毕赤酵母工程菌pk53产纤溶酶发酵的优化研究.pdf

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1、分类号：Q窆三窆：窆单位代码：!QQ竖密级：公珏学号：2QQ墨12墨毕赤酵母工程菌pk53产纤溶酶发酵的优化研究Studiesonthefermentationforfibrinolyticenzymefrompichiapastorispk53学位申请人：焦龙指导教师：贾英民教授学科专业：微生物学学位类别：理学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二。一一年五月二十八日独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研

2、究成果，也不包含为获得河北农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：重邑楚签字日期：勿¨年‘月1日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解塑兰堡盔些盘堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权塑兰垦盔些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论

3、文作者签名：刁釜老翩签～签字日期：勾IJ年6月1日签字日期：列lf年6月f日学位论文作者毕业后去向：工作单位：通讯地址：电话：邮编：．盘面fYJlUlllllll[Ifl8J[Ifll9lllftl7IIJ[111lfllf2frlrl／17lIPl[I．士。』Y1897127人体内的血栓常引发严重的心血管疾病，发病突然，死亡率极高，溶栓治疗是抢救与治疗此类疾病的常用手段。纤溶酶则能分解血栓的主要骨架纤维蛋白从而溶解血栓，以恢复血流通畅、促进组织恢复。该酶在发挥溶栓作用时，不水解血浆纤维蛋白质，故不易引起出血倾向。因此纤溶酶具有广阔的

4、研究开发前景。巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)表达系统是目前最优秀、应用最广泛的外源基因表达系统之一。能使外源真核基因正确地翻译和翻译后加工，并能对许多蛋白质产物进行分泌，使产物易于提纯。目前毕赤酵母工程菌摇瓶培养所采用的培养基价格昂贵，本试验在前期已构建产纤溶酶的基因工程菌菌株基础上，对产纤溶酶毕赤酵母基因工程菌的培养基进行探索研究，找到了一种廉价的培养基配方，降低了纤溶酶的生产成本，并对其液体发酵条件进行优化及10L发酵罐的放大试验。在摇瓶发酵水平上，对产纤溶酶毕赤酵母工程菌菌株pk53研究了不同碳源、氮源、磷酸盐、

5、金属离子、表面活性剂等因素对毕赤酵母工程菌菌株pk53产酶的影响，发现麸皮、豆粕粉、磷酸二氢钾浓度对产酶的影响较大。对麸皮、豆粕粉、磷酸二氢钾三因素各选取三个水平进行正交试验，利用单因素试验和正交试验确定确定了其最佳培养基成分。确定该菌株的适宜廉价发酵培养基为：麸皮1．5％，豆粕粉2．0％，KH2P040．5％，MgS04·7H200．05％；分别考察了接种量、甲醇添加量、起始pH值、诱导pH值、装液量等发酵条件对菌株产酶的影响，确定其最佳培养条件为：接种龄14h，接种量l％，甲醇添加量1．5％，培养基装液量30mL(250mL三角瓶

6、)，生长pH为5．5，诱导pH为6．0；设计正交试验来综合考虑甲醇添加量、诱导pH、培养基起始PH、装液量四个因素对产酶的影响。结果发现极差值R装液量>R甲醇添加量>R诱导pH>R初始pH，根据单因素及正交试验结果，确定发酵条件优化配比为：装液量30mL、甲醇添加量1．5％、诱导pn6、初始pH5．5。在此条件下培养，最大酶活为1841．28U／ml，是出发菌株酶活力的3．02倍，且产酶高峰提早l天。以摇瓶发酵试验为基础，进行了10L发酵罐的放大试验，测定了包括相对溶氧’值、pH值、总糖、还原糖、蛋白质、纤溶酶活性在内的代谢情况，为其

7、工业化生产打下了基础。、关键词：毕赤酵母；纤溶酶；发酵；优化AbstractThrombusoftenleadtoseriOUSthromboticcardiovasculardisease,suddenonset,hi【glldeathrate，fibfinol”ictherapyisaconllIlonmeans．Fibrinolyticenzymeisabletobreakdownfibrinclotsandthusdissolveclotstorestorebloodflowandpromotetissuerecovery．t

8、hethrombolyticenzymedonothydrolyzeplasmaproteinfibers，SOunlikelytocausebleedingtendency．Therefore,fibfinol”ice