猪支气管败血波氏杆菌lamp检测方法的建立及流行病学调查

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1、万方数据Category$855．1+2Number$20113116SichuanAgriculturalUniversityMaster，SDegreeDissertationLoop—mediatedisothermalampliftcarlon(LAMP)fordetectionofBordetellabronchisepticaandepidemiologicalinvestigation●⋯inSichuanBy：ZhangHuiDirectedby：Prof．ZhiwenXuProf．ZhuLingMajor：Prev

2、entiveVeterinarymedicine物’anSichuanJune2014万方数据论文独创性声明。j]面JiiJi订f1I而i．i；。。一7IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII]JO120791本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对

3、本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：3跺N关于论文使用授权的声明2014年C月本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研究生签名：嘶导师签名：2⋯年6月l／日2014年6月fJ日万方数据摘要猪支气管败血波氏杆菌(Bordetellabronchiseptica，Bb)能

4、够广泛感染哺乳动物，并且造成急慢性的呼吸道疾病。人偶尔有感染该菌的报道，尤其是有免疫力缺陷的人群和小孩。支气管败血波氏杆菌和其他病原体之间具有协同作用，可以增加呼吸系统的发病率和严重程度。例如，能够和巴氏杆菌引起猪的传染性萎缩性鼻炎(Swineinfectiousatrophicrhinitis，AR)，该病可导致育肥猪生长迟滞，降低饲料的利用率，给养猪业造成巨大的经济损失。本研究分成两个部分，具体如下：第一部分，本研究通过DNAstar等软件对猪支气管波氏杆菌的鞭毛基因序列(flagellumgene，Genbank登陆号：EU3

5、27790，AJ012319，L13034)进行比对分析，在LAMP引物设计网站设计LAMP引物。经过LAMP反应体系条件的优化，确定了259l的反应体系。进行了LAMP方法的特异性试验，结果显示，仅Bb产生特异性条带，说明所建Bb的LAMP方法具有高度的特异性。进行了LAMP方法的敏感性试验，结果显示，常规PCR方法检测Bb的极限为9×102个拷贝，LAMP的检测灵敏度为9．O×10个拷贝，表明LAMP方法的检测灵敏度是常规PCR检测方法的10倍。最后进行了LAMP方法的临床试验，通过对31份猪肺脏病料与46份疑似感染猪鼻腔拭子分

6、别进行细菌分离、PCR、LAMP三种方法检测后，发现猪肺中细菌分离、PCR方法、LAMP方法的检出率分别为9．67％(3／31)、19．4％(6／31)、32．3％(10／31)，而疑似感染组中三种方法的阳性率为19．57％(9／46)、58．14％(20／46)、69．77％(28／46)，且LAMP与细菌分离、PCR方法的阳性符合率为100％，说明本LAMP方法更加适合于Bb的临床检测。第二部份，2012年4至2013年4月间，利用本研究所建立的LAMP方法及参照Townsend等提出的检测产毒素性巴氏杆菌的PCR方法分别对来至

7、四川省的438份鼻腔拭子样品进行了Bb与产毒素性巴氏杆菌(T+Pm)检测。本研究通过对四川省部分地区的规模化猪场的Bb及T+Pm进行流行病学调查，初步掌握了Bb及T+Pm在四川省的流行状况，从Bb的调查结果看来，小规模养殖场30日龄以下、30．90日龄、90日龄以上仔猪的Bb阳性率分别为24．29％(17／70)、39．19％(29／74)及21．79％(17／78)，而大规模养殖场30日龄以下、30．90日龄、90日龄以上仔猪的Bb阳性率分别为32．31％(21／65)、40．26％(31／77)、20．27％(15／74)，万方

8、数据应用凝集试验检测血清样品，检测结果结果显示，438份血清样品的总阳性率为51．59％，小规模养殖场30日龄以下、30．90日龄、90日龄以上仔猪的Bb抗体阳率分别为37．14％(26／70)、51．35％(38／74)、55．13