多重耐药大肠埃希菌质粒介导的喹诺酮耐药基因研究

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1、温州医学院硕士学位论文多重耐药大肠埃希菌质粒介导的喹诺酮耐药基因研究姓名：尚忠波申请学位级别：硕士专业：临床检验诊断学指导教师：陈秀枢2012-05-19温州医学院硕士学位论文多重耐药大肠埃希菌质粒介导的喹诺酮耐药基因研究中文摘要目的：1、以临床分离多重耐药大肠埃希菌(Escherichiacoli，Ecoli)为研究对象，对质粒介导的喹诺酮类耐药机制(plasmid．mediatedquinolonesresistance，PMQR)进行研究。2、对临床分离的多重耐药E．coli中喹诺酮外排泵基因q

2、epA的携带率、接合传递效率、基因功能等进行研究。方法：1、以2004年1月～2008年12月间临床分离的136株多重耐药大肠埃希菌为研究对象，采用VITEK．GNS药敏卡测定136株多重耐药大肠埃希菌对14种抗菌素的敏感性；PCR法筛检136株多重耐药大肠埃希菌PMQR基因：qnr基因，包括qnrA、-B、-S、～C和~D，qepA基因以及氨基糖苷类乙酰转移酶基因aac一陋')-Ib。aac一何")-Ib阳性PCR产物回收纯化后经FokI酶切，确定aac(6")-Ib—Cr。对qepA阳性菌株作16

3、SrRNA甲基化酶基因rmtB的检测。PMQR阳性菌株进行接合传递实验，接合子的耐药基因经PCR鉴定确认。2、以初筛qepA阳性菌为研究对象，提取qepA基因阳性菌株及其接合子质粒，绘制质粒图谱。琼脂扩散法检测qepA接合子的MIC。以一株qepA基因阳性菌株为模板，扩增qepA全长，与pET-12a质粒构建重组质粒，并转化入E．coliBLl2宿主菌，研究qepA功能。结果：1、136株多重耐药大肠埃希菌中共检出72株携带PMQR基因，其中，54株为携带单基因者，18株为两种或两种以上基因同时存在，

4、PMQR基因的总阳性率为52．9％(72／136)。在32株(23．5％)qnr基因阳性株中，检出的阳性基因数分别为qnrB14(10．3％)，qnrA13(9．56％)，qnrS12(8．82％)，未检出qnrC和qnrD；而aac(6’J勘一cr的检出率高达30．1％(41／136)，还检出qepA19株(14．O％)。在19株qepA阳性菌中，有16株携带rmtB基因，二者的共存率高达84．2％。另外，通过接合传递实验，成功接合qnrA5株，qnrB8株，qnrS2株，qepA12株，aac简，

5、．／b—c，15株，未获取同时含有两种或两种以上PMQR耐药基因的接合子。2温州医学院硕士学位论文2、质粒图谱绘制发现，供体菌和接合子质粒均含有约23kb的质粒。与E．coliBL21(pET-12a)相比，诺氟沙星、环丙沙星和左氧氟沙星对E．coliBL21(pET-12a．qepA)的MIC分别升高64倍、32倍和4倍；而与羰基氰氯苯腙(carbonylcyanidem—chlorophenylhydrazone，CCCP)联合应用时三种药物的MIC值则至少降低为原值的1／4。进一步检测菌体内环丙

6、沙星含量，在不含CCCP时，E．coliBL21(pET-12a．qepA)菌体中环丙沙星低于E．coliBL21(pET-12a)或E．coliBL21(P<0．01)：加入CCCP后，菌体内环丙沙星含量明显升高(尺O．01)o结论：本组多重耐药大肠埃希菌中PMQR总阳性率为52．9％(72／136)，其主要耐药基因的分布依次为aac佑，J舶．Cl"(30．1％)、qnr(23．5％)和qepA(14．0％)。接合传递实验显示PMQR阳性株的一次接合成功率高达58．3％(42／72)，未获取同时含有

7、两种或两种以上PMQR耐药基因的接合子，提示其在细菌问水平传播的概率高，还初步表明，PMQR在菌际间的传播以单基因水平传播为主要方式。另外，qepA阳性株伴随rmtB共存率高达84．2％，并且19株qepA阳性菌获得的12株接合子中rmtB基因阳性者9株，占75％，表明qepA基因和rmtB基因具有较密切的相关性和共存率，且容易在菌际间共同传播；结合aac(6，勘一cr基因30．1％的检出率，表明喹诺酮类PMQR与氨基糖苷类耐药机制具有高度的相关性。对pET-12a-qepA重组E．coli的相关研究

8、表明，诺氟沙星、环丙沙星和左氧氟沙星对E．coliBL21(pET-12a-qepA)的MIC较E．coliBL21(pET-12a)升高了4～64倍，而上述药物与CCCP联合应用后，对E．coliBL21(pET-12a-qepA)的MIC至少降低为原值的1／4。qepA可编码依赖质子泵的外排蛋白，降低药物在细菌体内的含量，从而使细菌对药物的敏感性下降。关键词：大肠埃希菌；多重耐药；质粒；喹诺酮；qepA温州医学院硕士学位论文TheStudyonthe