mir-217靶向调控e2f3在肝细胞癌侵袭转移中的作用研究

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1、万方数据中图分类号UDCR735．7610博士学位论文学校代码密级10533公开miR．217靶向调控E2F3在肝细胞癌侵袭转移中的作用研究R℃searchontheroleofmiR一217targetingE2F3intheinVasionandmetastasisofhepatocellularcarcinoma作者学科研究学院(指导名：苏婧业：临床医学向：肿瘤学所)：湘雅医院师：钟美佐教授中南大学2014年05月飘刨姓专方毳教万方数据学位论文原创性声明嗍圳㈣川川Ⅲ㈣圳圳圳删Y2685399本人郑重声明，所呈交的学位论文是

2、本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。作者签名：脚日期：丝型年—三月j生日学位论文版权使用授权书本学位论文作者和指导教师完全了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定：即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版；本人允许本学位论

3、文被查阅和借阅；学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其它手段保存和汇编本学位论文。保密论文待解密后适应本声明。作者签名：蕴盗导师签名日期：辎年』月兰日日期：掣年上月蜩万方数据miR一217靶向调控E2F3在肝细胞癌侵袭转移中的作用研究摘要：【研究背景与目的】肝癌是世界范围内最常见且恶性程度很高的肿瘤之一，严重危害人类健康，尤其在我国肝癌死亡率位居各种肿瘤死亡率的第2位，且死亡率仍呈上升趋势。尽管近年来针对肝癌的治疗方法取得了长足的进展，但肝癌的总体治疗效果仍相当不理想，其中肝癌的侵袭转

4、移和复发是影响肝癌综合治疗效果提高的关键因素。因此，阐明肝癌发生侵袭转移的分子机制，明确肝癌发生侵袭转移的始动因素，筛选鉴定肝癌侵袭转移新靶点，从分子层面对肝癌侵袭转移进行诊断或干预有重要的理论和现实意义。近年来，miRNAs作为表观遗传学方式转录后调节器基因的表达式在肿瘤中的功能作用倍受关注，基础研究与临床观察发现mi砌峪s可能参与包括肝癌在内的几乎所有肿瘤的发生发展、治疗转归及预后等各个环节。其中miIⅢAs可能通过影响肿瘤细胞的运动能力、肿瘤血管生成及肿瘤微环境等参与肿瘤的侵袭转移，尽管miRNAs在肝癌中的作用已有所报道

5、，但miRNAs在其侵袭转移中的作用及其机制仍未完全明了。故本课题将从细胞和临床组织标本中分析潜在抑癌基因miR一217与肝癌侵袭转移的相关性，并通过生物信息学分析结合实验验证探讨miR．217参与肝癌侵袭转移的可能分子机制，为进一步探讨肝癌侵袭转移的分子信号调控网络、开展以miR-217为靶点研究针对肝癌侵袭转移的新的治疗策略提供重要的理论依据。【方法】1．体外培养具有不同侵袭能力的肝癌细胞Huh7、HepG2、SMMC7721、MHCC二97L和MHCC．97H，用Transwell实验验证各细胞系的侵袭能力，用miIⅢAs

6、抽提试剂盒抽提各细胞的miI矾As和mIⅢA，经miRNAs特异性逆转录试剂盒逆转录后，以U6为内参，用实时定量PCR检测各细胞中miR一217的表达情况；2．将细胞培养至50％．70％融合度时，用脂质体法将miR一217mimics或相应对照导入MHCC．97H细胞以过表达miR一217，用Transwell实验检测转染前后细胞侵袭能力的变化；3．将细胞培养至50％一70％融合度时，用脂质体法将miR一217万方数据特异性抑制物(inhibitor)或相应对照分别导入Huh7和MHCC．97L细胞以抑制miR一217的表达，用

7、TransWell实验检测转染前后细胞侵袭能力的变化；4．收集临床肝细胞癌组织及正常肝组织标本，根据转移情况分为转移组和非转移组，用miRNAs抽提试剂盒抽提各肝癌组织及正常肝组织中miRNAs，逆转录后，用实时定量PCR检测各组织中miR．217的表达情况；5．通过在线生物信息学数据库分析miR．217的可能靶基因，并选择在物种间具有保守性的miR．217靶向调控的基因E2F3用于后续研究；6．将抽提的各肝癌细胞mRNA逆转录后，用实时定量PCR检测mRNA水平E2F3的表达，抽提各细胞系及有／无miR一217表达干预细胞系的

8、蛋白后，用Wbstemblot检测E2F3在蛋白水平的表达；7．合成含有SpeI和HindIII酶切位点及miR．217结合位点的E2F3mRNA3’UTR的DNA片断(野生型)或缺失miR．217结合位点的DNA片段(突变型)，分别克隆入miRNA报告基因载体