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1、第38卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究简报第2期2010年2月ChineseJournalofAnalyticalChemistry258~262DOI:10.3724/SP.J.1096.2010.00258基于酪胺信号放大的新型免疫传感器*121222刘梦琴蒋健晖冯泳兰黄勇沈国励俞汝勤1(衡阳师范学院化学与材料科学系功能金属有机材料湖南省重点实验室,衡阳421008)2(湖南大学化学化工学院化学生物传感与计量学国家重点实验室,长沙410
2、082)摘要将酪胺应用于酶联免疫分析,建立了一种新的高灵敏伏安型免疫传感器。利用纳米金的静电吸咐和己二硫醇、巯基乙胺的自组装,将羊抗人IgG抗体固定到金电极表面上,以辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG抗体为酶标抗体,以生物素化酪胺为酶底物,利用催化酪胺沉积反应,在传感界面沉积大量生物素,使原始信号得到几何级数的放大。结果表明,通过生物素化酪胺催化放大后,制得的免疫传感器对H2O2的催化能力增大近20倍,检测hIgG在1.5g/L~22mg/L范围内有良好的线性关系,检出限为0.1g/L。用于实际试样的回
3、收率的测定,结果良好。关键词电化学酶联免疫传感器;信号放大;酪胺氧化沉积;生物素;纳米金1引言酶联免疫分析法是将酶催化反应的放大作用和抗原抗体亲和反应的专一性、特异性相结合,以酶标[1~4]记的抗原或抗体为主要试剂的免疫测试方法,具有很高的灵敏度和选择性。近年来,关于信号放大[5~7]酶联免疫传感器的研究多采用安培型或伏安型免疫传感器。本研究将酪胺应用于酶联免疫分析,建立了一种新的高灵敏伏安型免疫传感器。酪胺,又名对羟基苯乙胺,是一类含氮低分子的生物胺,对[8,9]动植物和微生物有重要的生理作用,具有
4、易发生氧化的特性。酪胺信号放大的主要原理是将酪胺盐(Tyramine)交联上生物素,利用辣根过氧化物酶(HRP)在H2O2存在下催化酪胺盐,形成共价键结合位点,将大量的生物素沉积在要放大的信号位点上。当滴加亲和素化的HRP(AvidinHRP)复合物时,因在信号上存在许多生物素,大量HRP沉积在信号周围,使原始信号得到几何级的放大。生物素为小分子化合物,分子量244。亲和素与生物素有极高的亲和力,结合牢固,而且特异性高,每个亲和素可结合4个生物素,用小分子生物素与HRP酶标记的亲和素发生特异性反应,可减小
5、抗原抗体反应的空间位阻,使反应明显放大。近年来,利用纳米粒子的高比表面积和对电活性物质的催化特性,将纳米粒子引入电化学免疫传感[10,11]器的研究已引起了人们的关注。金纳米粒子有着很好的电子传导和化学稳定等特性,可以强烈地吸附蛋白质抗体。纳米金还能降低一些物质在电极上发生反应的氧化还原的电位,并催化这些物质在[12~14]电极上的电化学氧化还原反应,广泛应用于分析和化学传感领域。本研究利用纳米金的静电作用和己二硫醇、巯基乙胺的自组装,将羊抗人IgG抗体固定到金电极表面上,以辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG抗
6、体为酶标抗体,将生物素化酪胺、亲和素化的HRP酶信号放大引入反应体系,用夹心法进行hIgG抗原测定,灵敏度明显提高。2实验部分2.1仪器与试剂CHI760B电化学工作站(美国CHI公司);三电极工作体系:工作电极为金电极(=1mm),对电极为铂电极,参比电极为饱和甘汞电极(SCE);pHS3C型精密酸度计(上海雷磁仪器厂);781型磁力加热搅拌器(山东鄄城华鲁电热仪器有限公司)。用超高速离心机(Beckman)浓缩胶体金溶液。20090622收稿;20091008接受本文系国家自然科学基
7、金项目(No.20205005)、新世纪优秀人才支持计划基金(No.NCET040768)、湖南省重点学科建设项目和湖南省教育厅科研计划项目(No.07C162)资助*Emai:lliumengqin2004@yahoo.com.cn第2期刘梦琴等:基于酪胺信号放大的新型免疫传感器259hIgG抗原、羊抗人IgG抗体、HRP标记羊抗人IgG抗体、HRP标记的亲和素(北京中杉金桥生物技术公司);牛血清白蛋白(BSA,中国医药公司北京采购供应站);血浆蛋白成分参考血清(上海生物制品研究所);生物素N
8、羟基丁二酸亚胺酯(BNHS)、酪胺、己二巯醇、巯基乙胺(Sigma公司);N,N二甲基甲酰胺(DMF)、对苯二酚(西安化学试剂厂);戊二醛(上海化学试剂公司);氯金酸(上海生化试剂厂)。0.01mol/LPBS缓冲液(pH7.40),所有水溶液均以二次蒸馏水配制。2.2胶体纳米金的制备所有用于纳米金制备的玻璃仪器及聚四氟乙烯搅拌棒均用新制王水清洗,再用水冲洗后烘干备用。参照文献[15]制备胶体金:在500m
