禾谷镰刀菌中FgPDE1基因的敲除及其功能的研究

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1、中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１５，３５（８）：５９６７ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ．２０１５０８０９禾谷镰刀菌中ＦｇＰＤＥ１基因的敲除及其功能的研究常玉梅侯占铭（内蒙古师范大学生命科学与技术学院呼和浩特０１００２０）摘要目的：旨在敲除禾谷镰刀菌ＦｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍＦｇＰＤＥ１基因，确定其缺失突变体表型，从而分析该基因的生物学功能。方法：应用Ｓｐｌｉｔｍａｒｋｅｒ技术构建含有潮霉素基因敲除盒，通过ＰＥＧ介导原生质体转化，ＰＣＲ筛查抗潮霉素转化子以获得缺失突变体ΔＦｇＰＤＥ１，根据突变体表型变化及致病性的检测

2、对ＦｇＰＤＥ１基因的功能进行分析。结果：采用Ｓｐｌｉｔｍａｒｋｅｒ技术，成功构建了ＦｇＰＤＥ１基因敲除盒；ＰＥＧ介导转化禾谷镰刀菌原生质体后成功获得转化子。经ＰＣＲ筛查，得到３个ＰＣＲ确认的敲除突变体；表型观察发现，ΔＦｇＰＤＥ１菌落的外型及菌落生长速度与野生型没有明显差异。孢子侵染西红柿果实实验证明：以西红柿为侵染宿主，相对于野生型，突变体致病性没有明显减弱；但突变体分生孢子产量显著下降。结论：ＦｇＰＤＥ１基因可能与禾谷镰刀菌分生孢子的形成有关。关键词禾谷镰刀菌ＦｇＰＤＥ１基因敲除ＳｐｌｉｔＭａｒｋｅｒ中图分类号Ｑ７８９小麦赤霉病［Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａｚｅａｅ（

3、Ｓｃｈｗ．）Ｐｅｔｃｈ］是我国测定的成功为研究它的基因组功能及致病机理提供了［１１］气候温暖潮湿麦区的重要病害，其中禾谷镰刀菌遗传基础。自１９９５年首次成功克隆禾谷镰刀菌的［１］（Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）为致病优势种。禾谷镰刀菌致病基因以来，已有多个致病相关的基因被克隆和鉴［１２］的有性世代为玉蜀黍赤霉（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａｚｅａｅ），无性世代定出来了。如Ｔｒｉ５与毒素的合成有关，ＭＧＶ１在菌［２］属于半知菌亚门的镰孢属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）。禾谷镰刀菌体的异核体的形成、雌性繁殖以及侵染寄主等过程中［１３］是单核细胞，染色体也为单倍体，无性世代产生分生孢

4、都起着重要作用，脂酶基因ＦＧＬ１的缺失会使致病［３］力减弱，毒性下降［１４］，基因ＰＫＳ４参与合成玉米赤霉烯子，有性世代产生子囊孢子。禾谷镰刀菌中的主要［１５］［１６］真菌毒素是脱氧雪腐镰刀菌烯醇（ｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌ，酮，ＸＹＲ１影响细胞壁完整性，ＦｇＥｎｄ１基因与内［４］吞机制有关［１７］，ＦｇＦｌｂＤ调节有性和无性繁殖的菌丝分ＤＯＮ）和玉米赤霉烯酮（ｚｅａｒａｌｅｎｏｎｅ，ＺＥＡ）。真菌毒［１８］素是一类由丝状真菌在适宜条件下产生的有毒的次生化，ＥＬＰ３参与禾谷镰刀菌的繁殖、毒力和氧化应激［５］反应［１９］等等。代谢物，对人类和动物都造成了一定的威胁。一

5、种名为多菌灵的苯并咪唑杀菌剂一度用于赤霉病的防在酿酒酵母中，腺苷调节养分感应，假菌丝分化，治，然而使用时间过长就会使赤霉菌产生抗药性，于是细胞周期进程和应激信号。在裂殖酵母中，交配，孢子更为先进、稳定的降低禾谷镰刀菌致病力的方法尚待形成和糖异生都是通过ｃＡＭＰ途径控制的。在致病真研究。随着生物技术、基因工程、遗传分子生物学等学菌中，如白色念珠菌和隐球菌，ｃＡＭＰ信号影响性分化，［２０］科的发展，通过敲除禾谷镰刀菌中的某些致病基因，而抗逆性和毒力的几个重要方面。酿酒酵母细胞内使它的侵染力减弱，从遗传角度上彻底防治赤霉病，已ｃＡＭＰ水平分别受到低亲和性磷酸二酯酶ＰＤＥ１和

6、高成为一种理想的方式［６１０］。禾谷镰刀菌全基因组序列亲和性磷酸二酯酶ＰＤＥ２的活性影响，ＰＤＥ２调节基础ｃＡＭＰ水平，ＰＤＥ１却对基础ｃＡＭＰ水平的影响不显著。收稿日期：２０１５０３１０修回日期：２０１５０４０１国家自然科学基金资助项目（３１１６０２８０）然而，ＰＤＥ１在葡萄糖存在的诱导下调节ｃＡＭＰ水平，通讯作者，电子信箱：６７０６４５３３７＠ｑｑ．ｃｏｍ；ｈｏｕ４２＠ｗｉｓｃ．ｅｄｕ而且ＰＤＥ１对ｃＡＭＰ的分解活性受到ＰＫＡ催化亚基的６０中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＶｏｌ．３５Ｎｏ．８２０１５正调控。从新生隐球菌报告的ＰＤ

7、Ｅ１和ＰＤＥ２的特性技术构建敲除载体，以ＰＣＲ为基础，经过两轮ＰＣＲ扩表明，ＰＤＥ２对于调节细胞内ｃＡＭＰ水平没有明显的作增构建敲除载体导入受体细胞，用ＰＣＲ方法确认敲除用，此基因的缺失只能导致细微的表型变化。然而，突变体，再根据对突变体的观察以及致病力的检测做ＰＤＥ１显然是依赖于ｃＡＭＰ的信号传导途径，调节毒力初步的判断，为进一步研究此基因的功能做铺垫。属性的一部分。ＰＤＥ１由ＰＫＡ１激活，它是ＰＫＡ活化负１材料与方法反馈环路控制这个致病真菌胞内ｃＡＭＰ水平的一个重［２１］要部分。以上研究表明，研究ＰＤＥ１基因对深入研１．１材料究ｃＡＭＰ的信号级联