苯并芘诱导人支气管上皮细胞转化过程中sirt1调控tnf-α表达的机制研究

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2、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．33分析与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．43，J、结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．46参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯47致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．51综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．52学位论文独创性声明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．64关于学位论文使用授权声明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．64万方数据温州医科大学硕士学位论文中英文缩略词对照表

3、IIIEI411141111IIIIIIIIIil1[1111LIIlY26919961万方数据温州医科大学硕士学位论文中文摘要苯并芘诱导人支气管上皮细胞转化过程中Sirtl调控TNF

4、-Q表达的机制研究目的：研究去乙酰化酶Sirtl对B[a]P诱导的支气管上皮细胞炎性反应中TNF-a表达的调控作用和调控机制，以及对细胞迁移和侵袭的影响。背景：沉默信息调节因子l(Silentinformationregulatorl，Sinl)是一个具有尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+依赖性的Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶，它可以使组蛋白和非组蛋白因子发生去乙酰化，从而调控细胞衰老、细胞凋亡、能量代谢、DNA修复以及细胞凋亡等生命过程。人类Sirtl通过调控细胞的存活以及能量代谢过程中等多种机体的生理以及病理性过程，从而参与了多种人类疾病如肿瘤、神经退行性疾病、心血管疾病等的发生、发展。肿瘤坏死

5、因子TNF．仅是一种主要由单核巨噬细胞、淋巴细胞产生的细胞因子，它具有多种生物学功能，在细胞凋亡、生存、炎症反应和免疫防御等方面都发挥了重要的作用，是炎症反应过程中出现最早、最重要的炎性介质。由于炎症环境能够促进肿瘤细胞的侵袭和转移，因此炎症的持续存在与癌症的形成之间存在紧密联系。同时，Sinl可以和多种细胞因子相互作用对机体产生不同的影响，其中就包括有肿瘤坏死因子TNF．Q，在炎症过程和肿瘤的发生发展过程中起着重要的作用。本研究是在苯并芘B[a】P暴露下，Sirtl基因对肿瘤坏死因子TNF-(％的调节作用及其调节机制的初步探索。方弦：1．WesternBlot蛋白质印迹技术检测Sir

6、tl蛋白的表达水平提取Beas．2B细胞的总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，然后采用WesternBlot检测Sirtl蛋白表达情况。2．Real．timePCR鉴定SirtlmRNA的表达提取Beas一2B细胞的总RNA，NANODROP2000测定RNA浓度，逆转录后通过Real—timePCR检测Sift1mRNA的表达情况。3．质粒转染将Sirtl基因过表达质粒、Sirtl基因沉默质粒和相对应的空载体采用脂质体转染法转染到人支气管上皮细胞(Beas．2B)中，采用WesternBlot蛋白质印迹技术鉴定转染效果，加抗生素筛选出Beas．2B-pcDNA3．1、万方数据温州医科大学

7、硕士学位论文Beas一2B—Sirtl—overexpression、Beas一2B-pGPU6、Beas．2B—Sirtl．shRNA稳定转染细胞株。4．Real-timePCR检测炎症因子TNF．amRNA的表达提取Beas一2B-pcDNA3．1、Beas．2B—Sirtl—overexpression、Beas．2B-pGPU6、Beas一2B-Sirtl．shRNA稳定转染细胞株的总RNA，NANODROP2000测定RNA浓度，逆转录后通过Real．timePCR检测TNF．amRNA的表达情况。5．构建质粒根据UCSCGenomeBrowser网站数据库检索获得的TNF．

8、a启动子序列设计引物，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增目的片段，然后将目的片段和载体进行双酶切，连接后转入E．coliDH5{1感受态细胞，提取质粒。将质粒双酶切鉴定，同时送公司进行DNA测序。6．双荧光素酶活性检测将构建成功的TNF．a启动子双荧光素酶报告基因重组质粒采用脂质体转染法转染到Beas-2B-pcDNA3．1、Beas．2B．Sirtl．overexpression稳定转染细胞株中，采用双荧光素酶报告系统检测Sirtl对TNF-{