a2aar对低氧肺动脉平滑肌细胞线粒体凋亡影响的分析

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1、温州医学院硕士学位论文前言慢性阻塞性肺疾病(chronicobstructionpulmonarydisease，COPD)为常见病、多发病。预计至2020年，COPD在全球疾病负担排序中，将位居第五【11。我国成年人抽烟人群众多，据不完全统计，COPD发病率在中国40岁以上人群中高达8．2％[21。随着大气污染加重、人口高龄化及吸烟低龄化，COPD发病率日渐增古[3]同0COPD患者晚期多进展至肺动脉高压(pulmonaryhypertension，PH)，其程度随疾病时间及缺氧程度的增加呈进行性升高M1，晚期可发展为右心功能不全，被认为是

2、COPD患者致死的主要原因，低氧性肺动脉高压的严重程度与COPD的病程、疾病预后、并发症的产生及药物疗效密切相关。既往研究表明，PASMCs的过度增殖，同时凋亡的减少而引起的肺血管重塑在低氧性肺动脉高压(hypoxicpulmonaryhypertension，HPH)的形成中起关键的作用墨3，因此探讨缺氧一PASMCs增殖的细胞分子机制对肺血管重塑、肺动脉高压的发病机制研究具有重要意义。腺苷(Adenosine，AR)是一种嘌呤核苷，它即是腺嘌呤核苷酸的代谢产物，又是其前体，其结构主要由糖苷键连接腺嘌呤和核糖组成【61。腺苷作为化学信号物质

3、，广泛分布于身体各系统，尤以神经系统、循环系统、呼吸系统为著，腺苷可以通过不同的受体发挥不同的生物学效应【71。研究已经证实，腺苷在体内不仅能够有效舒张肺循环血管，降低肺血管压力，而且能够有效减轻肺血管平滑肌的增殖，改善肺血管的重构，已经开始用于临床治疗肺动脉高压【8】。腺苷受体存在4种不同的亚型，分别为A1、A2。、A2b和A3，其中A2受体主要分布在血管内皮细胞、平滑肌细胞，通过兴奋腺昔酸环化酶而介导血管的舒张作用。肺组织及肺血管上存在的腺苷受体主要为A2。受体[91，XuMH等人则进一步通过动物实验证明了，A2。受体基因敲除小鼠在常氧及

4、低氧环境下较野生型小鼠更易导致肺动脉高压的产生【10】，同时通过在体研究发现，A2。受体基因敲除小鼠在肺动脉高压形成的同时右心室收缩压也有不同程度的升高，并且通过进一步的病理组织学观察到肺动脉平滑肌细胞的增殖以及胶原纤维的沉积【11】。既往的研究表明，肺动脉平滑肌的增殖与线粒体的凋亡途径存在紧密联系【12】，细胞线粒体凋亡途径受到抑制可以影响细胞的程序性死亡过程，从而引起细胞增殖增多，凋亡减少。目前研究发现，当凋亡诱导信号通过相应的受体作用于线粒体后，便启动了线粒体的凋亡过程113】，促凋亡蛋白可通过与线粒体外膜的电压依赖性阴离子通道(vol

5、tage．dependentanionchannel，VDAC)相互作用而开放线粒体通透性转变孔(mitochondrialpermeabilitytransitionpore，MPTP)，进而引起细胞色素C从线粒体内释放入胞质中【14】，释放到细胞质的Cyt—C在dATP存在的条件下能与凋亡相关因子-1(apoptosisproteinactivatingfactor，Apafl)结合形成温州医学院硕士学位论文多聚体，并促使含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶．9与其结合而形成凋亡小体(apoptosome)，召集并激活细胞凋亡的关键酶Caspa

6、se一3，引发Caspases级联反应，最终导致细胞的增殖／凋亡的失衡【13】，而在肺动脉平滑肌的增殖与凋亡过程中，也存在着上述机N[Js]，既往的研究表明，腺苷激动腺苷受体可以引起肺动脉平滑肌增殖的减少，缓解肺动脉高压，此过程是否通过影响线粒体凋亡途径而起作用，目前研究仍呈空白，本实验即针对此进行研究和探讨，为以后进一步的研究提供相关理论依据。温州医学院硕士学位论文材料与方法I主要实验试剂DMEM(高糖)培养基、青／链霉素胎牛血清(Fetalbovineserum，FBS)0．25％胰酶／EDTA胶原酶IA2A选择性激动剂CGS一21680

7、二甲基亚砜(DMSO)FITC羊抗小鼠IgG细胞色素C单克隆抗体GAPDH内参抗体线粒体和胞浆蛋白制备试剂盒BCA蛋白质定量试剂盒ECL发光液脱脂奶粉PVDF膜(0．45um，0．22um)SDS—PAGE凝胶配制试剂盒Western一抗稀释液、封闭液SDS—PAGE蛋白上样缓冲液(5×)显影定影试剂盒Tween——20甘氨酸RIPAPMSFSDSSDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)Western一抗稀释液cel1countingkit一8(CCK一8)鼠二步法检测试剂盒DAB显色试剂盒Hank’S液PBS液Gibco公司，美国Sigma公

8、司，美国Tocris公司，英国Sigma公司，美国Invitrogen公司，美国CST公司，美国杭州贤至生物科技有限公司上海超研生物科技有限公司Pierce公司，美