烟曲霉磷脂酶d基因敲除及其功能研究

《烟曲霉磷脂酶d基因敲除及其功能研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、青岛大学博士学位论文烟曲霉磷脂酶D基因敲除及其功能研究姓名：李先平申请学位级别：博士专业：病原生物学指导教师：高美华20120529烟曲霉磷脂酶D基因敲除及其功能研究中文摘要目的：烟曲霉是一种重要的机会致病真菌，它能引起免疫缺陷患者严重的感染。磷脂酶D是病原微生物的一种重要的致病因子。磷脂酶D在烟曲霉中的作用还没有研究和报道。本课题研究磷脂酶D在烟曲霉致病机制中的作用，为进一步探讨烟曲霉的致病机制以及烟曲霉感染的预防和治疗提供新的思路和方法。方法：本研究采用根癌农杆菌介导转化(ATMT)的方法，根据同源重组的原理，用潮霉素

2、抗性基替代烟曲霉磷脂酶D基因，构建烟曲霉磷脂酶D敲除株。通过人肺细胞模型(A549细胞)体外检测烟曲霉磷脂酶D敲除株的粘附能力和侵染能力；通过免疫缺陷小鼠模型(非中性粒细胞减少免疫缺陷小鼠模型和中性粒细胞减少免疫缺陷小鼠模型)检测敲除株在体内毒力的变化。结果：SouthernBlot验证成功得到烟曲霉磷脂酶D的敲除株和回补株。烟曲霉磷脂酶D敲除后，其胞内和胞外磷脂酶D的活性都明显下降。磷脂酶D敲除株菌落大体形态，生长速率，萌发率，茵丝干重及其生物膜形成都无明显的变化。磷脂酶D敲除株对A549的粘附能力无明显变化，但是对A5

3、49细胞的侵染能力显著下降。磷脂酶D敲除株回补磷脂酸(磷脂酶D水解磷脂产生的重要产物)的浓度达到20uM时，其侵染能力恢复到野生株的水平；当磷脂酸回补在100pM的时候，野生株和敲除株的侵染能力无差别。同时，J774细胞(小鼠巨噬细胞)对磷脂酶D敲除株的吞噬能力无变化。磷脂酶D的广谱抑制剂卜丁醇和哺乳动物磷脂酶D1的特异性抑制剂处理孢子后，孢子对A549细胞的侵染能力显著下降，J774细胞对磷脂酶D敲除株的吞噬能力没有变化。敲除株孢子在非中性粒细胞减少免疫缺陷小鼠模型的毒力明显下降，在中性粒细胞减少免疫缺陷小鼠模型的毒力没

4、有明显变化。结论：烟曲霉磷脂酶D敲除株侵染A549上皮细胞能力下降；在非中性粒细胞减少免疫缺陷小鼠模型中的毒力下降；烟曲霉磷脂酶D是烟曲霉的毒力因子之一。博士研究生：李先平(病原生物学)指导教师：高美华教授关键词：烟曲霉；磷脂酶D；基因敲除；毒力因子／㈣嬲TheStudyofAspergillusfumigatusPhospholipaseDGeneDeletionandpld-DeletedStrainAbstractobjective：Aspergillusfumigatus似．fum／gatus)isoneofthe

5、mostprevalentairbomefungalpmhogeninducingseriousinfectionsinimmunocompromisedpatients．PhospholipaseD(PLD)isakeyenzymeinpathogenicmicroorganism．ThereispoorstudyofphospholipaseDinA．fum／gatus．WeexplorethepathogenicmechanismofphoshpolipaseDinA．fum／gatus．Ourstudieswill

6、giveanewwayinpreventionandtreatmentofA．fumigatusinfection．Methods：Wehaveconstructedthepld-deletedstrain(40／,0usingAgrobacteriumtumefaciens．mediatedtransformation(A1’MT)byreplacingA．fumigatusthephoshpholipaseDgenewithhygromycinresistancegene(拗)．Todetecttheadhension

7、andinvasionabilityofthe4脚straininA549cellsinvitroandthevirulenceinimmunosupressionmicewhichwereimmunosuppmssedbyhydrocortisoneacetateorcyclophosphamide，respectively．Results：Wehavegot4ptaandpldcstrainsprovedbySouthernblot．PLDactivitywasconfirmedtosignificantlydecre

8、asebothintraeellularandextraceilular．Thedisruptionofpldgenedidnotalterconidialmorphologicalcharacteristics，growth，germination，hyphaldryweightandbiofilmf