抗流感病毒b单抗杂交瘤细胞cdna文库构建及生物信息学分析

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1、第三军医大学博士学位论文抗流感病毒B单抗杂交瘤细胞cDNA文库的构建及生物信息学分析摘要流行性感冒(influenza，简称流感)是由流行性感冒病毒引起的急性呼吸道传染病，是人类面临的主要公共健康问题之一。据统计，流感每年的发病率为10％～30％，其流行病学的特点是：突然暴发，迅速蔓延，播及面广。流感流行具有一定的季节性。我国北方常发生于冬季，而南方多发生在冬夏两季。流感发病率高，人群普遍易感。流感临床症状较重，起病急骤，并发症发生率高，特别是肺炎，可引起死亡，死者大多为年迈体弱和幼年多病或有慢性基础病者。B型流感病毒近年来常造成流感局部区域性暴

2、发。病毒的感染过程其实就是病毒与宿主或机体相互斗争的过程。杂交瘤细胞是一种“1+1>2”的特殊细胞，其分泌抗体的基因源于受到免疫原刺激的宿主免疫细胞一一B细胞。她的基因组承载着病原体与宿主相互作用的信息，同时由于整合了肿瘤细胞的“长生基因”，使其成活时间明显延长，而且极有可能产生一些基因的突变和重组，并由此产生一些抗体之外的新物质。因此流感病毒B单抗杂交瘤细胞基因组的研究是一个值得探索的课题。如何迅速、高效的从基因组中获取生物学信息，是一个富有挑战性的课题，EST技术就是基于这种认识而发展起来的。本试验用纯化的FluB抗原免疫小鼠，拟制备能稳定分

3、泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，为研制一种方便、快捷、特异的金标试纸快速诊断方法打下坚实的基础，同时拟构建分泌抗FluB抗体杂交瘤细胞cDNA文库并测序，获取EST片断，再通过美国国家生物信息中心(NationalCenterBiotechnologyInformation，NCBI)服务器的UniGene数据库进行BLAST检索，应用sequencher软件对EST序列进行片断重叠群分析，应用生物信息学方法研究杂交瘤基因，为预测和进一步开发杂交瘤细胞的功能提供理论基础。方法和结果：1．应用纯化的B型流感病毒抗原免疫BALB／cd"鼠，经过5次

4、免疫、细胞融合、融合细胞的亚克隆，获得了3株能稳定分泌抗B型流感病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞，分别命名为：382，12G3，5A4。3株杂交瘤细胞株染色体计数检测显示接近亲本细胞染第三军医大学博士学位论文色体数目之和。3株单抗的重链均为IgGl型，轻链为1(链，单抗效价较高、与A型流感病毒和RSV均不发生交叉反应。2．应用经典eDNA文库构建方法，经过细胞总RNA的提取、mRNA的分离，以带有多聚腺苷酸的mRNA为模板，反转录合成eDNA第一链，第二链，eDNA双链和载体的连接，转入受体菌，构建成杂交瘤细胞的eDNA文库。该文库库容为1．27x10

5、6。3．原始文库中挑选了400个克隆，测序共得到384个序列，测序成功率为96％，将序列编辑后去除载体序列后得到长度在200bp～700bp的有效序列320条。经过BLAST程序对所获得的EST片断进行基因，结果显示有118条序列与数据库中的已知基因有较好的相似性。经过Sequencher4．8软件将384条EST片断的进行片断重叠群(eontig)分析，结果共得到包括71条EST序列在内的25组片断重叠群，占全部EST序列的22．2％，其余249条都属于单拷贝序列。结论：1．成功制备抗B型流感病毒杂交瘤细胞株，为金标法快速诊断B型流感病毒感染奠

6、定了基础。2．抗B型流感病毒杂交瘤细胞cDNA文库的成功构建和部分克隆的测序，对于新基因的克隆和功能研究提供了可用资源，同时对预测和进一步开发杂交瘤细胞的功能提供了良好的物质基础。3．为建立杂交瘤细胞的资源信息库做了重要的开端工作。关键词：B型流感病毒杂交瘤抗体eDNA文库生物信息学EST第三军医大学博士学位论文PreparationofcDNALibraryfromhybridomacellswithmonoclonalantibodyforInfluenzaBvirusandl●■n·●-●DioinlormaticsanalysisAbst

7、ractInfluenzacausedbyinfluenzaviruswasaacuterespiratorytractinfectiousdisease，spreadrapidlyandeasilyantigenvariation．Virus7Sinfectionprocessisactuallytheprocessthatmutualstruggleprocessofvirusandthehostororganism．hybridomacellwasaspecialcompositecell，whosesecretoryantibodygen

8、ewasoriginatedBcellwhichwasaimmunocyteirritatedbyimmunogen，Bcell7Sge