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1、水蛭素在毕赤酵母中的分泌表达作者：龙铟，刘家云，刘莉，王宗仁【关键词】毕赤酵母SecretoryexpressionofhirudinsinPichiapastoris 【Abstract】AIM:ToconstructhirudinexpressionvectorsandobtainitssecretoryexpressioninPichiapastoris(P.pastoris).METHODS:HirudinHV2andHV2N47KgenesplifiedbyPCRandthecorrectgenesedintoP.p
2、astorisstrainGSM1168,stablemulticopyintegrantsediumcontainingincreasingconcentrationsofG418.ThenthescreenedoutclonesethanoltoexpresshirudinprotEins.Thesupernatantsofexpressionproductsboticactivityinedtoo.RESULTS:Theexpressionvectorsboticactivity.CONCLUSION:Hirudinsca
3、nbeexpressedsecretorilyinP.pastoris,edicinalis）中分离出的抗凝血活性成分，是凝血酶的天然抑制剂［1］，具有高效的抗血栓形成作用和非常广阔的应用前景［2-3］.但是天然水蛭素来源匮乏，限制了其研究和临床应用，我们以水蛭素HV2,HV2N47K的氨基酸序列为对象，通过PCR扩增得到了目的基因，克隆入毕赤酵母(PichiaPastoris)表达载体pPIC9K中，构建了水蛭素酵母分泌型表达载体，转化SMD1168毕赤酵母细胞并进行诱导表达，获得了具有抗凝血酶活性的表达产物，为水蛭素的研究及
4、临床应用奠定了基础. 1材料和方法 1.1材料质粒pPIC9,pPIC9K,Top10F菌株及毕赤酵母菌SMD1168由本实验室保存.TaKaRaTaq酶，限制性内切酶（EcoRI,XhoI,BamHI,Sa1I），T4DNA连接酶均购自宝生物公司.发色底物ChromozymTH及ECL化学发光检测试剂盒购自Roche公司，鼠抗hirudin单抗(mAb)购自AntibodyShop公司，酵母基因组DNA纯化试剂盒购自上海华舜生物工程公司.电泳仪、电转仪均为BioRad公司产品.引物合成及DNA测序由北京三博远志生物技术公司
5、完成. 1.2方法 1.2.1水蛭素基因的获取根据水蛭素HV2的氨基酸序列，按照 图1目的基因的获取及表达载体的XhoI和EcoRI双酶切鉴定结果（略） 2.2酵母表达载体的构建及鉴定HV2,HV2N47K基因PCR扩增产物经EcoRI和XhoI双酶切，插入pPIC9载体，转化宿主菌TOP10F，提取质粒，DNA测序结果表明所得到的水蛭素基因与预期序列完全一致.序列正确的重组质粒命名为pPIC9HV2,pPIC9HV2N47K，后者经BamHI,SalI酶切后定向插入pPIC9K，得到高拷贝表达载体pPIC9KHV2,p
6、PIC9KHV2N47K，经XhoI,EcoRI双酶切鉴定，得到约220bp的目的基因片段和被切成约4.6kb的两个载体片段(图1)，表明目的基因已正确克隆入表达载体中..L.编辑。 2.3GSM1168的转化及高拷贝整合菌株的筛选SalI线性化的pPIC9KHV2,pPIC9KHV2N47K质粒转化GSM1168感受态细胞，在MDS平板上培养，得到His+转化菌落，将转化的His+菌落点种至含G418浓度为1,2,3,4,5g/L的MD平板上，随G418浓度的增加，GSM1168转化His+菌生长速度出现差异.取5g/LG4
7、18平板上生长的菌落增菌培养，提取酵母基因组DNA，进行PCR鉴定，结果以P1和P2引物所进行的PCR扩增均为阳性（图2），提示水蛭素基因已成功整合到毕赤酵母染色体中. M:DL2000DNA分子量标准；1,8:SMD1168；2~4:pPIC9KHV2整合克隆；5~7:pPIC9KHV2N47K整合克隆. 图2PCR鉴定目的基因的整合（略） 2.4水蛭素的诱导表达重组有水蛭素基因的酵母菌株GSM1168经诱导表达后于培养基中可检出Mr约为7000的蛋白质，该蛋白在培养基中的含量随诱导时间的延长而增多，在诱导表达120h后
8、接近峰值.经D1168中获得分泌性表达（图3）. A:表达产物的SDSPAGE分析；B：表达产物的:蛋白分子量标准；1:pPIC9HV2诱导72h培养上清；2:pPIC9HV2未诱导培养上清；3:pPIC9HV2N47K诱导120h培养上清；4:pPIC9HV
