蟠桃磷脂酶d基因克隆及功能分析

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1、独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得新疆农业大学或其他教育单位的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：年月日关于学位论文使用授权的说明本人完全了解新疆农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：新疆农业大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，

2、允许论文被查阅和借阅。本人授权新疆农业大学将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以公布（包括刊登）论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日本文是国家自然科学基金项目“新疆蟠桃果实采后品质调控中磷脂酶D作用机理的研究”霍英东教育基金项目“新疆蟠桃磷脂酶D基因的克隆与功能分析”的部分研究成果（项目编号：30860171、121109）课题主持人：袁海英副教授（新疆农业大学）蟠桃磷脂酶D基因的克隆及功能分析摘要蟠桃是典型的跃变型果实，采收后极易腐烂变质，不耐储藏，其果实采后保

3、鲜是生产实践中亟待解决的一个难题。李银等在前期研究中发现磷脂酶D（PLD）抑制剂处理有利于“英格尔”蟠桃（PrunuspersicaL.Bastchcv.„Yingger‟）采后品质的保持。为了进一步深入了解PLD在蟠桃果实发育及采后储存中的作用，本研究从筛选优化提取蟠桃果实总RNA入手，对蟠桃磷脂酶D基因进行克隆、研究磷脂酶D基因在果实不同发育阶段、不同处理条件下的表达模式，并构建RNAi表达载体遗传转化草本果树草莓，主要研究结果如下：（1）以盛花后100天的蟠桃果实为材料，通过筛选发现改良CTAB法是适合蟠桃果肉总RNA提取的方法。根据桃的保守

4、序列设计引物，以蟠桃果实cDNA为模板，利用RT-PCR技术扩增得到1097bp的片段，与GeneBank中发表的桃的PLD基因进行多重比较，同源性达到99.36%，确定该片段为蟠桃PLD基因的片段。（2）以114bp的蟠桃PLD的cDNA片段为探针，通过Northernblot分析蟠桃果实PLDα基因在果实生长发育期间和低温贮藏期间不同处理下的mRNA的表达模式发现：随果实发育成熟磷脂酶D基因的表达逐渐增强，尤其在果实发育的后期；磷脂酶D抑制剂处理蟠桃果实在一定程度上降低了果实内部磷脂酶D基因的表达活性。（3）根据蟠桃PLD的cDNA序列，通过R

5、T-PCR扩增约347bp的保守片段，将目标片段插入到pSK-int中间表达载体中,获得pSK-PLD-RNAi中间表达载体，然后将其转入植物双元表达载体pCAMBI1301中，构建该基因的shRNAi表达载体pCAMBIA-PLD-RNAi。经限制性内切酶酶切和测序鉴定证明蟠桃磷脂酶D基因的RNAi表达载体pCAMBIA-PLD-RNAi构建成功。（4）利用农杆菌介导法转化草莓(FragariaananassaDuch.)，经Km选择压初步筛选出5株转基因草莓植株。对获得的抗性植株进行PCR扩增，获得4株阳性植株，初步表明目的基因已插入到草莓基因

6、组中。关键词：蟠桃；PLD；Northernblot；RNAi表达载体；遗传转化ICloningandFunctionAnalysisofPhospholipaseDGeneinFlatPeachFruitAbstractFlatPeachfruit(PrunuspersicaL.Batsch)isatypicalclimactericfruitanditreachesmaturityinshorttimeafterharvestandthengetsrotteneasily.Therefore,howtoextenditsshelftimebec

7、omesaurgentproblemthatneedtobesolved.PreviousresearchofLietalfoundthatphospholipaseD(PLD)inhibitortreatmenthelpedqualitymaintenanceofflatpeachfruitsafterharvest.TofurtherinvestigatethefunctionofPLDinfruitdevelopmentandpostharveststorageofflatpeachfruit,weselectedandoptimizedth

8、etotalRNAextractionmethod,clonedPLDfromflatpeachfruit,underto