脂筏特异蛋白对囊泡转运作用的初步研究

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1、华中科技大学硕士学位论文脂筏特异蛋白对囊泡转运作用的初步研究姓名：曹惠雅申请学位级别：硕士专业：生物物理学指导教师：徐涛20050427华中科技大学硕士学位论文摘要细胞物质转运实质上是细胞内的一个庞大而复杂的物流系统，这一系统的异常将导致各种相应疾病的发生。囊泡是这一物流系统中一种可调控的重要的运输工具，脂筏是膜脂双层内含有特殊脂质及蛋白质的微区，它们在这一物流系统中具有重要的作用。本课题引入单分子研究技术和全内反射荧光成像技术，实时动态的研究了两类脂筏蛋白与囊泡之间的动态空间定位关系，并分析了其中一类脂筏蛋白的动力学特征。这一研究有助于我们进一步揭示脂筏的发生机制；而且对于今后我们进一步

2、认识脂筏功能具有重要的理论及实际指导意义。本论文首先构建了含荧光标记的caveolin和flotillin两类脂筏特异性蛋白的表达质粒，初步研究了细胞膜脂筏和囊泡转运的关系。本实验中我们具体采用全内反射荧光显微成像技术研究了在小鼠肾上腺嗜铬瘤细胞系（PC12）中caveolin和NPY、SNAP25的胞内动态定位关系和相互作用以及flotillin和NPY、SNAP25的胞内动态定位关系和相互作用。结果显示：caveolin无论是在静息状态还是在高钾刺激下与NPY大囊泡或与SNAP25均没有明显的共存现象。同样flotillin与NPY大囊泡和SNAP25也没有明显的共存关系，而且flot

3、illin自身在TIRFM下呈一种片状分布，这说明flotillin在表达后即分布在细胞膜上。从定位关系上来看，脂筏标记蛋白没有明显参与大囊泡转运的证据。这与以前人们用化学方法抽提PC12细胞，发现构成SNARE蛋白的SNAP-25在富含胆固醇的脂筏中的结论不相同。这种不同的原因：一方面有可能是实验方法的不同造成的，另一方面有可能是因为大囊泡的转运不需要脂筏的介导。另外，PC12细胞中转染caveolin-1-EGFP后，采用全内反射荧光显微成像技术记录+到在60mM的K刺激前后携带caveolin-1的囊泡运动具有显著差异。与此同时，我们还分析了caveolin标记的一种囊泡的动力学特征

4、。关键词：脂筏小窝Caveolin-1Flotillin-1TOPO载体全内反射荧光显微成像技术I华中科技大学硕士学位论文AbstractThevesiclestransportisacomplicatedsystemincellinwhichmaterialsaretransferedanyabnormityofthesystemwouldresultsincorrespondingdeseases.Vesiclesfunctionastransportcarriesandcanberegulated.Lipid-Raftisamicrodomaincontainingspecialli

5、pidsandproteinsbetweenthetwolayersofcellmembranesandplaysanimportantroleinvesiclestransport.Inthisthesis,singlemeleculartechniqueandtotalinternalreflexfluorecencemicroscopeimagingtechniquewereusedtoinvestigetedthelocationandmobilitycharacteristicsofcaveolinandflotillininthereal-timedynamicandspace

6、locationrelationbetweenthelargedensecorevesicles(LDCVs)andtwokindsoflipidraft.Thestudywillbeveryinterestinginillustrationsofthemechenismsofvesiclestransportandbenificalinfurthersightingintothefunctionsoflipid-raft.Inthepresentstudy,wehavestudiedtherelationshipsbetweenthevesiclestransportandlipidra

7、fts.Lipidraftsarespecificmembranemicrodomainsthatarerichincholesterol,glycosphingolipidsandglycosylphosphatidylinositollinkedmolecules.Theyplayroleinthesystemofproteintrafficking.Herewehavelabeledthecaveolinandfl