒粒子滴度无显著差别；白背飞虱取食低温保存的带毒稻苗后的存活率约为40．0％，但经过病毒的循回期后无获毒个体，而对照组取食新鲜稻苗的白背飞虱的获毒率达50．4％。随后进一步测定刚取食低温保存带毒稻苗结束的白背飞虱，发现白背飞虱此时获得了病毒，这说明随取食进入白背飞虱体内的病毒粒子由于不能穿越白背飞虱的中肠屏障或唾液腺屏障而不能被白背飞虱传播。 万方数据中国农业科学院硕士学位论文参考文献1．蔡小卫，赵俊玲，邵英，桂青清，刘芳．灰飞虱传播水稻条纹病毒的研究综述．中国植保导刊，2011，31(9)：14．17．2．曹婷婷．稻飞虱中间互作关系及其机制研究．[博士学位论文】，浙江：浙江大学，2013．3．曹杨，李有志．探讨不同因素对白背飞虱在稻苗间传播南方水稻黑条矮缩病毒效率的影响．湖南文理学院学报(自然科学版)，2014，26(1)：30．37．4．曹杨，潘峰，周倩，李冠华，刘双清，黄志农，李有志．南方水稻黑条矮缩病毒介体昆虫白背飞虱的传毒特性．应用昆虫学报，2011，48(05)：1314．1320．5．曹杨．白背飞虱传播南方水稻黑条矮缩病毒能力的研究．【硕士学位论文]，湖南：湖南农业大学，2012．6．陈建明，俞晓平，葛秀春，吕仲贤，程家安，颜红岚，刘光杰，郑许松，陶林勇，孔令军．水稻植株防御自背飞虱为害的某些生理反应．中国水稻科学，2000，14(1)：43-47．7．邓金奇，戴良英．水稻黑条矮缩病毒的研究进展．中国农学通报，2012，28(18)：209—212．8．邓伟，胡兰香，陈红萍，陈明亮，肖叶青．水稻抗白背飞虱研究进展．江西农业学报，2012，24(1)：91—97．9．杜琳琳，王跞姣，周彤，兰莹，范永坚，周益军．南方水稻黑条矮缩病毒检测方法的比较．植物保护学报，2014(3)：352．359．10．杜琳琳．南方水稻黑条矮缩病毒分子检测方法的研究．【硕士学位论文]，南京：南京农业大学，2012．11．封亚青．大气C02浓度升高对灰飞虱获毒、传毒和带毒的影响研觅[硕士学位论文】，江苏：扬州大学，2010．12．冯炳灿，黄次伟，王焕弟，姚静，宋丽君．温度对白背飞虱种群增长的影响．昆虫学报，1985，28(4)：390—197．13．何晓婵，徐红星，周小军，郑许松，孙裕建，杨亚军，田俊策，吕仲贤．植物病毒对介体和非介体节肢动物及其天敌的影响研究进展．应用生态学报，2014，25(5)：1525．1532．14．贺鸣，陈卓，金林红，贺鹏．南方水稻黑条矮缩病传毒介体白背飞虱的传毒特性及互作分子机制研究进展．中国植保导刊，2013，33(11)：22．25．15．胡国文，朱明华．白背飞虱短翅型雄虫的观察．昆虫知识，1981，18(4)：154．156．16．黄次伟，冯炳灿，王焕弟，姚静，宋丽君．白背飞虱的寄主和耐饥力．昆虫知识，1985，22(5)：193—195．17．黄次伟，冯炳灿．水稻白背飞虱、褐飞虱取食动态研究．昆虫学报，1993，36(2)：251—255．18．黄次伟，冯炳灿．水稻生育期对白背飞虱种群增长的影响．浙江农业学报，1991，3(1)：9．13．19．季英华，任春梅，程兆榜，周彤，周益军．江苏省近年来新发生的一种水稻矮缩病害病原初步鉴定．江苏农业学报，2009，25(06)：1263—1267．20．贾东升．SRBSDV和RRSV在介体飞虱体内的侵染机理．[硕士学位论文]，福建：福建农林大学，2013．21．李向阳，陈卓，金林红，薛伟，胡德禹．斐济病毒属植物病毒的基因组结构研究进展．农药，34 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