midkine在毕赤酵母中的表达纯化及其种子库的建立

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1、ADissertationSubmittedtoShanghaiJiaoTongUniversityfortheDegreeofMasterEXPRESSIONANDPURIFICATIONOFMIDKINEFROMPICHIAPASTORISANDITSESTABLISHMENTOFYEASTSEEDBANKAuthor：XuYangqiSpecialty:AnimalHusbandryAdvisor:Prof.YuYanSchoolofAgricultureandBiologyShanghaiJiaoTongUniversityShanghai

2、,P.R.ChinaDecember,2013本论文的研究工作受国家自然科学基金（81173113）上海市科委科技支撑项目(12431900600)基金资助摘要Midkine在毕赤酵母中的表达纯化及其种子库的建立摘要Midkine(MK)作为一种肝素结合型生长因子，在胚胎早期的分化发育、肿瘤、炎症、再生等方面发挥着重要的调控作用。为了克服大肠杆菌表达纯化系统中存在的蛋白复性难，产品均一性差等问题，我们建立了以毕赤酵母为工程菌的MK重组蛋白真核表达系统，为其药效、药理的研究提供充足高质量的蛋白原料。考虑到实验动物长期给药的同源性问题，本论文主要包括两

3、部分的研究内容：重组人、重组鼠Midkine(rhMK、rmMK)的真核表达纯化及活性测定和相应种子库的建立和检定。首先，将rhMK全长基因构建到pPICZa(B)表达载体上，通过化学转染方法，转染质粒至不同酵母菌株中进行筛选。利用毕赤酵母的高密度发酵进行表达，纯化出高纯度的rhMK。1.2L发酵液中得到了124.6mg内毒素含量在1.4-7.0EU/mg，高纯度、有活性的rhMK蛋白，符合动物实验要求。其次，构建rmMK优化序列的蛋白表达载体，并转入X33中，通过高密度发酵，最后1.2L发酵液在50ml的SPSepharoseFF层析柱进行纯化后

4、，得到了280mg内毒素含量在0.56EU/mg，纯度大于99%的rmMK蛋白，同时当rmMK的蛋白浓度在20μg/ml时，对UMR106细胞有很好的趋化作用。MK的真核表达与纯化方法的建立为后续的药效学试验奠定了基础，并对其它蛋白的真核表达、纯化也有一定的参考意义。最后，根据上述发酵rhMK菌株，建立了相应的原始种子库、主种子库和工作种子库。各级种子库在YPD平板上都为典型酵母菌集落形态；镜检为典型的酵母菌外观；Westernblot结果显示Midkine的表达量一致；Midkine基因稳定性通过PCR检测，阳性率均高于95%。以上结果完全符合种

5、子库检定要求。I上海交通大学硕士学位论文关键词：中期因子,毕赤酵母,发酵,真核表达纯化,种子库IIAbstractEXPRESSIONANDPURIFICATIONOFMIDKINEFROMPICHIAPASTORISANDITSESTABLISHMENTOFYEASTSEEDBANKAbstractMidkine(MK)isoneoftheheparin-bindinggrowthfactorsthatarestronglyexpressedduringembryogenesis.Itisvigorouslyinvolvedindevelopme

6、ntandregenerationofnormaltissues,aswellasininflammationandtumorigenesis.WeestablishedaPichiapastoris-basedMKproteinexpressionsystem,bywhichwesuccessfullyresolvedtheproblemsabouttheproteinrenaturationandhomogeneity.Theproteinderivedfromthetestanimalspeciesisreasonableandnecessa

7、ryfortheimmunologicalreason.Here,asuccessfulmethodforMKproductionisdescribedandenoughamountofnativeMKwithhighqualitystandardwasobtainedforthefurtherstudy.Also,weestablishedagoodseedbankafterverification.TofacilitatefurtherstudiesofrecombinanthumanMK(rhMK),wedevelopedastrategyf

8、orexpressingandpurifyingrhMKusingPichiapastorisexpressionsyst