《猪圆环病毒2型和猪细小病毒体外混合感染致病机制的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
万方数据PATHOGENESISOFPORCINECIRCoⅥRUSTYPE2ANDPoRCINEPARVoVIRUSCoINFECTIoNINVITRoByWangYongshuaiSupervisor：Prof．：YangDejiATHESISSubmiRedtoNanjingAgriculturalUniversityInPartitalFulfillmentofTheRequirementsfortheMaster’SDegreeofAgronomy(VeterinaryMedicine)CompletedinMay2014CommencementinJune2014 万方数据原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者(需亲笔)签名：羔多弋I／十如l忤／月3日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权南京农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。／保密口，在年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密圈／(请在以上方框内打，，v”)学位论文作者(需亲笔)导师(需亲笔)签名：纱l甲年乃lf年乡月3日∥月3日 万方数据目录摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯IABSTRACT⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．III英文缩略词表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯VII第一部分文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1第一章猪圆环病毒2型的国内外研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11猪圆环病毒2型概述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一11．1病原学⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11．2猪圆环病毒的基因结构及编码蛋白⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．3病毒编码的蛋白⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31．4流行病学⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯32病毒与宿主免疫系统的相互作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。42．1免疫细胞的感染⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯42．2IL．10等细胞因子在PCV2发病机制中的作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯52．3病毒和宿主蛋白之间的作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯72．4病毒DNA和宿主蛋白之间的相互作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．73猪圆环病毒2型的致病机制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．83．1淋巴细胞缺失和免疫抑制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯83．2PCV2感染和细胞凋亡⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一83，3PCV2病毒毒力⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．93．4遗传易感性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯93．5PCVAD相关的免疫增强作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯104保护性免疫⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯lO4．1疫苗与免疫⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．104．2中和抗体和细胞免疫在保护中的作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1l5PCVAD的防治⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一¨6总结和未来展望⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯12参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯13第二章猪细小病毒及与猪圆环病毒混合感染的研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯211病原学⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2l2流行病学及致病机制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2l2．1流行病学⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．212．2致病机理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．223PCV2与PPV混合感染的研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．22第二部分实验研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．27第三章PCV-2，PPv'IFN-7，TNF-et，IL一10和13-actin部分基因片段real．timePCR检测方法的建立⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．27l材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．281．1毒株、细胞株和菌株⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．28 万方数据猪圆环病毒2型和猪细小病毒体外混合感染致病机制的研究1．2载体⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．281．3主要试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．281．4主要仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一282方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．292．1PCV2病毒的增殖及TCID50的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．292．2PPV病毒的增殖及TCID50的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯292．3基因组的提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．302．4引物的设计与合成⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．3l2．5目的基因的扩增⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．322．6PCV2、PPV及细胞因子重组克隆质粒的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．332．7real—timePCR方法的建立⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一352．8real．timePCR反应条件的优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．362．9real—timePCR方法学评价⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．373结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯383．1PCV2、PPV及猪细胞因子目的基因的扩增⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯383．2重组质粒的双酶切鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．393．3重组质粒浓度的计算⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．403．4反应条件的优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．4l3．5real—timePCR方法学评价⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．434讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯45参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯47第四章PCV2与PPV混合感染对原代PAM的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯491材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．501．1病毒与细胞⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．501．2主要试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．501．3主要仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．501．4实验动物⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．502方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．502．1肺泡巨噬细胞(PAM)的分离⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．502．2PCV2和PPV混合感染肺泡巨噬细胞实验设计⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯512．3PCV2和PPV在肺泡巨噬细胞中病毒核酸拷贝数的检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5l2．4PCV2和PPV混合感染PAM后PCV2IFA检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．5l2．5细胞因子IFN吖，TNF—cL，IL一10和13-actinmRNA的real—timePCR检测⋯522．6数据分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．523结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯523．1病毒感染PAM后病毒核酸拷贝数的变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯523．2病毒感染PAM后PCV2IFA检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯533．3病毒感染PAM后细胞因子表达水平的变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯544讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．57参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．59第五章PCV2与PPV混合感染对3D4／21细胞的影晌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯631材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．641．1病毒与细胞⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．641．2主要试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．64 万方数据目录1．3主要仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．642方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．642．1PCV2和PPV混合感染3D4／21细胞实验设计⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．642．2PCV2和PPV在3D4／21细胞中病毒核酸拷贝数的检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．652．3PCV2和PPV混合感染PAM后PCV2IFA检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．652．4细胞因子TNF．a，IFN-),，IL．10和13-aetinmRNA的real-timePCR检测⋯652．5数据分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．653结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．653．1病毒感染3D4t21细胞后病毒核酸拷贝数的动态变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯653．2病毒感染3D4／21后PCV2IFA检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯663．3病毒感染3D4／21后细胞因子表达水平的变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯674讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．69参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．71全文总结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯75致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．77 万方数据中文摘要猪圆环病毒2型和猪细小病毒体外混合感染致病机制的研究摘要猪圆环病毒2_型(porcinecircovirustype2，PcV2)是引起猪圆环病毒相关疾病(porcinecircovirusassociateddisease，PCVAD)的主要病原，是重要的免疫抑制性疾病，给世界养猪业带来了严重的经济损失。猪圆环病毒2型单独感染并不能引起典型的临床症状，当与其它病原体混合感染时能促进疾病的发生。猪圆环病毒2型与猪细小病毒有共同的靶细胞，其混合感染的发病机制仍不清楚，鉴于猪圆环病毒2型与猪细小病毒混合感染是模拟断奶仔猪多系统衰竭综合症(PostweaningMultisystemicWastingSyndrome，PMWS)的典型发病模型。本研究拟通过检测猪圆环病毒2型与猪细小病毒钵外混合感染不同细胞细胞因子水平变化，对其混合感染的机制进行初步探讨。1．PCV2，PPV,IFN-y，TNF一0【，IL一10，13-actinreal-timePCR检测方法的建立本研究根据GenBank中PCV2，PPV猪IFN．Y，猪TNF吨，猪IL一10，13-actin基因序列设计引物，用RT-PCR扩增猪肺泡巨噬细胞中相应的目的基因片段，连接到pMDl8．T载体中，经测序验证基因序列的正确性。再根据GenBank中相应序列设计PCV2，PP、‘猪IFN-Y，猪猪TNF一Ⅱ，猪lL．10，猪fi-actinreal—timePCR扩增引物，以上述构建的重组质粒为模板，优化real．timePCR反应体系及引物浓度，建立检测PCV2，PPV猪IFN．丫，猪TNF．0【，猪IL一10，猪13-actin基因的定量方法，并进行了方法学评价。结果显示，以优化条件后real—timePCR反应所建立的标准曲线各参数均符合要求，标准曲线的判定系数R2均大于O．98，模板浓度在103．108copies／肚L具有良好的扩增反应，重复性、稳定性和特异性良好。2．PCV2与PPV混合感染对原代PAM的影响本研究通过PCV2和PPV混合感染PAM后，检测感染后不同时间PCV2和PPV病毒核酸拷贝数及IFN吖，TNF一Ⅱ，IL-10mRNA表达的动态变化，分析PCV2和PPV混合感染对细胞免疫反应的影响。将PAM分为4组：PPV单独感染组、PCV2单独感染组、PCV2与PPV混合感染组、对照组。在接种病毒12h、24h、36h、48h、60h、72h各时间点提取病毒DNA及PAM细胞总RNA。用已经建立的real．timePCR法检测各组中病毒核酸拷贝数及IFN吖，TNF一口，IL一10mRNA表达的动态变化。结果显示，PCV2和PPV混合感染后，PCV2与PPV混合感染组PCV2病毒核酸拷贝数高于PCV2单独感染组，PCV2与PPV混合感染组PPV病毒核酸拷贝数在60hpi后显著高于PPV单独感染组；PCV2单独感染组和PPV单独感染组IFN-ymRNA表达水平上调，PCV2与PPV单独感染组IFN-TmRNA表达表达水平下调；病毒感染后都可引起TNF一仅mRNA表达水平的上调，36hpi前PCV2感染起主要作用，48hpi后PPV感染起主要作用，PCV2与PPV混合感染TNF．dmRNA明显高于单独感染姐；在24hpi、36hpi，PCV2和PPV单独感染可引起JL．10mRNA表达水平的上调，PCV2 万方数据猪圆环病毒2型和猪细小病毒体外混合感染致病机制的研究与PPV混合感染后在36hpi、48hpiIL一10mRNA表达水平显著上调，其它时间不显著。3．PCV2与PPV混合感染对3D4／21细胞的影响本研究通过PCV2和PPV混合感染3D4／21细胞后，检测感染后不同时间PCV2和PPV病毒核酸拷贝数及IFN-，／，TNF-Ⅱ，IL．10mRNA表达的动态变化，分析PCV2和PPV混合感染对细胞免疫反应的影响。将3D4／21细胞分为4组：PPV单独感染组、PCV2单独感染组、PCV2与PPV混合感染组、对照组。在接种病毒12h、24h、36h、48h、60h、72h各时间点提取病毒DNA及3D4／21细胞总RNA。用已经建立的real-timePCR法检测各组中病毒核酸拷贝数及IFN吖，nqF．Ⅱ，IL．10mRNA表达的动态变化。结果显示，PCV2和PPV混合感染后，PCV2与PPV单独感染组PCV2病毒核酸拷贝数和PPV病毒核酸拷贝数分别于36hpi和24hpi高于单独感染组；PPV单独感染组IFN-YmRNA表达水平高于PCV2单独感染组IFN-3,mRNA表达水平，PCV2与PPV单独感染组IFN-3,mRNA表达水平在12hpi时高于PCV2单独感染组，24hpi后低于对照组及单独感染组；PPV单独感染组TNF．0tmRNA表达水平在24hpi后上调，PCV2单独感染组TNF—umRNA表达水平在24hpi后上调，在48hpi后高于PPV单独感染组，Pcv2与PPV单独感染组，rNF-程mRNA表达水平在36hpi后上调，并明显高于单独感染组；PCV2单独感染组IL．10mRNA表达水平在24hpi及48hpi后轻微上调，PPV单独感染组对IL．10mRNA表达水平没有影响，PCV2与PPV单独感染组lL一10mRNA表达水平在24hpi后显著上调，48hpi达到高峰。综上所述，PCV2与PPV混合感染后促进了2种病毒的复制并抑制了IFN吖mRNA的表达，促进了TNF—Q和IL．10mRNA的表达，因此可能使细胞免疫功能紊乱，从而促进了疾病的发生。关键词：猪圆环病毒2型；猪细小病毒；混合感染；细胞因子 万方数据些兰!垦竺!一一PJATHOGENESIS0FPORCINECIRCoVIRUSTYPE2ANDPoRCINEPARVoVIRUSCoINFECTIONINVITRoABSTRACTPorcinecircovirustype2isthemajorcausativeagentofporcinecircovirusassociateddisease，whichisanimportantimmunosuppressivediseases，hasbeencausedseriouseconomiclossesofthepigindustryallovertheworld．Porcinecircovirustype2infectionalonedoesnotcausethetypicalclinicalsymptoms，whencoinfectwithotherpathogenscarlpromotediseases．Porcinecircovirustype2andporcineparvovirushavethesametargetcells，andthecoinfectionpathogenesisremainsunclear．Coinfectionoftheporcinecircovimstype2andporcineparvovirusisatypicalmodelforPostweaningMultisystemicWastingSyndrome．Thisstudybydetectingthecytokinelevelsofdifferentcellsinporcinecircovirustype2andporcineparvoviruscoinfectionmodels／nvitro，andprovideapreliminarystudyonitsmechanismofcoinfections．1．Theestablishmentofreal—timePCRdetectionmethodforPCV2，PPVTNF-旺，IFN-1，，IL一10and13-actinInthisstudy,theprimersofPCV2，PPv’porcineIFN—Y，TNF-Ⅱ，IL-10and13-actinweredesignedaccordingtothegenesequencespublishedinGenBank．ThecorrespondingtargetgenefragmentfromporcinealveolarmacrophageswasamplificatebyRT-PCR，andthenconnectedwiththepMDl8一Tvector,verifythecorrectnessofthegenesequencebysequencing．TheprimersofPCV2，PPVporcineIFN—y，1NF-Ⅱ，IL一10and13-actinweredesignedforreal—timePCR．Therecombinantplasmidwasusedasatemplateabove，Thereactionsystemandtheprimerconcentrationwasoptimizateofreal-timePCR，themethedtodetectPCV2，PPVporcineIFN一1，，TNF-0【，IL-10and13-actingenewasestablished，andthemethodologywasevaluated．Theresultshowthat，theparametersofthestandardcurveweremeettherequirementsbyoptimizereal—timePCRconditions．ThecoefficientofdeterminationR2ofthestandardcurveweregreaterthan0．98．Theamplificationreactionwereverygoodwhenthetemplateconcentrationbetween103eopies／I_tLand105copies／gL，andhavegoodrepeatability,stabilityandspecificity． 万方数据猪圆环病毒2型和猪细小病毒体外混合感染致病机制的研究2，TheimpactofPCV2andPPVcoinfectiononprimaryPAMInt“Sstudy，itwasdetecttheviralnucleicacidscopynumberofPCV2andPPV，themRNAexpressionofIFN．Y，TNF—aandIL．10atdifferenttimeafterPCV2andPPVcoinfection，andtheeffectsontheimmuneresponseofcellsbyPCV2andPPVcoinfectionWaSanalyzed．ThePAMisdividedintofourgroups：PPVinfectionalone，PCV2infectionalone，PCV2andPPVcoinfectionandcontr01．At12hpi，24hpi，36hpi，48hpi，60hpiand72hpitheviralDNAandtotalRNAofthePAMwasextracted．TheviralnucleicacidscopynumberandIFN吖，TNF—ccandIL一10mRNAexpressiondynamicchangesweredetectedbyreal—timePCR．Theresultsshowedthat，afterPCV2andPPVcoinfections，PCV2andPPVgroupPCV2viralnucleicacidcopynumberwerehigherthanPCV2group，andinPCV2andPPVgroup，thePPVvirusnucleicacidcopynumberwassignificantlyhigherthanPPVgroupafter60hpi；TheexpressionlevelsofIFN-7mRNAwereraisedinPCV2groupandPPVgroup，theexpressionlevelsofIFN吖mRNAweredownregulatedinPCV2andPPVgroup；TheviralinfectioncancausetheexpressionlevelsofTNF-ⅡmRNAraised，before36hpi，PCV2infectionplaysflmajorrole，andPPVinfectionplaysamajorroleafter48hpi，theexpressionlevelsofTNF-nmRNAinPCV2andPPVgroupweresignificantlyhigherthansingleinfectedgroup．At24hpiand36hpi，thePCV2andPPVinfectionalonecallcausetheexpressionlevelsofIL一10mRNAraised，PCV2andPPVcoinfectioncausetheexpressionlevelsofIL一10mRNAsignificantlyupregulated，theothertimeswerenotsignificant．3．TheimpactofPCV2andPPVcoinfectionon3D4／21Inthisstudy，itwasdetecttheviralnucleicacidscopynumberofPCV2andPPVthemRNAexpressionofIFN-7，TNF-旺andIL一10atdifferenttimeafterPCV2andPPVcoinfection，andtheeffectsontheimmuneresponseofcellsbyPCV2andPPVcoinfectionwasanalyzed．The3D4／21isdividedintofourgroups：PPVinfectionalone，PCV2infectionalone，PCV2andPPVcoinfectionandcontr01．At12hpi，24hpi，36hpi，48hpi，60hpiand72hpitheviralDNAandtotalRNAofthe3D4／21wasextracted．TheviralnucleicacidscopynumberandIFN—Y，TNF-ⅡandIL一10mRNAexpressiondynamicchangesweredetectedbyreal—timePCR．Theresultsshowedthat，thePCV2viralnucleicacidcopynumbersat36hpiandthePPVviralnucleicacidcopynumbersat24hpiinPCV2andPPVgroupwerehigherthansinglyinfectedgroup．TheexpressionlevelsofIFN吖mRNAinPPVgroupwerehigherthantheexpressionlevelsofIFN-7mRNAinPCV2group，theexpressionlevelsofIFN一^，IV 万方数据ABSTRACTmRNAinPCV2andPPVgroupwerehigherthanPCV2groupat12hpi，andthenafter24hpi，werelowerthancontrolgroupandsinglyinfectionedgroup．TheexpressionlevelsofTNF-ⅡmRNAinPPVgroupwereraised，theexpressionlevelsofTNF一0【mRNAinPCV2groupwereraised，andwerehigherthanPPVgroupafter48hpi，theexpressionlevelsofTNF-QmRNAinPCV2andPPVgroupwereraisedafter36hpi，andweresignificantlyhigherthansinglyinfectionedgroup．TheexpressionlevelsofIL-10mRNAwereslightraisedat24hpiandafter48hpiinPCV2group，PPVinfectionhasnoeffectontheexpressionlevelsofIL一10mRNA，theexpressionlevelsofIL一10mRNAinPCV2andPPVgroupweresignificantlyupregulatedafter24hpi．andpeakedat48hpi．Insummary,whenPCV2andPPVcoinfect，thereplicationoftwokindsviralwerepromoteandtheexpressionofIFN—YmRNAwereinhibit，theexpressionofTNF—aandIL-10mRNAwerepromote．andthusthecoinfctionmaycauseimmunedysfunction，promotethediseaseoccurrence．KEYWORDS：porcinecircovirustype2；porcineparvovirus；coinfection；cytokinesV 万方数据英文缩略词表英文缩写英文全称中文全称PCV2PCVlPC、，ADPPV0RFMLVVLPSISREPMWSporcinecircovirustype2porcinecircovirustype1porcinecircovirus-associateddiseaseporcineparvovirusOpenReadingFramemodifiedliveattenuatedvaccineviruslikeparticlesIFN—stimulatedresponseelementpostweaningmultisystemicwastingsyndrome猪圆环病毒2型猪圆环病毒1型猪圆环病毒相关疾病猪细小病毒开放阅读框修饰性弱毒活疫苗病毒样颗粒干扰素刺激应答元件断奶仔猪多系统衰竭综合症PRDCporcinerespiratorydiseasecomplex猪呼吸道疾病综合征PDNSporcinedermatitisandnephropathysyndrome皮炎与肾病综合征IHCimmunohistochemistry免疫组织化学ELISAEnzymelinkedImmunosorbentAssay酶联免疫吸附试验PBMCsperipheralbloodmononuclearcell外周血单核淋巴细胞DCdendriecell树突状细胞TLRsToll．1ikereceptorsToll样受体MCP一1monocytechemotacticproteinl单核细胞趋化蛋白．1MIP一1macrophageinflammatoryproteinl巨噬细胞促炎蛋白一1CpGcytidylylphosphateguanosine胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸基元ConAconcanavalinA刀豆球蛋白APBSphosphatebuffersaline磷酸盐缓冲液IFAindirectimmunofluorescenceassay间接免疫荧光试验kDaKiloDalton千道尔顿BLmicroliter微升mLmillitor毫升molmole摩尔mgmicrogramme毫克minminute分钟hhour小时mRNAmessagerribonucleicacid信使核糖核酸VIT 万方数据猪圆环病毒2型和猪细小病毒体外混合感染致病机制的研究(1NTPTCID50rpmPCRAmpLBX一(hldoxyribonucleosidetriphophatetissuecultureinfectionsdose50revolutionperminutepolymerasechainreactionampicillinluria-bertanimedium5-bromo·4一chloro一3一indolyl—B—D—galactosideIPTGIsopropyl3-D·-1·-Thiogalactopyranoside脱氧核糖核苷三磷酸组织培养半数感染量每分钟转速聚合酶链式反应氨苄青霉素LB培养基5一溴一4一氯．3．吲哚．B．D．半乳糖苷异丙基⋯13D硫代吡喃半乳糖苷hDihourspostinfection感染后小时数bpbasepair碱基对Cpcrossingpoint临界点循环数PAMpulmonaryalveolarmacrophage肺泡巨噬细胞STswinetestiscell猪睾丸细胞PK．15porcineKidney一15cell猪肾细胞VIII 万方数据第一章猪圆环病毒2型的国内外研究进展第一部分文献综述猪圆环病毒2型病毒(porcinecircovirustype2，PCV2)是猪圆环病毒相关疾病(porcinecircovirusassociateddisease，PCVAD)的主要病原‘11。病毒主要感染淋巴细胞，导致淋巴细胞缺失和免疫抑制，患病动物由于免疫刺激和其它病原体的感染导致疾病恶化，严重危害当今世界养猪产业的发展。1猪圆环病毒2型概述1．1病原学猪圆环病毒属于圆环病毒科(Circoviridae)，圆环病毒属(Circovirus)的成员川，病毒粒子大小为14～20nln，平均直径17am，呈对称二十面体，无囊膜，基因组为单股环状负链DNA，在CsCI中的浮密度为1．37g／mL，沉降系数为52S，相对分子质量为5．8×102，PCV不具有血凝活性，不能凝集牛、羊、猪、鸡等多种动物红细胞。PCV对外界的抵抗力极强，在pH低至3的酸性环境中很长时问不被灭活，该病毒在56℃或70℃处理一段时间不被灭活，对氯仿、酒精等有机溶剂不敏感。猪圆环病毒(PCV)最初于1974年由Tischer在污染的PK一15细胞中分离得到口J，病毒基因组随后被确定为单链环状DNA分子【3】，因而命名为圆环病毒。在PK-15细胞上繁殖的圆环病毒对猪不具有致病性【4J。在1998年，在患有消耗性疾病(PCVAD)的猪体内分离到PCV的一个变异毒株【51。随后，非致病性的PCV被命名为PCVl，而致病性的PCV被命名为PCV2[6，7】。在圆环病毒属家族中，至少存在11种病毒，包括其中的PCVl、PCV2和几种禽圆环病毒。PCV2的基因组大小已经降低到只执行病毒复制和病毒基因组包装两个基本功能川。1．2猪圆环病毒的基因结构及编码蛋白1．2．1病毒的基因组结构PCV基因组结构为单股负链环状DNA分子，PCVl基因组全长为1759bp， 万方数据猪圆环病毒2型和猪细小病毒体外混合感染致病机制的研究PCV2基因组全长为1768bp或1767bp，基因组都非常小，是目前发现的最小的动物病毒。对其序列分析表明，PCV2与PCVl的同源性为68％【8一l，但PCVl毒株间的核酸序列同源性大于99％，PCV2毒株间的核序列同源性大于96％。三二盈刚，[三盈刚：图1-1PCV基因组结构Fig．1-1GenomeorganizationofPCV分子生物学软件分子表明，2种PCV病毒基因组可能均含有11个开放阅读框(OpenReadingFrame。ORF)tlo】，即ORF1-ORF11。ORF1、ORF2为病毒2个主要的开放阅读框，ORF1位于病毒基因组链上，以顺时针方向排列，编码Rep蛋白；ORF2位于病毒基因组互补链上，以逆时针方向排列，编码Cap蛋白0qoRep基因和Cap基因方向相反，构成一个双义基因组结构。Rep和Rep’由选择性剪接的RNA转录子产生。Rep和Cap的5’末端之间的间断区域包含病毒复制的起点(Orb，由一个stem—loop环相连(图1．1)川。现已证明，PCVl和PCV2之间的Rep并11Ori是可以互换的【12_14】，这表明两种病毒该区域的保守性。PCVl和PCV2的基因组的可交换性提供了一个功能强大的工具，该工具促进修饰性弱毒活疫苗(MLv)的发展，并有助于了解PCV2基因结构和功能的关系。ORF3全长315bp，编码104个氨基酸，对于病毒的复制不是必须的，但在PCV2的致病机制中发挥重要的作用【”】。目前，其它开放阅读框所编码产物的功能和性质尚不清楚。 万方数据第一章猪圆环病毒2型的国内外研究进展1．3病毒编码的蛋白1．3．1Cap蛋白Cap蛋白为PCV2病毒唯一的结构蛋白，Cap蛋白又称衣壳蛋白，由病毒基因组ORF2编码的233或234个氨基酸组成，分子量约为28KDa，具有免疫原性[16】。在疫苗学及流行病学诊断的研究中具有重要的地位，因此该蛋白是研究PCV2的热点。Nawagitgul等【171将ORF2基因克隆到杆状病毒上并让其在昆虫细胞中表达，发现表达产物能自动组装成病毒样颗粒(ViruslikeParticles，VLPs)，WestenBlot鉴定该蛋白大小为30KDa，从而进步证实ORF2基因编码病毒的Cap蛋白。1．3．2Rep蛋白Rep蛋白由PCV2最大的阅读框ORF1编码，研究表明ORF1基因转录产生2个大小不同的转录产物：Rep蛋8(312aa，35KDa)和Rep。蛋8(168aa，19KDa)t18】。这两种蛋白都与病毒基因组的滚环复制相关。Rep蛋白氨基酸序列中具有与病毒基因组典型滚环复制相关的三个保守基序(FTLNN、HLQG和YCSK)以及结合dNTPs的P环结构(GKS)，这三个保守基序及P环结构对于Rep蛋白维持正常功能至关重要，突变或着缺失均会影响病毒复制【19，201。Mankertz等㈣研究报道Rep基因包含干扰素刺激应答元件(IFN．stimulatedresponseelement，ISRE)，说明细胞因子可对ORF1基因的表达进行调控。1．4流行病学猪是PCV2的主要宿主，猪对PCV2有较强的易感性，各种年龄的猪都可感染，但仔猪感染后比较严重，感染猪一般集中在5一18周，尤其是5—12周龄的仔猪。胚胎期或生后早期感染的仔猪，往往在断奶后2—3天或1周才发病。感染猪可通过鼻液、尿液、粪便等排出病毒，经呼吸道、消化道引起感染。怀孕母猪感染PCV2后可经过胎盘垂直传播给仔猪，并引起繁殖障碍。感染的公猪精液中也含有PCV2，说明PCV2也可通过精液传播。PMWS是最早被认识和确认的由PCV2感染所致的疾病，并且和其它PCV2相关疾病流行于世界各地猪场[21]o但在各个国家和地区的流行状况存在较大的差异。最早在1973年，在北爱尔兰就有PCV2感染的证据【刀。自1988年加拿大首 万方数据猜圆环病毒2型和猪细小病毒体外混合感染致病机制的研究次分离到PCV2以来，在多数农场猪群中只是散发，很少呈流行性发生。1991年加拿大萨斯喀彻温省首次发生PMWS后，在世界范围内先后有三十多个国家和地区相继报道了PCVADl221。英国自1993年爆发由PCV2引起的PNDS以来，PCV2流行相当严重，PCV2感染引起的PMWS曾一度对其养猪业造成了巨大的经济损失【23】。Finlaison等【241对加拿大发病猪场猪群进行血清抗体检测，PCV2抗体阳性率为40％一80％。EJ。Pallares等用IHC法对美国猪场中PCV2抗原进行检测发现抗原阳性率为37．3％∞J。目前，世界范围内流行的PCV2基因型主要有PCV2a、PCV2b和PCV2c3个基因型，PCV2a和PCV2b与PCVAD有不同程度的关联【26'271。而PCV2c被认定只能从丹麦的健康猪群中偶尔发现【281。2003年之前，PCV2a和PCV2b在中国和欧洲等国家比较盛行，而PCV2a是在美国和加拿大唯一认可的基因型删J。在我国，郎洪武等于2000年应用酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)方法对我国7个省市22个不同猪群559份血清样品进行检测，发现PCV2总阳性率高达42．9％【301。吴瑗等对2007-2012年间浙江省及周边地区疑似PCV2感染的180份病例进行PCV2检测，研究结果发现总阳性率为41．4％13i】。曹正等对江苏省9个市15个规模化猪场疑似PCV2感染的186份病料的检测结果显示，PCV2阳性率为63．44％，猪场阳性率为100％【l¨。郭站军等对福州地区12个规模化养猪场发病猪64份病料进行检测，发现PCV2阳性率为46．9％，猪场阳性率为58．3％【32】。卢寄军等[33】对湖南省8个地区526份血清进行PCV2抗体检测，结果抗体阳性率为57．41％。李玲等p4J于2008～2011期问对福建省、江西省、广东省、安徽省、浙江省、河南省、河北省、广西壮族自治区、内蒙古自治区、上海市、江苏省和山西省共12个省(市、区)的健康猪群和发病猪群共452份样品进行病原学检测，结果发现PCV2抗原阳性率高达78．3％。可见PCV2在国内猪群中以非常普遍，应引起注意。2病毒与宿主免疫系统的相互作用2．1免疫细胞的感染虽然PCV2病毒不能在单核细胞中有效的复制，但体外培养的单核细胞、肺泡巨噬细胞和单核巨噬细胞系能吞噬PCV2病毒，并能在这些细胞的细胞质中检测到PCV2的特异性抗体【35-3”。这表明这些免疫细胞可能不是PCV2复制的主要部位。YuS等∞391的研究证明在T淋巴细胞、B淋巴细胞、PBMCs和支气管淋巴结中能检测到PCV2复制，并且在来源于支气管淋巴结B细胞中复制能力比来4 万方数据第一章猪圆环病毒2型的国内外研究进展源于PBMCs中B细胞复制能力强，由此说明B细胞可能是PCV2的靶细胞。PCV2可感染DC细胞已经得到国际上广大学者的认可【4们，但PCV2持续感染没有造成DC细胞死亡或改变DC细胞的免疫功能【411。PCV2进入细胞可能只是被DC细胞通过吞噬作用吞噬而不是通过吸附感染【41431。因此，PCV2感染DC细胞可能帮助PCV2逃避宿主的免疫系统并通过DC细胞的迁移促进病毒的传播【41]。GriersonSS等删研究发现PMWS患病猪T细胞和B细胞早期表达和活化MHC．II水平和IL一2受体CD25表达水平较高。此外，PCV2感染巨噬细胞似乎与这些细胞吞噬和杀微生物能力降低有关，从而有利于PCV2的生存与传播135’361。有报道指出，为清楚PCV2病毒感染，肺泡巨噬细胞产生更高水平的细胞因子，包括TNF．Ct、粒细胞集落刺激因子，单核细胞趋化蛋白一1(MCP一1)和lL一8t35，36】。巨噬细胞、DC细胞等免疫细胞功能的改变可能会损害肺部局部防御系统，从而导致肺部组织损伤【”，36】。PCV2通过TLR7、TLR9激动剂和其他猪病毒性病原体诱导介导的干扰素表达细胞的抑制作用似乎比较广谱并能影响免疫反应，这表明PCV2调节先天免疫反应可能导致猪更易发生继发或并发病毒和细菌感染[451。PCV2与免疫细胞和淋巴系统的相互作用似乎在PCV2的致病过程中发挥着重要的作用。因此，深入了解PCV2病毒和免疫细胞相互作用的机制，将在制定有效的畜群管理和疾病控制策略中具有重要的意义。2．2IL一10等细胞因子在PCV2发病机制中的作用PCV2作为一种靶向淋巴组织和免疫细胞的病毒，它的感染能显著改变感染猪的细胞因子表达水平。在PCV2感染猪中，IL一10和TNF一0【、IL一1等促炎细胞因子上调，IL一2和IL一4表达下调[46,47]。同时，在PCV2感染猪中，胸腺中IL—10表达的上调与胸腺缺失和萎缩有关‘481。DarwichL等【491的研究中患有PCVAD的猪胸腺中IL—lo表达上调，扁桃体中IFN吖上调，同样，脾脏中IL一2，IL—12p40表达下调，腹股沟淋巴结中IFN．7，IL一10，IL一12p40和IL．4表达下调。之后DarwichL的研究中又指出PCV2亚临床感染的猪在PCV2病毒血症高峰期有短暂的IL．10表达上调【50I。PCV2亚临床感染能使CD8+和CD4+CD8+细胞亚群明显减少，进一步说明PCV2感染能损伤宿主的免疫应答。KimJ等f5lJ研究证明PCV2感染能诱导MCP一1和巨噬细胞炎性蛋白MIP—l表达，这表明MCP一1和MIP．1在淋巴结肉芽肿炎症中有潜在的作用。另外，在患有严重的PCVAD后，检测到IL一10水平升高。进一步暗示促炎细胞因子在PCV2发病机制中的作用。在PCV2感染猪肺泡巨噬细胞，7INF一Ⅱ和IL一8表达明显上 万方数据猪圆环病毒2型和猪细小病毒体外混合感染致病机制的研究升【35】。PCVAD发病猪PBMCs通过释放IL．10和IFN吖能较好的应对PCV2抗原。此外，PCV2感染已经表明下调或抑制PBMCs释放IL．2和IL4，刺激其产生促炎细胞因子【4引，这表明PCVAD患病猪对病毒的免疫功能降低。总的来说，IL．10和其他促炎细胞因子在PCVAD的发病机制中发挥重要的作用，免疫细胞的损伤和细胞因子表达失衡可能是其他病原体与PCV2混合感染的原因。对此XiangjinMengtl】推测PCV2感染的致病机理可能是(图1-2)：在健康状态下，PCV2可能被DC细胞、单核细胞等免疫细胞吞噬，并通过在细胞内不复制或少量复制与有有限的但平衡的Thl／Th2反应的宿主共存。随着宿主遗传特性的潜在影响，细胞因子平衡的失衡，而引起PCVAD。PCV2对淋巴结和其他淋巴器官的致病。炎症反应的蔓延及淋巴细胞的缺失导致组织损伤而表现出PCⅥkD症状。菇一1孓警Lb，mb。h。。。。啦ge，CLympholdhyperplasiatViralproliferationinlymphocytes}MHC-ilandIL一2receptordLymphoiddepletionUncontrolledinflammation—'．Tissuedamage图1-2猪圆环病毒2型(PCV2)感染和猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)的免疫病理机制Fig．1．2Mechanismsofimmunopathogenesisofporcinecircovirustype2(PCV2)infectionandporcinecircovirusassociateddisease(PCVAD)．因此，了解细胞因子失衡的根本机制可能有助于制定更好的防治措施，以加强对PCV2的免疫和减少PCVAD的发生。⑨l—L 万方数据第一章猪圆环病毒2型的国内外研究进展2．3病毒和宿主蛋白之间的作用通过对PCV2衣壳蛋白的研究推测，不同细胞通过不同的受体与病毒相互作用，因而使病毒在器官和组织中有很广阔的趋向性【43J。PCV2衣壳蛋白吸附在猪单核细胞3D4／31并通过网格蛋白介导的内吞作用进入细胞【521，病毒的进入似乎与动力素和胆固醇依赖通路无关，但与肌动蛋白和小GTP酶依赖通路有关岭引。在PCV2感染的猪肾细胞或PCV2感染猪组织中，与RNA剪接因子SPF30和透明质酸介导的运动性受体基因序列同源的细胞基因上调【541。在PCV2感染猪的淋巴结组织中，参与先天免疫防御(TLRl，CDl4，CDl80)，免疫抑制剂(FGL2，GPNMB)，促炎信号(半乳凝素．3)和禁食过程(ANGPTL一4)的细胞基因表达水平改变，这表明PCV2的免疫抑制，炎性细胞浸润和减肥的作用【55|。尽管这些病毒和细胞蛋白相互作用的生物学意义仍未知，但已知的许多细胞蛋白，包括补体因子ClqB，E3泛素连接酶家族成员MKRNl和促凋亡基因产物Par-4都能与PCV2Cap蛋白和Rep蛋白相互作用【56，卯J。PCV2的OIU3与PCVl的ORF3相比，PCV2的ORF3被截断。在体外条件下，当在哺乳动物细胞中过度表达PCV2的ORF3蛋白，ORF3蛋白会与pPirh2相互作用，与p53竞争结合Pirh2并介导p53平衡的失调，从而导致感染细胞的p53水平的上调和细胞的凋亡【58'59J。虽然PCV2是否能导致细胞凋亡仍存在争议16J，据报道PCV2ORF3蛋白诱导细胞凋亡是通过半胱氨酸蛋白酶一8和半胱氨酸蛋白酶一3的活化来完成的[60】。PCV2复制过程中，NF．1(B能被激活，用NF．r．B抑制剂处理后，PCV2复制量降低16¨，这表明活化的NF．r．B在协调各种细胞基因的表达中发挥重要作用，能控制免疫应答以促进病毒复制。病毒和细胞蛋白之间的相互作用的细节都非常粗略，这方面仍有许多未知数。ORF3蛋白在病毒复制和致病机制中的多种功能仍需进一步确认。毕竟目前我们不知道ORF3蛋白是否在PCV2感染过程中产生的。显然，需要更多的研究来探索病毒与宿主蛋白之间的相互作用。2．4病毒DNA和宿主蛋白之间的相互作用PCV2的基因组DNA中含有免疫调节序列，现已经确定在PCV2DNA中至少含有5个寡脱氧核苷酸(ODNs)含有CpG基序：4个ODNs刺激产生IFN．cc，另一个具有IFN．C【抑制活性1621。在PCV2DNA免疫序列中已经显示通过TLR9信号传导作用激活宿主的先天性免疫，从而使机体产生干扰素和其他抗炎细胞因子扣川。因此，PCV2DNA免疫调节序列与宿主蛋白之间的相互作用可表示PCV2发病的相关机制。PCV2感染干扰素产生细胞，并能抑制它们应对ODNs、TLR9 万方数据猪圆环病毒2型和猪细小病毒体外混合感染致病机制的研究和TLR7激动剂的能力㈣。提前用IFN．(It和IFN吖处理或同时与PCV2感染PK．15和3D4／31细胞能促进PCV2的复制‘641。ISRE序列已被确定为PCV2基因组的一段序列【191。当ISRE序列在完整的PCV2病毒中，ISRE影响干扰素介导增强PCV2的复制并在PCV2致病中发挥着潜在的作Nt651。因此，了解病毒序列和宿主细胞之问的相互作用与可以有利于基因修饰弱毒疫苗的发展。3猪圆环病毒2型的致病机制目前，对于PCV2的致病机制还不是很明确。在实验状态下可通过肌肉注射、口鼻途径、子宫途径等感染实验动物[5,66,67l，但经口鼻途径很可能是PCV2传播的自然途径。PCV2优先感染猪淋巴组织【261，并通过感染猪的呼吸道、IZl腔分泌物、尿和粪便排出病毒。PCV2的致病机制主要集中在以下几个方面。3．1淋巴细胞缺失和免疫抑制淋巴细胞缺失和淋巴组织中组织细胞替换是PCV2感染和PCVAD的标志性病变。PCV2在淋巴组织中感染和复制能破坏淋巴滤泡的结构，导致淋巴组织缺失，随后由组织细胞替换[5,26】。因此淋巴滤泡的破坏和PCV2感染相关的白细胞减少导致仔猪的免疫抑制。据报道，感染猪的淋巴细胞缺失与树突状细胞(DC)、B细胞、NK细胞、Y6T细胞、CD4+禾IJCD8+T淋巴细胞的减少和单核细胞、粒细胞的增加有关【“，46，47,681。淋巴组织缺失程度与感染组织PCV2抗原量呈正相关，现已证明，PCV2可在支气管和腹股沟淋巴结、扁桃体、肺、肝、肾、脾、胸腺组织中复锘1J[46,47】。除了直接的病毒复制和淋巴组织中感染细胞的裂解，其他间接的未知机制可能对感染猪淋巴组织缺失很重要，了解淋巴耗竭的确切机制将有助于对PCV2病毒的控制。3．2PCV2感染和细胞凋亡PCV2感染能否诱导细胞凋亡仍然存在争议。在感染PCV2的PK一15细胞上由ORF3在ORF1反义方向一I-_编码的蛋白已被证明能通过caspase一3和caspase一8诱导细胞凋亡【60l。另外有报道证明ORF3缺失的PCV2对小鼠的致病性低于PCV2野毒[581，在猪的感染试验中ORF3缺失能降低PCV2感染。但是，在一个使用大量猪的独立试验中野生型PCV2和ORF3缺失的PCV2感染引起的组织病理学损伤、肉眼可见的损伤和组织中PCV2抗原量没有明显的差异1691。如此看来，ORF3不影响PCV2的复制，不参与细胞凋亡与致病。有报道称可以检测促凋亡基因和凋亡标志物。ShibaharaT等17oj研究证明 万方数据第一章猪圆环病毒2型的国内外研究进展PCV2通过细胞凋亡诱导B淋巴细胞缺失。然而，许多研究与PCV2能引起细胞凋亡相矛盾，如MandrioliL等【711研究证明PCV2感染组淋巴细胞缺失是由于细胞增殖的减少而不是细胞凋亡。同样有报道指出，在PMWS患病猪中细胞凋亡不是淋巴细胞缺失和肝细胞缺失的主要原因。ResendesAR等【72J研究结果说明在PMWS患病猪与在健康猪中，PCV2病毒载量较高的和病理损伤的严重程度，组织中凋亡率越低，这进一步违背PCV2感染中细胞凋亡的作用。因此，在PCVAD患病猪中PCV2引起淋巴细胞缺失和淋巴结肿大的机制还有待进一步阐明。3．3PCV2病毒毒力目前，猪感染PCV2主要是PCV2a和PCV2b两种基因型混合感染的结果。LagerKM等‘731用PCV2a和PCV2b分别感染SPF猪，发现2种基因型病毒在组织中的抗原量和导致的病理损伤相似。OpriessnigT等‘74】的实验发现，PCV2a和PCV2b两种基因型毒力无显著差异。因此，当前的数据不支持PCV2两个主要的基因型之间存在毒力差异。因此，自2003年以来，PCV2b基因型与PCVAD日益严重的全球变化可能仅仅反应了PCV2a和PCV2b混合感染【75】。LarochelleR等【76】试图通过基因分析患有PCVAD和未患有PCVAD猪分离的PCV2相关的遗传因素，但未能确定病毒毒力的决定因素。然而，Cap蛋白的免疫原性表位的氨基酸的变化被认为是能更频繁的从患病动物PCV2中分离c玎l。事实上，Fenaux等[781证明了在PCV2a的Cap蛋白中2个氨基酸的变化足以减弱病毒。最近，通过分析1970年到1971年问保存的冷冻猪组织，将保存的PCV2分离株与当代PCV2分离株进行比较，发现在Cap基因一段线性九个碱基序列存在差异【_79】。在随后的致病性研究中表明，Cap基因中这9个碱基序列区域内发生突变可以改变PCV2病毒的毒力，这有可能使无毒的PCV2分离株转化为当代致病性PCV2毒株【79】。还需要进一步的研究来确定这9个碱基序列与PCV2毒力之间的关系。因为PCV2很少单独引起临床疾病，确定PCV2毒力的遗传因素可能难以精确定位。因此，在混合感染中进一步研究PCV2毒力与PCV2基因遗传因素的相关性仍很重要。3．4遗传易感性猪的遗传可以影响宿主对病毒的易感性。有记录显示，不同品种的猪对PCV2的易感性存在差异，长白猪比杜洛克和大白猪对PCV2更易感【80】。并且不同品种 万方数据猪圆环病毒2型和猪细小病毒体外混合感染致病机制的研究的猪感染PCV2引起的病理损伤程度也存在差异，如感染PCV2的长白猪比皮特兰猪有显著的更为严重的淋巴病变【8l】。在自然条件下，PCVAD的临床症状的表现受猪场遗传背景的影响。遗传在PCV2的发病中起到一定的作用。因此，对PCV2遗传抗性或易感性机制的阐明将有助于控制PCV2的感染和PCVAD的发生。3．5PCⅥkD相关的免疫增强作用众所周知，PCV2感染能够引起免疫抑制，但是有趣的是，外来的免疫刺激能够促进PCVAD的发生【461。弗氏佐剂、血蓝蛋白、免疫注射等免疫刺激或混合感染(PPV、PRRSV)都能够促进PCVAD的发生[82。841。此外，体外ConA刺激外周血单核细胞(PBMCs)能够促进PCV2的复制，并且活化的T淋巴细胞能支持PCV2的复制138‘。在经过ConA刺激的活跃的细胞或是静止的细胞中PCV2Cap基因mRNA表达水平都很高，说明PCV2的复制不依赖于细胞有丝分裂期删J。由于PCVAD常在高度健康的猪群中发现，而对其他病原体的免疫形成的免疫保护可能对PCV2是一个安全隐患。4保护性免疫4．1疫苗与免疫目前，至少有4家商品疫苗可用于免疫预防PCV2和PCVAD。包括辉瑞动物保健公司的FosteraTMrPCV疫苗、梅里亚公司的CircovaCvaccine、勃林格公司殷格翰IngelvacCircoFlEX2vaccine、英特威／默克的Circumvent2vaccine。这些商业化的PCV2疫苗的疗效已经在猪的攻毒实验中得到深入研究。因为单独感染PCV2的猪通常不会有典型PCVAD的临床症状，PCV2混合感染模型已被用于大多数的疫苗效力研究，以更真实的模仿现场条件。这些疫苗试验的研究已经清楚地表明了针对PCV2感染和PCVAD卓越的疗效(85。87}。自使用疫苗能显著降低PCVAD死亡率的报道以来，在欧洲、加拿大和美国，疫苗已经成功地减少PCV2感染造成的死亡率【2¨。虽然目前基于PCV2a的商业疫苗是有效的，但对于目前流行的PCV2b基因型，开发基于PCV2b基因型疫苗是很有必要的。此外，修饰性弱毒活疫苗(MLV)可能会提供更好的保护，因为MLV不仅能诱发体液免疫反应，也能诱导细胞介导的免疫反应对抗PCV2感染[271。在PCV2感染很普遍的情况下，使用标记疫苗能很好的区分自然感染的动态发展。PCV2基因组已被证明在Cap蛋白的C末端10 万方数据第一章猪圆环病毒2型的国内外研究进展可插入至少27个氨基酸，能在c末端表达短的免疫原性表位标签的嵌合PCVl—2a弱病毒能引起感染猪PCV2特异性中和抗体以及抗标签抗体的产生【l3114J。虽然使用可靠的疫苗失败的案例在目前的PCV2疫苗接种计划中是极为罕见的，在PCV2不断演化和可能出现潜在疫苗逃避突变体的情况下，还需要进一步研究来评估目前的疫苗对群体免疫的效果。4．2中和抗体和细胞免疫在保护中的作用中和抗体和细胞介导的免疫应答都对保护机体对抗PCV2感染具有重要的免疫学相关性【471。PCV2感染猪后约21天能引起病毒特异性的中和抗体的产生【13，HJ。在实验猪感染PCV2后，PBMCs细胞中能检测到PCV2的特异性中和抗体和IFN一1，基因的表达。因此缺乏中和抗体似乎是增加PCV2复制的一个重要因素1881。有研究报道，PCV2中和抗体的存在和保护机体对抗PCV2感染之间存在相关性【89l。在PCV2病毒Cap蛋白的免疫原性表位图谱中[901，氨基酸残基47—57和165—200含有中和表位，但是两个中和表位刺激产生的抗体能否起到对PCV2产生足够的保护作用仍需进一步研究。FortM掣91J研究指出不是所有的猪接种嵌合PCVI一2a弱毒疫苗都能产生高水平的体液抗体，即使是只有低水平抗体的猪对PCV2野毒也有保护性免疫。这进一步表明，体液和细胞介导的免疫在机体保护中起重要的作用。IFN—Y分泌细胞对PCV2感染的特异性反应可能有助于猪体内病毒的清除[92I，同时，CD4+CD8+T细胞的缺失能减弱病毒特异性IFN—v反应ⅢJ，因此，IFN吖似乎是一种重要的免疫相关产物。5PCVAD的防治随着养猪场越来越规模化、集约化，由PCV2及其混合感染引起的疫病感染范围及造成的损失越来越大。由于本病主要由PCV2与其他刺激或病原体混合感染而造成严重影响，因此对于PCV2的感染做好以下工作对防治该病具有极其重要的意义。良好的饲养管理。保证猪舍合理布局，降低饲养密度，保持猪舍内良好通风及相对适宜的温度、湿度。坚持全进全出的模式，认真做好清洗消毒工作。饲料营养要全面，并根据不同年龄阶段的猪合理控制营养结构。免疫预防。合理制定免疫计划，做好PRV、PRRSV、PPV等其它疫病的总会让房子综合防治，尽量减少免疫使用刺激较强的佐剂疫苗，必要时可用自家组织苗进行免疫。防止继发感染。定期在饲料中添加抗生素类药物如阿莫西林、支原净等，能 万方数据猪圆环病毒2型和猪细小病毒体外混合感染致病机制的研究抑制猪群中一些常见的细菌性病原体。转群或运输时，在饮水中加入芪黄素、维生素等保健药物，增强猪群抵抗力。6总结和未来展望综上所述，PCV2病毒是一种重要的经济相关猪病原体。病毒优先针对猪的免疫系统，使淋巴耗竭，导致免疫抑制和在受感染的猪多系统疾病。并发感染其他病原体或使用猪的免疫刺激佐剂或疫苗可加重PCVAD的发生。免疫细胞对PCV2的内吞作用有利于病毒在猪体内传播并可能调节重要免疫细胞的功能。IL一10和促炎细胞因子的上调似乎在PCV2的发病机制中发挥着重要作用。病毒DNA分子和蛋白质与各种细胞基因的相互作用限制免疫反应以促进病毒的复制。中和抗体和细胞介导的免疫应答对保护机体感染PCV2具有重要的免疫相关性。尽管对PCV2感染几种有效的商业疫苗的面世，PCV2病毒的变异株仍然继续在世界各地的猪群中出现。自1998年发现PCV2病毒以来尽管人们对PCV2的研究有了很大的进步，但仍存在很多问题。PCV2特异性受体尚未确定，PCV2的生命周期中的许多步骤，包括脱壳、复制、组装和释放，我们仍然知之甚少。作为最小的感染哺乳类动物的DNA病毒，PCV2的复制在很大程度上依赖于宿主细胞。因此，了解病毒与宿主相互作用，特别是与宿主的免疫系统在分子水平上的相互作用将是极为重要的。病毒与宿主相互作用时其他重要病毒和宿主因子的识别以及圈定他们在病毒复制和致病机制中的潜在作用也是十分重要的。尽管混合感染其他猪病原体和免疫刺激已被确定能促进PCVAD的发生，但是其他宿主病毒因素能促进PCVAD的发展仍难以捉摸。ORF3在诱导细胞凋亡和发病机制中的作用仍然饱受争议，需要进一步深入调查。PCV2能够逃避宿主的免疫反应而引起细胞因子和其他免疫系统失衡，导致PCVAD的发展。因此，探讨PCV2和免疫细胞之问相互作用的机制仍需进一步研究。 万方数据第一章猪圆环病毒2型的国内外研究进展参考文献【1】MengX—J．PorcineCircovirusType2(PCV2)：PathogenesisandInteractionwiththeImmuneSystem叨．AnnuRevAnimBinsci2013；1(1)：43—64【2】TischerI，RaschRTochtermannGCharacterizationofpapovavirus—andpicomavirus-likeparticlesinpermanentpigkidneycelllines[J]．ZentralblBakteriolOrigA1974Feb；226(2)：153—67[3]TischerI，GelderblomH，VettermannWeta1．Averysmallporcineviruswithcircularsingle-strandedDNA[J]．1982【4】AllanGMcNeillyF，CassidyJ，eta1．Pathogenesisofporcineckcovirus；experimentalinfectionsofcolostrumdeprivedpigletsandexaminationofpigfoetalmaterial[J]．Veterinarymicrobiology1995；44(1)：49—64【5】SegatdsJ．Porcinecircovirustype2(PCV2)infections：clinicalsigns，pathologyandlaboratorydiagnosis[J]．Virusresearch2012；164(1)：10—9【6】MengX-J．Spreadlikeawildfire--Theonmipresenceofporcinecircovirustype2(PCV2)anditsever．expandingassociationwithdiseasesinpigs[J]，Virusresearch2012；164(1)：1—3【7】AllanGKrakowkaS，EllisJ，etal，Discoveryandevolvinghistoryoftwogeneticallyrelatedbutphenotypicallydifferentviruses，porcinecircovirusesland2【J】．Virusresearch2012；164(1)：4-9[81HamelAL，LiIlLL，NayarGP．Nucleotidesequenceofporcinecircovirusassociatedwithpostweaningmultisystemicwastingsyndromeinpigs[J]．JournalofVirology1998；72(6)：5262-7[9】MeehanBM，McNeillyF，1’oddD，eta1．CharacterizationofnovelcircovirusDNAsassociatedwithwastingsyndromesinpigs[J]．JournalofGeneralVirology1998；79(9)：2171-9【10】HamelAL，LillLL，NayarGP．Nucleotidesequenceofporcinecircovimsassociatedwithpostweaningmultisystemicwastingsyndromeinpigs[J]．JVirol1998Jun；72(6)：5262—7[11】曹正．江苏省规模化猪场PCV-2流行病学调查与断奶仔猪多系统衰竭综合症的防制【D]．南京农业大学：2009【12】BeachN，JuhanN，CordobaL，eta1．Replacementofthereplicationfactorsofporcinecircovirus(PCV)type2withthoseofPCVtype1greatlyenhancesviralreplicationinvitro[J]．Journalofvirology2010；84(17)：8986—9[131BeachNM，RamamoorthyS，OpriessnigT，eta1．Novelchimericporcinecircovirus(PCV)withthecapsidgeneoftheemergingPCV2bsubtypeclonedinthegenomicbackboneofthenon—pathogenicPCV1isattenuatedinvivoandinducesprotectiveandcross··protectiveimmunityagainstPCV2bandPCV2asubtypesinpigs[J]．Vaccine2010；29(21：22l-32[14]BeachNM，SmithSM，RamamoorthyS，eta1．Chimericporcinecircoviruses(PCV)containingaminoacidepitopetagsintheCterminusofthecapsidgcneareinfectiousandelicitbothanti—epitopetagantibodiesandanti—PCVtype2neutralizingantibodiesinpigs[J]．Journalof13 万方数据猪圆环病毒2型和猪细小病毒体外混合感染致病机制的研究virology201l；85(9)：4591-5【15】冉旭华，李树东，闻晓波，等．猪圆环病毒2型ORF3基因的原核表达[J]．中国畜牧兽医2010(6)-：171-4[161LiuQ，TikooSK，BabiukLA．NuclearlocalizationoftheORF2proteinencodedbyporcinecircovirustype2【J】．Virology2001；285(1)：91·9[17】NawagitgnlP’MorozovI，BolinSR，eta1．Openreadingframe2ofporcinecircovirustype2encodesamajorcapsidprotein[J]．JournalofGeneralVirology2000；81(9)：2281—7【18】MankertzA，HillenbrandB．ReplicationofPorcineCircovirusTypelRequiresTwoProteinsEncodedbytheViralrepGene[J]．Virology2001；279(2)：429-38【19】MankertzA，HillenbrandB．AnalysisoftranscriptionofPorcinecircovirustype1【J】．JournalofGeneralVirology2002；83(11)：2743·51【20】MankertzJ，BuhkH-J，BlaessGeta1．Transcriptionanalysisofporcinecircovirus(PCV)[J1．Virusgenes1998；16(3)：267—76【21】Grau·RomaL，FraiteL，Segal&J．Recentadvancesintheepidemiology,diagnosisandcontrolofdiseasescausedbyporcinecircovirustype2[J】TheVeterinaryJournal2011；187(1)：23—32【22】Segal6sJ，KekaraihenT，CorteyM．Thenaturalhistoryofporcinecircovirustype2：Fromallinoffensivevirustoadevastatingswinedisease[J]?Veterinarymicrobiology2013；165(1)：13—20【23】GreshamA，GilesN，WeaverJ．PMWSandporcinedermatitisnephropathysyndromeinGreatBritain[J]．VeterinaryRecord2000；147(4)[24】FinlaisonD，KirklandP，LuongR，eta1．Surveyofporcinecircovirus2andpostweaningmultisystemicwastingsyndromeinNewSouthWalespiggeries[J]．Australianveterinaryjournal2007；85(8)：304一10[25】PallaresF’HalburP'OpriessnigT，eta1．Porcinecircovirustype2(PCV-2)coinfectionsinUSfieldcasesofpostweaningmultisystemicwastingsyndrome(PMWS)[J】．JournalofVeterinaryDiagnosticInvestigation2002；14(6)：515—9【26】OpriessnigT，MengX-J，HalburPG．Porcinecircovirustype2-associateddisease：updateoncurrentterminology,clinicalmanifestations，pathogenesis，diagnosis，andinterventionstrategies[J]．JournalofVeterinaryDiagnosticInvestigation2007；19(6)：591-615【27]BeachNM，MengX·J．Efficacyandfutureprospectsofcommerciallyavailableandexperimentalvaccinesagainstporcinecircovirustype2(PCV2)【J]．Virusresearch2012；164(1)：33—42[28】DupontK，NielsenE，BaekboP'eta1．GenomicanalysisofPCV2isolatesfromDanisharchivesandacurrentPMWScase-controlstudysupportsashiftingenotypeswithtime[J]．Veterinarymicrobiology2008；128(I、：56-64[29】TribleBR，RowlandRR．Geneticvariationofporcinecircovirustype2(PCV2)anditsrelevance14 万方数据第一章猪圆环病毒2型的国内外研究进展tovaccination，pathogenesisanddiagnosis[J]．Virusresearch2012；164(1)：68-77【30】郎洪武，吴发权．断奶猪多系统衰弱综合征血清抗体检测[J】．中国兽医科技2000；30(3)：3．5【31]吴瑗，章红兵，王鑫炎，等．2007～2012年浙江省及周边地区猪圆环病毒2本J_(PCV2)分子流行病学调查【J】．农业生物技术学报2013(04)：456—63【32】郭战军，李晓成，陈德坤，等．福州市猪圆环病毒II型(PCV2)流行病学调查【J】中国动物检疫2005；22(8)：23．5【33】卢寄军，王祝荣，张进．湖南省猪圆环病毒2型流行病学调查fJ】．中国动物检疫2012(02)：42-4[34】李玲，李国新，周艳君，等．2008～2011年中国部分地区猪圆环病毒2型的分子流行病学调查【J】．中国动物传染病学报2012(02)：1。10[351ChangH_W：JengC—RLinT-L，cta1．Irnmunopathologicaleffectsofporcinecircovirustype2(PCV2)onswinealveolarmacrophagesbyinvitroinoculation[J]．Veterinaryimmunologyandimmunopathology2006；110(3)：207—19[36】ChangH-WPangVF,ChenL-J，eta1．Bacterialiipopolysaccharideinducesporcinecircovirustype2replicationinswinealveolarmacrophages[J]．Veterinarymicrobiology2006；i15(4)：3I!-9[37】GilpinD，McCulloughK，MeehanB，eta1．Invitrostudiesontheinfectionandreplicationofporcinecircovirustype2incellsoftheporcineimmunesystem[J]．Veterinaryimmunologyandimmunopathology2003；94(3)：i49—61138]YuS，VincentA，OpriessnigT'eta1．QuantificationofPCV2capsidtranscriptinperipheralbloodmononuclearcells(PBMCs)invitro[J]．Veterinarymicrobiology2007；123(1)：3442139】YuS，HalburPG,ThackerE．Effectofporcinecircovirustype2infectionandreplicationonactivatedporcineperipheralbloodmononuclearcellsinvitro[J]，VetImmunolImmunopathol2009Feb15；127(3-4)：350．6[401VincentIE，CarrascoCP,Guzylack—PkiouL，eta1．Subset—dependentmodulationofdendriticcellactivitybycircovirustype2【J]Immunology2005；115(3)：388．98[411VincentI，CarrascoC，HerrmannB，eta1．Dendriticcellsharborinfectiousporcinecircovimstype2intheabsenceofapparentcellmodulationorreplicationofthevirus[J]．Journalofvkology2003；77(24)：13288—300【42】KekarainenT，MontoyaM，DominguezJ，eta1．Porcinecircovirustype2(PCV2)viral。omponentsimmunomodulaterecallantigenresponses[J]．Veterinaryimmunologyandimmunopathology2008；124(1)：41-9【43】SteinerE，BalmeUiC，HerrmannB，eta1．Porcinecircovirustype2displayspluripotencyincelltargeting[J]．Virology2008；378(2)：311-22[44】GriersonSS，KingDe,TuckerAW,eta1．Ontogenyofsystemiccellularimmunityintheneonatal15 万方数据猪圆环病毒2型和猪细小病毒体外混合感染致病机制的研究pig：correlationwiththedevelopmentofpost-weaningmultisystemicwastingsyndrome[J]．Veterinaryimmunologyandimmunopathology2007；119(3)：254—68【45】VincentIE，BalmelliC，MeehanB，eta1．Silencingofnaturalinterferonproducingcellactivationbyporcinecircovirustype2DNA[J]．Immunology2007；120(1)：47．56[46】RamamoorthyS，MengX-J．Porcineeircoviruses：aminusculeyetmammothparadox[J]．AnimalHealthResearchReviews2009；10(01)：1-20【47】DarwichL，MateuE．Immunologyofporcineckcovirustype2(PCV2)【J1．Virusresearch2叭2；164(1)：6l一7[48】DarwichL，BalaschM’Plana-Dur{lnJ，eta1．Cytokineprofilesofperipheralbloodmononuc|earcellsfrompigswithpostweaningmultisystemiewastingsyndromeinresponsetomitogen，superantigenorrecallviralantigens[J]．JournalofGeneralVirology2003；84(12)：3453—7[49】DarwichL，PidS，RoviraA，eta1．CytokinemRNAexpressionprofilesinlymphoidtissuesofpigsnaturallyaffectedbypostweaningmultisystemicwastingsyndrome[J]．JournalofGeneralVirology2003；84(8)：2117-25[50】DarwichL，Segal6sJ，ResendesA，eta1．TransientcorrelationbetweenviremialevelsandIL．10expressioninpigssubclinicallyinfectedwithporcinecircovirustype2(PCV2)[J】．Researchinveterinaryscience2008；84(2)：194—8【5l】KimJ，ChaeC．Expressionofmonocytechemoattractantprotein-1andmacrophageinflammatoryprotein一1inporcinecircovirus2-inducedgranulomatousinflammation[J]．Journalofcomparativepathology2004；131(2)：121-6【52】MisinzoGMeensP'BublotM，eta1．Bindingandentrycharacteristicsofporcinecircovirus2incellsoftheporcinemonocyticline3D4／3l[J】．Journalofgeneralvirology2005；86(7)：2057-68【53]MisinzoGDelputteP’LefebvreD，eta1．Porcinecircovirus2infectionofepithelialcellsisclathrin-，caveolae—anddynamin·independent，actinandRho—GTPase—mediated，andenhancedbycholesteroldepletion[J]．Virusresearch2009；139(1)：1-9【54】BratanichA，BlanchetotA．Agenesimilartothehumanhyaluronan-mediatedmotilityreceptor(RHAMM)geneisupregulatedduringPorcineCircovirustype2infection[J]．Virusgenes2006；32(2)：l45-52[55】LeeGHanD，SongJ-、‘eta1．Genomicexpressionprofilinginlymphnodeswithlymphoiddepletionfromporcinecircovirus2-infectedpigs[J]．JournalofGeneralVirology2010；9I(10)：2585—91【56】FinsterbuschT’SteinfeldtT，DobersteinK，eta1．Interactionofthereplicationproteinsandthecapsidproteinofporcinecircovirustype1and2withhostproteins[J]．Virology2009；386(1)：122—3116 万方数据第一章猪圆环病毒2型的国内外研究进展【57】TimmuskS，FossumC，BergM，Porcinecircovirustype2replicasebindsthecapsidproteinandanintermediatefilament—likeprotein[J]．Journalofgeneralvirology2006；87(11)：3215-23[58】LiuJ，ChenI，DuQ，eta1．TheORF3proteinofporcinecircovirustype2isinvolvedinviralpathogenesisinvivo[J]．Journalofvirology2006；80(10)：5065-73[59】KaruppannanAK，LiuS，JiaQ，eta1．Porcinecircovirustype2ORF3proteincompeteswithp53inbindingtoPirh2andmediatesthederegulationofp53homeostasis[J]．Virology20lO；398(1)：1—11[60】LiuJ，ChertLKwangJ．Characterizationofapreviouslyunidentifiedviralproteininporcinecircovirustype2-infectedcellsanditsroleinvirus-inducedapoptosis[J]．Journalofvirology2005；79(13)：8262-74【61】WeiL，KwangJ，WangJ，eta1．Porcinecircovirustype2inducestheactivationofnuclearfactorkappaBbylkappaBalphadegradation[J]．Virology2008Aug15；378(1)：177—84[62】HasslungFC，BergM，AllanGM，etai．Identificationofasequencefromthegenomeofporcinecircovirustype2withaninhibitoryeffectonIFN-ⅡproductionbyporcinePBMCs[J]．JournalofGeneralVirology2003；84(11)：2937—45[63】Wikstr6mFH，MeehanBM，BergM，eta1．Structure-dependentmodulationofalphainterferonproductionbyporcinecircovirus2oligodeoxyribonucleotideandCpGDNAsinporcineperipheralbloodmononuclearcells[J]．Journalofvirology2007；81(10)：4919—27[64】MeertsP’MisinzoG，NauwynckHJ．Enhancementofporcinecircovirus2replicationinporcinecelllinesbyIFN-Ybeforeandaftertreatmentandby1FN—aaftertreatment[J]．Journalofinterferon&cytokineresearch2005；25(11)：684-93【65]RamamoorthyS，OpriessnigT，PalN，etai．Effectofaninterferon—stimulatedresponseelement(ISRE)mutantofporcinecircovirustype2(PCV2)onPCV2一inducedpathologicallesionsinaporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)CO—infectionmodel[J]．Veterinarymicrobiology2011；147(1)：49—58【66】RoseN，OpriessnigT，GmslandB，eta1．Epidemiologyandtransmissionofporcinecircovimstype2(PCV2)【J1．Virusresearch2012；164(1)：78—89[67】MadsonD，OpriessnigrEffectofporcinecircovirustype2(PCV2)infectiononreproduction：disease，verticaltransmission，diagnosticsandvaccination[J]．AnimalHealthResearchReviews2011；12(01)：47—65【68】DarwichL，Segal6sJ，DomingoM，eta1．ChangesinCD4+，CD8+，CD4+CD8-1．，andimmunoglobulinM—positiveperipheralbloodmononuclearcellsofpostweaningmultisystemicwastingsyndrome。。affectedpigsandage·-matcheduninfectedwastedandhealthypigscorrelatewithlesionsandporcinecircovirustype2loadinlymphoidtissues[J]．Clinicalanddiagnostic17 万方数据猪圆环病毒2型和猪细小病毒体外混合感染致病机制的研究laboratoryimmunology2002；9(2)：236-42【69】JuhanN，LeRoitllT，OpriessnigT，eta1．Theopenreadingflame3(ORF3)ofporcinecircovirustype2(PCV2)isdispensableforvirusinfectionbutevidenceofreducedpathogenicityislimitedinpigsinfectedbyallORF3-nullPCV2mutant[J]．Virusresearch2010；147(1)：60—6【70】ShibaharaT，SatoKIshikawaYeta1．PorcinecircovirusinducesBlymphocytedepletioninpigswithwastingdiseasesyndrome[J]。TheJournalofveterinarymedicalscience／theJapaneseSocietyofVeterinaryScience2000；62(11)：1125-31【71]MandrioliL，SarliGPanareseS，eta1．Apoptosisandproliferativeactivityinlymphnodereactioninpostweaningmultisystemicwastingsyndrome(PMWS)【J】．Veterinaryimmunologyandimmunopathology2004；97(1)：25-37[72】ResendesAR，Maj6N，Segal6sJ，eta1．Apoptosisinlymphoidorgansofpigsnaturallyinfectedbyporcineckcovirustype2【J]．Journalofgeneralvirology2004；85(10)：2837-44【73】LagerK，GaugerP’VincentA，eta1．Mortalityinpigsgivenporcinecircovirustype2subgroup1and2virusesderivedfromDNAclones[J]．VeterinaryRecord2007；16l(12)：428—9【74】OpriessnigT，RamamoorthyS，MadsonD，eta1．Differencesinvirulenceamongporcinecircovirustype2isolatesareunrelatedtoclustertype2aor2bandpriorinfectionprovidesheterologousprotection[J]．Journalofgeneralvirology2008；89(10)：2482—9l【75]HardingJ，EllisJ，McIntoshK，eta1．Dualheterologousporcinecircovirusgenogroup2a／2binfectioninducesseverediseaseingerm—freepigs[J]．Veterinarymicrobiology20lO；145(3)：209-19【76】LarochelleR，MagarRD’AllaireS．Geneticcharacterizationandphylogeneticanalysisofporcinecircovirustype2(PCV2)strainsfromcasespresentingvariousclinicalconditions[J]．Virusresearch2002；90(1)：101-12[77】OlveraA，CorteyM，SegalesJ。Molecularevolutionofporcinecircovirustype2genomes：phylogenyandclonality【J】．Virology2007；357(2)：175—85[78】FenauxM，OpriessnigT，HalburP，eta1．Twoaminoacidmutationsinthecapsidproteinoftype2porcinecircovirus(PCV2)enhancedPCV2replicationinvitroandattenuatedthevirusinvivo[J]．Journalofvirology2004；78(24)：13440—6【79]KrakowkaS，AllanGEllisJ，eta1．Anine—basenucleotidesequenceintheporcinecircovirustype2(PCV2)nucleocapsidgenedeterminesviralreplicationandvirulence[J]．Virusresearch2012；164(1)：90—9[80】OpriessnigT，FenauxM，ThomasP’etal，Evidenceofbreed—dependentdifferencesinsusceptibilitytoporcinecircovirustype一2-associateddiseaseandlesions[J]．VeterinaryPathologyOnline2006；43(3)：281-9318 万方数据第一章猪圆环病毒2型的国内外研究进展[81】OpriessnigT，PattersonA，MadsonD，eta1．Differenceinseverityofporcinec证covirustypetwo—inducedpathologicallesionsbetweenLandraceandPietrainpigs[J]．Journalofanimalscience2009；87(5)：l582·90【82】OpriessnigT’FenauxM，YuS，eta1．EffectofporcineparvovirusvaccinationonthedevelopmentofPMWSinsegregatedearlyweanedpigscoinfectedwithtype2porcinecircovirusandporcineparvovirus[J]．Veterinarymicrobiology2004；98(3)：209—20【83】OpriessnigT'ThackerE，YuS，eta1．ExperimentalreproductionofpostweaningmultisystemicwastingsyndromeinpigsbydualinfectionwithMycoplasmahyopneumoniaeandporcinecircovirustype2【J】．VeterinaryPathologyOnline2004；41(6)：624-40【84】KrakowkaS，EllisJ，McNeillyF，eta1．Activationoftheimmunesystemisthepivotaleventintheproductionofwastingdiseaseinpigsinfectedwithporcinecircovirus一2(PCV-2)[J]．VeterinaryPathologyOnline2001；38(1)：3l一42【85]SinhaA，SheaH，SchalkS，eta1．Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusinfectionatthetimeofporcinecircovirustype2vaccinationhasnoimpactonvaccineefficacy[J]．ClinicalandVaccineImmunology2010；17(12)：1940-5【86】ShenH，BeachN，HuangYeta1．Comparisonofcommercialandexperimentalporcinecircovirustype2(pcv2)vaccinesusingatriplechallengewithPCV2，porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)，andporcineparvovirus(PPV)【J】，Vaccine2010；28(37)：5960—6【87]KimD，KimC，HanK，eta1．ComparativeefficacyofcommercialMycoplasmahyopneumoniaeandporcinecircovirus2(PCV2)vaccinesinpigsexperimentallyinfectedwithM．hyopneumoniaeandPCV2[J]．Vaccine2011；29(17)：3206-12[88】MeertsP’Guchtsv,CoxE，eta1．Correlationbetweentypeofadaptiveimmuneresponseagainstporcinecircovirustype2andlevelofvirusreplication[J]．Viralimmunology2005；18(2)：333-4l【89】MeertsP，MisinzoG，LefebvreD，eta1．Correlationbetweenthepresenceofneutralizingantibodiesagainstporcineckcovirus2(PCV2)andprotectionagainstreplicationofthevirusanddevelopmentofPCV2-associateddisease[J]．BMCveterinaryresearch2006；2(1)：6【90]TruongC，MaheD，BlanchardP，eta1．IdentificationofanimmunorelevantORF2epitopefromporcinecircovirustype2asaserologicalmarkerforexperimentalandnaturalinfection[J]．Archivesofvirology2001；146(6)：1197—211【91]FenauxM，OpriessnigT，HalburP’eta1．Achimericporcinecircovirus(PCV)withtheimmunogeniccapsidgeneofthepathogenicPCVtype2(PCV2)clonedintothegenomicbackboneofthenonpathogenicPCVIinducesprotectiveimmunityagainstPCV2infectioninpigs[J]．JournalofVirology2004；78(12)：6297—303[92】FortM，SibilaM，Perez—MartinE，eta1．Onedoseofaporcinecircovirus2(PCV2)sub—unit19 万方数据——猪圆环病毒2型和猪细小病毒体外混合感染致病机制的研究vaccineadministeredto3-week-oldconventionalpigletselicitsceil-mediatedimmunityandsignificantlyreducesPCV2viremiainanexperimentalmodel[J]．Vaccine2009；2700)：4031．7[93】SteinerE，BalmelliC，GerberH，eta1．Cellularadaptiveimmuneresponseagainstporcinecircovirustype2insubclinicallyinfectedpigstJ]．BMCveterinaryresearch2009；5(1)：4520 万方数据第二章猪细小病毒及与猪圆环病毒混合感染的研究进展第二章猪细小病毒及与猪圆环病毒混合感染的研究进展猪细小病毒病是由猪细小病毒(porcineparvovirus，PPV)弓I起的疾病，以初产母猪的繁殖障碍(屡配不孕、流产、死胎等)、仔猪的皮肤炎症和肠炎型腹泻为主要特征111。因母猪受胎率降低而给养猪业造成严重的经济损失。近年来，PPV与其他病毒混合感染发生较多，是导致很多疾病综合症的病原之一，尤其在PCV2感染引起的PMWS中具有协同促进作用。1病原学猪细小病毒属于细小病毒科，细小病毒属。病毒粒子呈圆形或六角形，无囊膜，直径约为20—30nln，基因组为单股负链DNA，病毒可在大多数细胞(猪。肾细胞、猪睾丸细胞等细胞)中生长繁殖并出现细胞病变，用免疫荧光技术可检测出细胞胞浆中病毒，病毒在细胞中可产生核内包涵体。病毒具有凝血活性，能凝集人、豚鼠、小鼠及鸡的红细胞，其中对豚鼠红细胞凝集作用最好。PPV对外界具有较强的抵抗力，能在56℃下48h，70℃下2h，其感染活性和血凝活性无明显变化，但80℃5min即可使感染活性和血凝活性均丧失。该病毒对乙醚、氯仿等有机溶剂不敏感，且pH适应范围较广。PPV按照毒力可分为强毒株和弱毒株，国内外研究较多的是强毒株NADL一8和弱毒株NADL．2。血清阴性怀孕母猪感染NADL．8强毒株后能引起病毒血症，并通过胎盘垂直传播感染使胎儿死亡；NADL．2是细胞适应后的毒株，怀孕母猪感染后不能通过胎盘垂直传播感染胎儿，因此常被用做弱毒疫苗株。Molitor等【2l研究推断NADL．2毒株感染细胞中存在干扰缺损颗粒，可干扰或减缓NADL．2的复制，这种干扰作用为宿主机体建立抵抗PPV的免疫反应提供了足够的时问，从而阻止了病毒血症的产生和继发的胎盘感染。2流行病学及致病机制2．1流行病学目前，已知猪是该病毒的唯一易感动物，各种品系、不同生长阶段、性别的野猪或家猪都可感染。据报道，从牛、绵羊、猫、豚鼠、小鼠和大鼠的血清中可检测到特异性抗体，来自病猪场鼠类抗体阳性率高于阴性猪场鼠类【3l。兔感染 万方数据猪圆环病毒2型和猪细小病毒体外混合感染致病机制的研究PPV后可致其流产、死产，这表明PPV的宿主范围正在扩大，感染谱逐渐加宽[41。Lucas掣习(1974)的研究证明PPV能通过交配传染给母猪。该病毒最早于1966年Mayr和Mahnel在用猪肾原代细胞培养猪瘟病毒组织时发现，并认为是细胞内潜伏感染的病毒。1967年Cartwright和Huck首次在猪流产胎儿的脏器中分离出猪细小病毒并证明其致病性，其后在比利时(1967)、德国(19681、日本(1972)、美1雪(1972)等许多国家均有本病的报道，在我国PPV发现较晚(1982)，但流行情况却比较普遍。PPV一年四季均可发病，主要发生在春季产仔季节。本病常见于初产母猪，呈地方流行性或散发。有报道指出，上世纪80年代到90年代中期，国内PPV阳性率很高，全国范围内，猪群PPV的阳性感染率在60％以上【6】。随着PPV疫苗的使用，PPV阳性率明显下降。刘伯庶等【17】对云南省农户散养猪具有繁殖障碍的3429头繁殖母猪和公猪进行了PPV流行病学调查，发现PPV感染率为27．7％。目前，PPV感染仍较严重。2．2致病机理PPV主要通过胎盘从感染母猪垂直传播给仔猪。PPV可在病猪心脏、肺脏、脾脏和性腺中复制，但其主要靶器官是母猪子宫，子宫内病毒含量最高可达10”拷贝／mL。对于仔猪，病毒同样感染心脏、肺脏、脾脏和性腺组织，以性腺含量最高。由此可见，病毒主要影响母猪的繁殖器官，同时，也破坏肺脏等呼吸器官和脾脏等免疫器官；而对小猪的损伤主要在于破坏脾脏和性腺等生理功能，同时破坏心脏等中枢器官，从而造成死亡。PPV的致病机理还不完全清楚，目前研究主要集Lfl在两个方面：一是猪感染PPV后体内激素水平变化。PPV能吸附在母猪受精卵细胞上，而部分PPV能穿过透明带进入受精卵细胞发挥作用；妊娠黄体能分泌孕激素，支持胎儿发育，猪感染PPV后黄体发生萎缩，抑制T月fi)L的发育，从而导致流产、死胎、木乃伊胎及新生仔猪死亡；二是病毒的作用方式[61。母猪感染PPV后，胎盘绒毛膜的间质细胞和内皮细胞内病毒含量随妊娠期的发展而明显增加，而子宫内皮细胞和滋养外胚层未检测到病毒病原，这表明母猪与胎儿问可能通过这些组织进行病毒的传播和传染16J。3PCV2与PPV混合感染的研究进展PCV2和PPV混合感染是目前造成养猪产、№严重损失的重要因素之一，国内外学者在这方面进行了大量的研究。 万方数据第二章猪细小病毒及与猪圆环病毒混合感染的研究进展研究发现PCV2和PPV混合感染分布非常广泛，J．Kim等在1997—2002年间对142头被诊断为渗出性皮炎的猪进行抗原检测，结果发现PCV2和PPV混合感染高达42．25％【81。J．Kim等通过原位杂交又对韩国133份患有PCVAD的病料进行检测，结果PPV抗原阳性率达25．6％【9i。J．A．Ellis等在3年间对25个猪场69头忠有PMWS的猪进行抗原检测，发现65(94．20％)头猪有PCV2抗原，12(17．39％)头猪有PPV抗原【J01。RinkuSharma等【11】对印度地区一繁殖障碍和新生儿死亡率较多的农场猪只通过病理组织学和PCR反应进行检测，70窝总共594头仔猪，9头木乃伊，13头死胎，记录了572头仔猪，平均每窝产活仔8．48头，194头在7天之内死亡，5窝(7．14％)能检测到PPV，其中2窝有PCV2混合感染。混合感染胎儿病理病变更严重，这表明这两种病毒之间存在协同作用。这项研究的结果表明在印度PPV与PCV2混合感染严重影响繁殖率和新生儿死亡率。徐君等【12】应用PCR技术对四川省21个规模化养猪场273份样品进行病原学检测发现，PCV2的感染非常普遍，同时检出PCV2和PPV抗原的样品占10．62％，同时存在PCV2和PPV的猪场占28．7％。贾赞【l31等通过PCR技术对华东地区127份临床病料的检测结果显示，67份为PCV2阳性，然后对这67份PCV2阳性病料进行PPV病原检测，发现18份(26．9％)为PCV2和PPV混合感染。黄松林等[14】对江苏淮安青浦区15个规模猪场共计150份血清样品进行抗体监测，发现猪圆环病毒2型抗体阳性率为32．67％，猪细小病毒的抗体阳性率为10％，猪圆环病毒2型与猪细小病毒混合感染的阳性率为7．33％。可见，PCV2和PPV混合感染在国内猪群中已经很普遍。S．KRAKOWKA等【15】在通过PCV2与PPV混合感染实验猪的试验复制PMWS的实验中发现在巨噬细胞和组织细胞中存在多个嗜碱性胞浆内包涵体；PCV2抗原在巨噬细胞内分布广泛，PPV抗原分布较稀疏；肝细胞坏死及胆汁潴留比较突出。得出PCV2与其他传染性病原体f如PPV)混合感染促进PMWS的发生。JohnEllis等¨6J在复制PMWS患病猪病变的实验中，发现可在PMWS患病猪损伤部位分离到PCV2和PPV抗原，所有感染猪都有高滴度的PCV2抗体和适度的PPV抗体，研究结果表明，PMWS的病变可通过利用PMWS患病猪分离的病毒复制出来，并为进一步研究这一新兴猪传染病的发病机理和控制疫情提供依据。G．M．Allan等【l7J利用免疫荧光技术和分离病毒技术通过对PCV2和PPV混合感染猪不同组织进行检测，结果表明通过展示PCV2和／或PPV感染1目龄初乳仔猪组织中检测出抗原的不同顺序，为进一步澄清PMWS发病机制提供依据。T．Opriessnig等[】sJ通过注射PPV灭活疫荫研究PPV疫苗对PCV2和PPV混合感染的作用，注射PPV灭活疫苗后混合感染有更明显的病毒血症和更高的PCV2抗原，但是PPV病毒抗原量明冠降低，说明接种PPV疫苗能预防PPV感 万方数据猪圃环病毒2型和猪细小病毒体外混合感染致病机制的研究染，但并没有阻止临床PMWS的发生或降低淋巴耗竭的严重程度。YHA等【19】通过不同顺序PPV和PCV2混合感染或免疫刺激来研究PMWS发病的机制，发现PCV2感染后再感染PPV或受到免疫刺激能促进PMWS的发病。24 万方数据第二章猪细小病毒及与猪圆环病毒混合感染的研究进展参考文献【1】仇铮，任晓峰，崔尚金，等．猪细小病毒的致病机制与防控策略【J】．世界华人消化杂志2013；21(1)：66·70f2】2MolitorTw’JooH，CollettM．Identificationandcharacterizationofaporcineparvovirusnonstructuralpolypeptide[J]．Journalofvirology1985；55(3)：554·9【3】陈溥言．兽医传染病学【M】．中国农业出版社，2006【4】王冠，代小芳，谢之景．猪细小病毒的研究进展【J】-山东畜牧兽医2012；33(1)：78-80【5】LucasMH，C捌ghtsF，WrathallA．Genitalinfectionofpigswithporcineparvovirus[J]．Journalofcomparativepathology1974；84(3)：347-50【6】蔺文成，胡峰，任梅，等．猪细小病毒病国内流行状况以及防治策略[J】．猪业科学2010(009)：90—5[7】刘伯庶，王琼秋，李永斌，等．猪细小病毒病流行病学调查[J]．中国畜牧兽医2007；33(9)：I0028一130[8】KimJ，ChaeC．Concurrentpresenceofporcinecircovirustype2andporcineparvovirusinretrospectivecasesofexudativeepidermitisinpigs[J]．TheVeterinaryJournal2004；167(!)：104—6【9】KimJ，ChungH，JungT，eta1．PostweaningmultisystemicwastingsyndromeofpigsinKorea：prevalence，microscopiclesionsandcoexistingmicroorganisms[J]．TheJournalofveterinarymedicalscience／theJapaneseSocietyofVeterinaryScience2002；64(1)：57-62I10】EllisJ，BratanichA，ClarkE，etai．Coinfectionbyporcinecircovirusesandporcineparvovirusinpigswithnaturallyacquiredpostweaningmultisystemicwastingsyndrome[J]．JournalofVeterinaryDiagnosticInvestigation2000；12(1)：21-7【l1】SharmaRSaikumarGPorcineparvovirus-andporcinecircovirus2-associatedreproductivefailureandneonatalmortalityincrossbredIndianpigs[J]．Tropicalanimalhealthandproduction2010；42(3)：515—22[121徐君，郭万柱，陈杨，等。四川省PPV与PCV2的病原流行病学调查【J】，·{J国兽药杂志2012(04)：44-7[13]贸赞，芦银华，张素芳，等．猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪细小病毒混合感染的流行病学调查【J】．中国病毒学2004(05)：39—42【14]黄松林，蒋法成，陈树霞，等．猪细小病毒与圆环病毒2型感染情况血清学调查[J】．中国猪业2012(09)：37—8【15】KrakowkaS，EllisJ，MeehanB，etal，Viralwastingsyndromeofswine：experimentalreproductionofpostweaningmultisystemicwastingsyndromeingnotobioticswinebycoinfectionwithporcinecircovirus2andporcineparvovirus[J]．VeterinaryPathologyOnline2000；37(3)：254—6325 万方数据猪圆环病毒2型和猪细小病毒体外混合感染致病机制的研究【16】EllisJ，KrakowkaS，LairmoreM，eta1．Reproductionoflesionsofpost、猎aningmultisystemicwastingsyndromeingnotobioticpiglets[J]．JournalofVeterinaryDiagnosticInvestigation1999；110)：3-14[171AllanG，McNeillyF’MeehanB，eta1．Asequentialstudyofexperimentalinfectionofpigswithporcinecircovirusandporcineparvovirus：immunostainingofcryostatsectionsandvirusisolation[J]．JournalofVeterinaryMedicine，SeriesB2000；47(2)：81-94【18】AllanGM，EllisJA．Porcinecircoviruses：areview[J]．JournalofVeterinaryDiagnosticInvestigation2000；12(1)：3—14[19】HaYLeeY’AhnK—K，eta1．Reproductionofpostweaningmultisystemicwastingsyndromeinpigsbyprenatalporcinecircovirus2infectionandpostnatalporcineparvovirusinfectionorimmunostimulation[J]，VeterinaryPathologyOnline2008；45(6)：842·826 万方数据第三章PCV-2、PPV、IFN-／、TNF一Ⅱ、IL．10和15-actinreal-timePCR检测方法的建立第二部分实验研究第三章PCV-2，PPVIFN．1，，TNF．仅，IL．10和13-actin部分基因片段real．timePCR检测方法的建立摘要：本研究根据GenBank中PCV2，PPV猪IFN．1，，TNF—q，IL一10，13-actin基因序列设计引物，用RT-PCR扩增猪肺泡巨噬细胞中相应的目的基因片段，连接到pMDl8．T载体中，经测序验证基因序列的正确性。再根据GenBank中相应序列设计PCV2，PPV猪IFN．1，，TNF一旺，IL．10，IB-actinreal．timePCR扩增引物，以上述构建的重组质粒为模板，优化RealtinePCR反应体系及反应条件，建立检测PCV2，PPV，猪IFN—Y，TNF一0【，IL一10，p-actin基因的定量方法，并进行了方法学评价。结果显示，以优化条件后real—timePCR反应所建立的标准曲线各参数均符合要求，标准曲线的判定系数R2均大于0．98，模板浓度在103—108copies／gL具有良好的扩增反应，重复性、稳定性和特异性良好。关键词：猪圆环病毒2型；猪细小病毒；细胞因子；实时荧光定量PCR猪圆环病毒2型(porcinecircovirustype2，PCV2)主要感染单核细胞．巨噬细胞、淋巴细胞等免疫细胞，造成免疫抑制。猪细小病毒porcineparvovirus，PPV)与猪圆环病毒2型具有协同促进作用，并且具有共同的靶细胞⋯。细胞因子在机体的免疫应答过程中起着十分重要的作用，常需要检测不同条件F培养的细胞表达细胞因子的活性，并以此研究细胞因子产生水平、免疫细胞表型等其它功能。目前细胞因子检测技术主要有以下几类：生物学检测，免疫学检测，分子生物学检测【2J。而分子生物学检测主要检测细胞因子的基因表达水平，分为RT-PCR、Northern法和实时荧光定量PCR法，而实时荧光定量PCR(RealtimequantitativePCR，RQ．PCR)技术是准确定量基因的方法，具有操作简便、快速高效，高通量，而且高敏感性等特点pJ。该技术在分子诊断、分子生物学研究、动植物检疫等方面具有重要的应用价值。本实验通过建立real—timePCR检测方法检测病毒核酸含量及细胞因子mRNA表达水平，为后续实验打下基础。 万方数据猪圆环病毒2型和猪细小病毒体外混合感染致病机制的研究1材料1．1毒株、细胞株和菌株猪圆环病毒2型NJ株(PCV2．NJ株)由本实验室分离并保存(105～TCID50／mL)；猪细小病毒NJ株(PPv-NJ株)由本实验分离并保存(107TCID50／mL)；PK一15细胞由成都天邦惠赠，ST细胞由本实验室保存；宿主菌E．coli菌株DH5a由本实验室保存。1．2载体克隆载体pMDl8一TVector，含有Amp抗性基因，购自宝生物工程(大连)有限公司。l，3主要试剂TotalRNA提取试剂RNAisoPlus、ProteinaseK、限制性内切酶BamHI、限制性内切酶HindIII、TakaraExTaq酶、SYBRPremixExTaq、DL2000DNAMarker、dNTPs、PrimeScriptReverseTranscriptase(RNaseH一)、ClonedRibonucleaseInhibitor、DNA凝胶回收试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司；E．Z．N．A．ViralDNAKit购自OMEGA公司；酵母提取物、蛋白胨购自OXOID公司；X．gal、IPTG、Ampicillin、琼脂糖均购自Sigma公司；MEM培养基、DMEM培养基购自Gbico公司；胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司；青链霉素购自哈药集团制药总厂；Tris饱和平衡酚(pH-一8．0)购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；其他试剂均为进口或国产分析纯。1．4主要仪器AIRTECH超净工作台、YakaraPCRThermalCyclerGradientPCR、Lightcycler480实时荧光定量PCR仪和实时荧光定量PCR加样板购自Roche公司、Eppendor微量移液器、核算电泳仪(TanonEPS．100型)、核酸电泳凝胶成像系统(uvPBioimagingSystems)、GeneQuantTMl300紫外分光光度计购自英国柏楮有限公司、倒置荧光显微镜(zeiss4．7)购自德国zeiss公司、C02恒温培养箱购自美国Thermo公司。 万方数据第三章PCV-2、PPV、IF／q-)'、TNF-a、IL-10和13-actinreal—tunePCR检测方法的建立2方法2．1PCV2病毒的增殖及TCID50的测定将PK．15细胞在37℃，5％C02条件下培养24h，待细胞长成单层后，弃去培养液，用PBS洗涤3次，加入200ttLPCV2病毒液(105‘6TCIDs0／mL)，吸附1h，每隔20min摇动一次，加入含有300mmol／mLD．氨基葡萄糖盐酸、2％小牛血清的MEM细胞培养液继续培养72h，反复冻融3次后收获病毒，放置一20℃冰箱中保存备用(长期保存需放置一80℃冰箱)。取上述收获的病毒液1000rpm离心10min取上清，用MEM培养液傲10倍梯度倍比稀释至10一，每个稀释梯度的病毒液接种96孔细胞培养板6个孔，每孔100gL，然后每孔加入100gLPK．15细胞悬液(细胞含量为5×105个／mL)，同时设立阴性正常细胞对照。细胞培养72h后，弃去上清，用PBS洗涤2次，每孔加入100“L80％丙酮于4℃固定30min；PBS洗涤2次，每次5min；每孔加入50此1：200倍稀释的PCV2Anti—viralAntiserum，37℃孵育1h，PBS洗涤5次，每次6min；每孔加入50pL1：500倍稀释的Dylight¨Ⅵ488一labeledAntibodyToSwineIgG，37℃避光孵育lh，PBS洗涤5次，每次8min；然后在倒置荧光显微镜下观察结果，按照Reed．Muench两氏法计算半数细胞培养感染量(TCID50)。2．2PPV病毒的增殖及TCID50的测定将ST细胞于37℃，5％C02条件下培养12h，待细胞贴壁，弃去上清用PBS洗涤2遍，加入100laLPPV病毒液(t07TCID5dmL)，吸附1h，每隔20min摇动一次，然后加入含有2％小牛血清的DMEM细胞培养液继续培养，待产生70％细胞病变时反复冻融3次收获病毒，放置．20℃冰箱保存备用(长期保存需放置一80℃冰箱)。取上述病毒液1000rpm离心10min取上清，用DMEM培养液做10倍梯度倍比稀释至10一，每个稀释梯度的病毒液接种96孔细胞培养板6个孔，每孔100心，然后每孔加入tOOp,LST细胞悬液(细胞含量为5x105个／mL)，同时设立阴性正常细胞对照。放置37℃，5％C02条件下培养，每日观察细胞病变，记录细胞产生CPE孔数，直到细胞CPE孔数稳定。按照Reed—Muench两氏法计算半数细胞培养感染量(TCIDs01。29 万方数据猪圆环病毒2型和猪细小病毒体外混合感染致病机制的研究2．3基因组的提取2．3．1DNA的提取取病毒样品，按照美国OMEGA公司病毒DNA提取试剂盒说明书提取病毒DNA。步骤如下：在1．5mL离一tl,管中加入2501．tL病毒样品；加入10pLOBProtease和250laLBL缓冲液(含有4此线性丙烯酰胺)，震荡混匀15S，于65℃水浴中放置10min，中问混匀一次。加入260pL无水乙醇，震荡混匀后离心去除沉淀。将HiBindDNAMini吸附柱放入到2mL离心管，将第2步上清液转移至离一tl,吸附柱中，8000g离一tl,1min，弃去离，11,管。将第3步吸附柱重新放入2mL离心管，加入500止BufferHB，8000g离心1min，弃去离心管中收集液。将吸附柱重新放入2mL离心管，加入700pLDNAWashBuffer(无水乙醇稀释)，8000g离心1min，重复洗涤一次。弃去收集液，15000g离心2min，以干燥吸附柱。将吸附柱放入1．5mL离心管，在吸附柱滤膜中心滴加50．100此DNAElutionBuffer，室温静置5min。将DNAElutionBuffer加热至65℃洗脱效率更佳。8000g离心1min收集样品即为病毒DNA。DNA样品可直接用于PCR或real—timePCR，需长期保存需放一20℃。2．3．2总RNA的提取取细胞样品，按照TAKARATotalRNA提取试剂RNAisoPlus提取步骤提取总RNA，步骤如下：取1mL细胞样品，8000g4℃离心2min，弃上清，注意不要破坏细胞沉淀。加入1mLRNAisoPlus，用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。室温f15．30℃)静置5min，然后从核蛋白中分离RNA。向上述步骤1的匀浆裂解液中加入氯仿(RNAisoPlus的1／5体积量)，盖紧离心管盖，混合至溶液乳化呈乳白色。室温静置5rain。12000g4℃离，tl,15min。从离一tl,机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液(含RNA)、中间的白色蛋白层(大部分为DNA)及带有颜色30 万方数据第三章PCV-2、PPV、IFN-1f、TNF—a、IL·10和13-aetinreal—timePCR检测方法的建立的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中(切勿吸出白色中间层)。向上清中加入O．5．1倍RNAisoPlus体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，室温下静置10min。12000g4℃离心10min。一般在离心后，试管底部会出现RNA沉淀。小心弃去上清，切勿触及沉淀，残留少量异丙醇没有关系。加入与RNAisoPlus等量的75％乙醇，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，7500g4℃离心5min后小心弃去上清，切勿触及沉淀。打开离心管盖，室温干燥沉淀几分钟。沉淀干燥后，加入适量的RNasefree水溶解沉淀，立即用于反转录或．80℃保存备用。2．4引物的设计与合成参照GenBank上已登录的基因序ytJ(序列号如表3-1)，利用PrimerPremier5．0软件分析设计如下引物，引物序列见表3．1，所有引物均由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。衰3-1中引物序列Table3-lsequenceofprimer 万方数据猪圆环病毒2型和猪细小病毒体外混合感染致病机制的研究2．5目的基因的扩增2．5．1猪IFN吖、TNF一Ⅱ、IL·10、13-actinmRNA的反转录在微量离心管中配置下列溶液表3-2反转录反应成分(1)Table3-2ConstituentsofRT(1)成分体积(此)OligodTprimer(50pm01)dNTPMixture(10mMeach)RnaseFreedH208Tbtal10将离心管于65℃水浴5min，立即放入冰盒中冷却，瞬时离心数秒，在上述管中配置下列反应液至总体积20此表3-3反转录反应成分(2)Table3-3ConstituentsofRT(2)成分体积(gL)TempateRNA／Primermixture5xPrimeScdptBufferRNaseInhibitor(40units)PrimeScriptReverseTranscriptase(200units)RnaseFreedH201050．54Total20轻轻混匀，按如下条件进行反应：30℃10min，42℃60min，75℃15min终止反应。2．5．2PCV2、PPV及细胞因子目的基因的的扩增按下表配置50IxL反应体系。32 万方数据瞬时离心数秒后，按下列循环参数进行PCR反应：94℃预变性5min；94。C60S，53。C(PCV2)／56℃(PPV)／56。C(IFN一3,)／56。C(TNF-a)／58℃(IL一10)／58。c(13．actin)退火60S，72℃延伸60S，共35个循环；最后72℃延伸10min，反应结束。取20laLPCR产物经1．5％琼脂糖凝胶电泳鉴定。切下目的条带后，使用DNA凝胶回收试剂盒对目的条带进行回收。2．6PCV2、PPV及细胞因子重组克隆质粒的构建2．6．1目的基因的连接在微量离心管中配置下列溶液，总量为10此。表3-5pMDl8一T载体的连接体系Table3-5ConstituentsofpMDl8-Tvectorligation成分体积(uL)pMDl8一TVertor目的片段ddH20SolutionITotal123510充分混匀后，于16℃反应过夜后进行转化实验。 万方数据猪圆环病毒2型和猪细小病毒体外混合感染致病机制的研究2．6．2感受态细胞DH5a的制备CaCl2法在超净工作台中，挑取少量DH50t甘油菌于LB琼脂平板上进行三区划线，于37℃培养箱中过夜培养；用接种环挑取单个菌落接种到3mLLB培养基中，在37℃摇床上震荡培养过夜；取50此培养好的菌液接种到5mLLB液体培养基中，37℃250rpm培养2—3h；吸取1．5mL菌液至1．5mL离心管中(提前预冷)，冰浴10min，于4℃3000rpm离心5min，弃去上清液，DH．,k300止预冷的0．1MCaCl2轻轻重悬菌液，冰浴30min，4℃3000rpm离心5min，弃去上清液，加入100gL预冷的o．1MCaCl2轻轻重悬菌液，用于转化实验。2．6．3转化吸取全量(10pL)连接产物加入到100mLDH5a感受态细胞(提前在冰上融化)中于冰上放置30min，42℃水浴热激60S后再置于冰上放置2．3min。在DH5ct感受态细胞中加入900此LB液体培养基于37℃摇床震荡lh。5000rpm离心弃去500pL培养液后轻轻重悬菌液。吸取150pL菌液于含有Amp／X—GaI／IPTG的LB琼脂培养基培养过夜。挑取白色单个菌落用于5mL液体LB培养基中培养用于阳性重组质粒的鉴定。2．6．4质粒的提取质粒提取按照Axygenmini—prepare质粒提取试剂盒说明书步骤提取。取2mL在LB培养基中培养过夜的菌液，12000g离心1rain，弃尽上清。加250mLBufferS1悬浮细胞沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块。加入250gLBufferS2，温和并充分地上下翻转4-6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过5min。加入350pLBufferS3，温和并充分地上下翻转混合6-8次，12000g离一tl,10rain。吸取上步中的离心上清并转移到制备管(置于2mL离心管中)，12000g离心lrain，弃滤液。将制各管置回离，tl,管，加500gLBufferW1，12000g离心1min，弃滤液。将制备管置回离心管，加700laLBufferW2，12000g离心1rain，弃滤液；34 万方数据第三章PCV-2、PPV、1FN-)'、TNF．a、IL-10和13-actinreal-timeP至坠耸测查鲨塑堡皇以同样方法再用700此BufferW2洗涤一次。弃滤液。将制备管置回2mL离心管，120009离心1min。将制备管移入新的1．5mL离心管中，在制备膜中央加入60I．tLEluent或去离子水，室温静置lmin。12000g离心lrain。2．6．5重组质粒的鉴定应用限制性内切酶BamHI和限制性内切酶HindIII对提取的重组质粒进行双酶切鉴定插入到pMDl8．T载体的片段大小是否与插入的目的片段大小一致，配置下列溶液(表3—6)将鉴定的阳性质粒所对应的菌液送Invitrogen公司测序，结果利用DNAstar6．0软件分析与比较。表3-6酶切反应体系Table3-6ConstituentsofDigestion成分体积(“L)BamHIHindllI10×KBU舵r重组质粒ddH，OTotal2．7real—timePCR方法的建立2．7．1引物的设计与合成根据PCV2、PPV病毒及猪细胞因子基因的保守序列设计引物，引物由lnvitrogen合成，引物序列见表3—7。●，0，勉如 万方数据猪圆环病毒2型和猪细小病毒体外混合感染致病机制的研究表3—7SYBRGreenIreal．timePCR引物Table3-7PfimerSofSYBRGreenIreal．timePCR序列号目的基因F物／bp引物序列(5’．3’)鱼!些旦塑!：!堑!鱼!!!￡翌!望!业P!!里!!!191111111：：!：!HM009332PCV2145JQ710893PPV182x530851FN吖141X54859TNF，Ⅱ199L2000】162U0778615-actin142Forward：AT：八ACCCAGCCClvI℃TCClACCReverse：GGCCTACGTGGTCTACAr兀℃CForward：CAACTACGCAGCAACTCCAATReverse：CAAAGCAGGCTCTTATGTCGForward：TAGCTCTGGGAAACTGAATGACReverse．-CTCTTCCGCllTCllIAGGTI'AGForward：CGTTGTAGCCAArGTCAAAGCCReverse：GCTGATGGTGTGAGTGAGGAAAForward：GGACCAOATGGGCGAC下rGrrGReverse：TCCCCATCACTCTCTGCCTTCGForward：AGGTCATCACC^TCGGCAAReverse：AGGTCCTTCCTGArGTCCACG2．7．2阳性重组质粒的浓度测定及拷贝数浓度的计算使用核酸紫外分光光度计测定阳性重组质粒A260和A280，选取A260／A280在1．8—2．1之间的阳性重组质粒做为构建real—timePCR方法的模板。根据以下公式计算阳性质粒拷贝数浓度：模板质粒的拷贝数浓度(copies／pL)=质粒的质量浓度(咖L)×阿伏加德罗常数(copies／m01)／质粒的分子量(g／m01)质粒的分子且(g／m01)=质粒的碱基总数x2x324．5(g／mL)2．8real—timePCR反应条件的优化2．8．1退火温度的优化根据TAKARA提供的RochelightCycler反应体系，以退火温度为60℃分别对各质粒模板标准品进行real—timePCR反应，反应条件为95℃30S，1个循环；95℃5S，60℃20S，40个循环。计算扩增效率和相关系数，若达不到要求，相应的提高或降低退火温度。36 万方数据第三章PCV-2、PPV、IFN-7、n师-Q、IL-10和p-actinreal-timePCR检测方法的建立2．8．2引物浓度的优化根据TAKARA提供的RocheLightCycler反应体系，以2止相同浓度质粒为模板，以TAKARA推荐的引物浓度(终浓度0．2uM)进行real—timePCR反应，分析扩增曲线和熔解曲线，若达不到要求，相应的提高或降低引物浓度。2．8．3real．timePCR标准曲线的建立和反应条件的评估根据重组质粒拷贝数浓度进行10倍梯度倍比稀释，选取合适浓度范围(103—108copies／ixL)，每个浓度梯度设立3个重复样本进行real—timePCR反应来建立标准曲线。配置下列PCR反应体系，全量为20此。表3-8SYBRGreenIreal—timePCR反应体系Table3—8ConstituentsofSYBRGreenTreal．timePCR成分体积(止．)SYBRPremixExTaq上游引物下游引物模板ddH2010O．40．42．O7．2Tbtal20按照下列条件进行扩增反应：95℃30S，1个循环；95℃5S，60℃20s，40个循环；反应结束后，分析熔解曲线，根据各浓度组对应的重复样本ct值，绘制标准曲线，并计算扩增效率。2．9real．timePCR方法学评价2．9．1重复性对real—timePCR试验中不同浓度重复样品Ct值的标准差分析，评价批内重复性，对同一浓度样品不同批次real—timePCR反应，评价批问重复性。2．9．2特异性根据各样品real．timePCR的熔解曲线评价该反应扩增产物是否单一。 万方数据猪圆环病毒2型和猪细小病毒体外混合感染致病机制的研究2．9．3敏感性对模板质粒(108copieS／肛L)进行适当的10倍比稀释，按照表3．8中反应体系，使用优化后的反应条件进行扩增，分析real．timePCR所能扩增的最小重组质粒浓度。3结果3．1PCV2、PPV及猪细胞因子目的基因的扩增利用设计的引物，对提取的基因进行PCR或RT-PCR反应，分别扩增得到PCV2基因1767bp，PPV基因1989bp，IFN吖基因449bp，TNF-0【基因416bp，IL一10基因412bp，13-actin基因526bp与预期结果一致。燃擎2000bp1000bpi；8器MPCV2图3-1PCV2基因PCR结果Fig．3—1PCRresultofPCV2M：DLl0000DNAMarker；PCV2：TargetFragementofPCV2M1FN一72000bp{05000bpbp500bp250bp图3-3IFN-T基因RT-PCR结果图Fig．3—3RT-PCRresultofIFN-7M：DL2000DNAMarker；IFN一?：TargetFragementoflFN-?382000bp1000bp750bp500bp250bp100bpMPPV图3-2PPVNSl基因PCR结果Fig．3—2PCRresultofPPVNSlM：DL2000DNAMarker；PPV：TargetFragementofPPVNS1M．rNl?一c【2000bp{282字500bD250bp100bp图3．4TNF—a基因RT-PCR结果Fig．3·4RT-PCRresultofTNF—aM：DL2000DNAMarker；TNF—ct：TargetFragementofIFN—or． 万方数据第三章PCV-2、PPV、IFN-7、TNF-a、IL·10和[B-actinreal-timePCR检测方法的建立250bp100bpMIL—10图3-5IFN叫基因RT-PCR结果图Fig．3—5RT-PCRresultofIL一10M：DL2000DNAMarker；IL··10：TargetFragementofIL·-103．2重组质粒的双酶切鉴定250bplOObpMB·actin图3-613-actin基因RT-PCR结果Fig．3-6RT-PCRresultofpactinM：DL2000DNAMarker；13-actin：TargetFragementofp—actin将PCR或RT-PCR扩增获得的PCV2、PPV、IFN吖、n师．q、IL一10、13-actin基因的目的片段经过连接pMDl8．T载体，转化DH5a感受态细胞，挑取阳性菌落，摇菌培养，获得阳性重组质粒pMDl8一T-PCV2，pMDl8一T-PPVpMDl8．T-IFN吖，pMDl8一T-TNF—c【，pMDl8-T-IL—10，pMDl8一T-13一actin；对重组质粒进行双酶切(BamHI和HindIII)鉴定，获得PCV2，PPVIFN-?，TNF．0【，IL．10，fl-actin的基因片段，与预期结果相符，结果如下图：同时将Invitrogen公司的测序结果与GenBank中以发表的序列进行比对，同源率在98％以上。2000bp；282000pbp500bp250bp100bpMPCV22000bp勰9250bplOObpMPPV39图3-7重组质粒pMDl8-T-PCV2和pMDig—T-PPV双酶切结果Fi93-7ProductsfromRecombinantpllasmidpMDl8-T-PCV2和pMDl8·ToPPVdigestedwithenzymePCV2：DigestedproductsfrompMDlg—T-PCV2PPV：DigestedproductsfrompMDl8-T-PPV 万方数据猪圆环病毒2型和猪细小病毒体外混合感染致病机制的研究2000bp{282≯500bp250bp100bp2000bp{50000b。bp500bp250bp100bpMIFN．vMIL一102000bp；282≯500bp250bp100bp2000bp{98黜500bp250bp100bp3．3重组质粒浓度的计算MTNF—c【M13-actin图3-8重组质粒pMDl8-T-IFN-y和pMDl8．Fn师吨双酶切结果Fi93-8ProductsfromRecombinantpllasmidpMDl8-T-IFNff和pMDl8-T-TNF-adigestedwithenzymeIF'N-y：DigestedproductsfrompMDl8一T-IFN-YTNF-旺：DigestedproductsfrompMDl8-T-TNF·a图3-9重组质粒pMDl8-T-IL一10和pMDl8．T_B．actin双酶切结果Fi93-9ProductsfromRecombinantpllasmidpMDl8一T-IL-10和pMDl8-T-[B-actindigestedwithenzymeIL·10：DigestedproductsfrompMDl8一T-IL一1013-actin：DigestedproductsfrompMDi8--T-13·-actin利用核酸紫外分光光度计测定各质粒样品，选取A260／A280比值在1．8—2．1之间的重组质粒做为构建real—timePCR标准曲线的模板，通过模板拷贝浓度公式计算获得各模板质粒的浓度如下：表3-9重组质粒的拷贝浓度Table3-9Copyconcentrationsofrecombinantplasmids重组质粒名称A260／A280质粒浓度(1xg／mL)拷贝浓度(copies／laL)pMDl8-T-PCV22．03220．65x1024．09x10“pMDl8．T-PPV2．07945．95×1029．10×10llpMDI8一T_IFN_vpMD18一T_耵、『F一0【2．0102．024pMDl8一T-IL-102．06068．95x10285．OOx10285．80x1021．36x10121．68x10121．70x1012 万方数据第三章PCV-2、PPV、IFN-y、TNF-q、IL·10和}actinreal-timePCR检测方法的建立3．4反应条件的优化3．4．1退火温度的优化使用TAKARA推荐的2步法将60℃作为退火温度，扩增动力学曲线良好，并且所对应的熔解曲线无非特异性扩增出现。3．4．2引物浓度的优化使用TAKARA推荐的RocheLightCycler反应体系，终浓度为0．2ttM的引物扩增动力学曲线良好，并且所对应的熔解曲线无非特异性扩增出现。3．4．3real-timePCR标准曲线结果根据优化好的退火温度和引物浓度，将重组质粒进行10倍梯度倍比稀释，2-108copies／p,L)，进行real—timePCR，每个浓度做3个重复样品，通过LightCycler480soft-warerelease1．5．0SP3软件进行数据分析。获得PCV2、PPV、细胞因子和管家基因的标准曲线。PCV2基因标准曲线(图3．10)的截距为45．2l，斜率为．3．511，扩增效率为92．7％，误差为0．0109，判定系数R2为0．99；PPV基因标准曲线(图3．11)的截距为37．38，斜率为．3．317，扩增效率为100．2％，误差为0．042，判定系数R2为0．99；IFN吖基因标准曲线(图3—12)的截距为40．18，斜率为．3．513，扩增效率为92．6％，误差为0．0717，判定系数R2为0．99；TNF一0【基因标准曲线(图3．13)的截距为43．45，斜率为．3．498，扩增效率为93．1％，误差为0．0492，判定系数R2为0．99；IL一10基因标准曲线(图3．14)的截距为32．11，斜率为．3．309，扩增效率为100．6％，误差为0．00995，判定系数R2为O．99；13-actin基因标准曲线(图3．15)的截距为37．72，斜率为．3．327，扩增效率为99．8％，误差为0．0120，判定系数R2为0．99。‘■i?_’一；。■1EfFOr：00109Efflf=iency：1927S№-3511Y抽№，c∞f：扼21Unk：71460“⋯⋯‘”⋯一j‘。五’：ii’图3—10PCV2标准曲线和扩增动力学曲线Fig．3—10StandardcurveandamplificationcurvesforPCV2 万方数据猪圆环病毒2型和猪细小病毒体外混合感染致病机制的研究图3．11PPV标准曲线和扩增动力学曲线Fig．3—11StandardCHrVCandamplificationcurvesforPPVjl●¨●⋯⋯E蔓亘三叠三三]图3—12IFN吖标准曲线和扩增动力学曲线Fig．3—12StandardcurveandamplificationCHIVESforIFN-?图3．13TNF。a标准曲线和扩增动力学曲线Fig．3—13StandardcurveandamplificationcurvesforTNF—ccE撇000995EHide‘q2．006sIr，呻：·13∞Ylmerce吨32．11Link：103，＼、、、J图3—14IL．10基因的标准曲线和扩增动力学曲线Fig．3—14StandardcurveandamplificationcurvesforIL一1042 万方数据第三章PCV-2、PPV、IFN-y、TNF-G、IL．10和[I-actinreal-timePCR检测方法的建立E亘三王玉司图3-15肛actin基因的标准曲线和扩增动力学曲线Fig．3-15StandardcurveandamplificationcurVesforp-actin3．5real-timePCR方法学评价3．5．1重复性根据各基因标准曲线不同浓度拷贝模板(108copies#tL．103copie叽L)样品批内重复实验，实验结果如图3—16，PCV2基因批重复模板Cp值标准差分别在0．1—0．5之间；PPV基因批重复模板Cp值标准差分别在0．04—0．21之间；IFN-y基因批重复模板Cp值标准差分别在0．03-0．20之间；TNF．c【基因批重复模板Cp值标准差分别在0．01·0．07之间；IL-lO基因批重复模板Cp值标准差分别在O．01-0．09之Sambas∞．D2E2C3．D3E3C4．04E4c5．05．E5cB．D矗E6日7髓．B9C7c8C9D7．Oa,DOE7朗E9G7GBG9H7．H8H9C7．C8．C907D8D9PCV2SbthⅡ∞№柏cp驯cp。⋯，。⋯s鲫毋曼'4-fO．0，7C5．C6．C717珀010D5。D6．D72¨60¨E5．E6．E72453n14F5．F6．F727■3a47G5。G6．G73135050H6H7＆咄s81nB'1010．011．D12E10．E11E12F10．F¨F12G1仉G11．G12PPV№锄Cp$tdcp25监01818B4010IFN—YTNF—aSbUtIc■勉攀峰一⋯⋯一⋯⋯。。。--砖粤譬只。枣t印，i⋯～⋯⋯一～一～墅咧堕⋯。．⋯一一⋯一。工。蝼冀卿一i曼嗵蜘12柑000斛．∞．∞12．490．031558：004CA．C5C6。156400218即003，I)4．05．％18∞004誓霉-o熙E4．ES．E622,(50092i斟0．01F4．F5．FB：25720012876O04：C4，G5．G62923010Il，一10B—actin图3．16不同模板浓度对应的cp值及标准差Fig．3—16TheCpvaluesandthestandarddeviatiOilfordifferenttemplateconcentration间；13-actin基因批重复模板Cp值标准差分别在O．01—0．09之间。说明该方法批内重复性良好。如图3—17，根据同一基因同一拷贝浓度模板106copies／gL做批间重 万方数据猪圆环病毒2型和猪细小病毒体外混合感染致病机制的研究复实验，PCV2，PPV,IFN吖，TNF—a，IL．10，13-actin基因的标准差分别为0．05、0．05、0．07、O．02、0．01、0．04，说明该方法批间重复性良好。StatisticsPCV2PPV’、^～Ph”。。——◆；C1。C2，C3IF'N-7————◆1NF．a——◆IL．10——◆13-aetin———+翌野翌蜀翱m隧鬯；。．～⋯iea⋯ncp一，；，Stc、、l印⋯17。160。05。-⋯⋯-一；v一--⋯一一·j一，，一⋯一r18．470．05．．—⋯一．⋯．．一一．一．-⋯一⋯～～一一*SamplesMeancpi洲cpF1。F2。F3伯．390．071F7，F8，F918．33：0．02；FIO,F11。F1217．77O．01：G4．G5。G619．∞10．04图3．17相同模板浓度对应的Cp值及标准差Fig．3．17TheCpvaluesandthestandarddeviationforsametemplateconcentration3．5．2特异性根据图3—18各基因的熔解曲线，均只有单一熔解峰，说明real-timePCR反应中产物单一，没有非特异性扩增。3．5．3敏感性根据图PCV2，PPV,IFN-一、／，TNF．a，IL．10，13-actin基因的标准曲线和扩增动力学曲线分析，说明real．timePCR检测方法在103copies／lxL一108copies／1．tL范围内对PCV2，PPV,IFN-7，TNF．伐，IL．10，13-actin基因有较好的扩增。一⋯√，。。。”—。————————√龟⋯^八y—i～一 万方数据第三章PCV-2、PPV、IFNq、TNF-ff,、IL．10和I孓actinreal-timePCR检测方法的建立图3．18PCV2、PPV、IFNq、TNF吨、IL—10和p-actin基因的熔解曲线Fig．3—18MeltingCurveofPCV2、PPV、IFNq,、1NF-a、IL-10and争aztin4讨论自1995年，美国PE公司研制成功具有革命性意义的荧光定量PCR技术，融合了PCR的高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确定量等优点【3】。该技术不仅能够实现DNA或cDNA的定性分析更能实现定量分析，由于在封闭的体系中完成定量分析，大大降低了污染的可能性，该检测技术操作简便，快速高效，高通量而且具有很高的敏感性、重复性和特异性；目前已广泛用于新型农业、医学诊断、基础研究、海关检验检疫等领域。目前，real．timePCR使用的荧光化学方法主要有以下四种：DNA结合染料法、水解探针法、杂交探针法和荧光引物法。对于单重复、低通量的实验优先选择DNA结合染料法，因为这个实验设计简单、条件建立快、开始成本低、无需设计多个探针即可以快速检验多个基因且能够进行熔点曲线分析检验扩增反应的特异性(BIO—RAD荧光定量PCR应用指南)。本研究中选用SYBRGreenI染料来利用双链DNA的结合染料法监测目的基因序列的扩增。通过对6个目的片段熔解曲线的分析，6个目的片段熔接峰都比较单一，没有非特异性扩增，说明利用该方法扩增的6个目的基因片段特异性高。real．timePCR常用的定量方法有2类：一是绝对定量法；二是相对定量法。绝对定量主要用于病原体监测、转基因食品检测和基因表达研究等；相对定量主要用于基因在不同组织中的表达差异、药物疗效考核和耐药性研究等。本研究中对PCV2和PPV病毒核酸拷贝数进行绝对定量分析，从而获得病毒基因在细胞中的准确表达量。在相对定量real—timePCR中，内参基因常被用来作为数据标准化的对照，用以校正模板cDNA存在的数量差异【4，引。理想的内参基因应满足以下条件：表达要稳定；表达丰度为高度或中度，避免低度：表达的丰度与目的基因要接近；不存在假基因，以避免基因组DNA的扩增；表达水平与细胞周期 万方数据猪圆环病毒2型和猪细小病毒体外混合感染致病机制的研究以及细胞是否活化无关；不受任何内源性或外源性因素的影响【6】。本研究中选择13-actin基因作为内参基因，对其他各基因进行相对定量分析。通过本研究，我们构建了PCV2、PPV、IFNmTNF一0【、IL一10、13-actin基因的阳性重组质粒，获得了检测PCV2、PPV、IFN小TNF-晓、IL．10、13-actin基因的realtimePCR方法，通过realtimePCR方法学评价说明本方法可靠性好，可重复性好，特异性强，灵敏度高，为后面章节的定量实验打下了基础。 万方数据第三章PCV-2、PPV、IFN吖、TNF一旺、1L-IO和13-actinreal-timePCR检测方法的建立参考文献KimJ，ChoiC，ChaeC．PathogenesisofpostweaningmultisystemicwastingsyndromereproducedbyCO—infectionwithKoreanisolatesofporcinecircovirus2andporcineparvovirus[J]．Journalofcomparativepathology2003；128(I)：52—9杨汉春．动物免疫学【M】．中国农业大学出版社，1996陈旭，齐凤坤，康立功，等．实时荧光定量PCR技术研究进展及其应用[JJ．东北农业大学学报．2010(8)：148·55GutierrezL，MauriatM，Gu6ninS，etai．Thelackofasystematicvalidationofreferencegenes：aseriouspitfallundervaluedinreversetranscription—polymemsechainreaction(RT’PCR)analysisinplants[J]．Plantbiotechnologyjournal2008；6(6)：609—18VandesompeleJ，DePreterK，PattynF’eta1．Accuratenormalizationofreal-timequantitativeRT-PCRdatabygeometricaveragingofmultipleinternalcontrolgenes[J]．Genomebiology2002；3(7)：research0034陈风仡．实时荧光定量RT-PCR内参基因的选择【J】。临床检验杂志2005；23(5)：393—547Ⅲ嘲嘲附嘲 万方数据猪圆环病毒2型和猪细小病毒体外混合感染致病机制的研究THEESTABLISHMENToFREAL．TIMEPCRDETECTIoNMETHoDFoRPCV2，PPVTNF—A，IFN—EIL一10ANDB—ACTINABSTRACT：Inthisstudy,theprimersofPCV2，PPV：porcineIFN—Y，TNF-a，IL-10and13-actinweredesignedaccordingtothegenesequencespublishedinGenBank．ThecorrespondingtargetgenefragmentfromporcinealveolarmacrophageswasamplificatebyRT-PCR，andthenconnected、杭t11thepMDl8一Tvector,verifythecorrectnessofthegenesequencebysequencing．TheprimersofPCV2，PPVporcineIFN吖，TNF一0【，IL一10andp-actinweredesignedforreal-timePCR．Therecombinantplasmidwasusedasatemplateabove，Thereactionsystemandtheprimerconcentrationwasoptimizateofreal—timePCR，themethedtodetectPCV2，PPV'porcineIFN-，y'，TNF一位，IL一10and13-actingenewasestablished，andthemethodologywasevaluated．Theresultshowthat，theparametersofthestandarde1．1iNeweremeettherequirementsbyoptimizereal—timePCRconditions．ThecoefficientofdeterminationR2ofthestandardcurveweregreaterthan0．98．Theamplificationreactionwereverygoodwhenthetemplateconcentrationbetween103copies／pLand108copies／I．tL，andhavegoodrepeatability,stabilityandspecificity．KEYWORD：porcinecircovirustype2；porcineparvovirus；cytokines；real—timePCR 万方数据第四章PCV2与PPV混合感染对原代PAM的影响摘要：本研究通过．PCV2和PPV混合感染PAM，检测感染后不同时f司PCV2和PPV病毒核酸拷贝数以及IFN吖，7ⅢF．c【，IL—10mRNA表达的动态变化，分析PCV2和PPv混合感染对细胞免疫反应的影响。将PAM分为4组：PPV单独感染组、PCV2单独感染组、PCV2与PPVi昆合感染组、对照组。在接种病毒12h、24h、36h、48h、60h、72h各时间点提取病毒DNA及PAM细胞总RNA。用已经建立的real-timePCR法检测各组中病毒核酸拷贝数7ZIFN．％TNF．Ⅱ，IL．10mRNA表达的动态水平。结果显示，PCV2和PPV,昆合感染后，PCV2与PPV单独感染组PCV2病毒核酸拷贝数高于PCV2单独感染组，PCV2与PPV单独感染组PPV病毒核酸拷贝数在60hpi后显著高于PPV单独感染组；PCV2单独感染组和PPV单独感染组IFN—YmRNA表达水平上调，PCV2与PPV单独感染组IFN吖mRNA表达表达水平下调；病毒感染后都可引起TNF一0cmRNA表达水平的上调，36hpi前PCV2感染起主要作用，48hpi后PPV感染起主要作用，PCV2与PPVSPc,合感染TNF．0【mRNA明显高于单独感染组；在24hpi、36hpi，PCV2和PPV单独感染可引起IL．10mRNA表迭水平的上调，PCV2与PPVi昆合感染后在36hpi、48hpiIL．10mRNA表达水平显著上调，其它时间不显著。关键词：猪圆环病毒2型；猪细小病毒；细胞因子；实时荧光定量PCR；信使RNA猪圆环病毒2型(porcinecircovirustype2，PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMwS)的主要病原⋯，还可以引起诸如皮炎与。肾病综合征(PDNS)、呼吸道疾病综合征(PRDC)矛U繁殖障碍等疾病，统称为猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)。在病猪多种组织(胸腺、脾、肠系膜等)中都可以检测到该病毒，而肺脏和淋巴结中检出率相对较高121。病毒主要感染单核／巨噬细胞细胞系，包括猪肺泡巨噬细胞口J，说明PCV2严重侵害感染猪的免疫系统，造成免疫抑制，其它病毒(PRRSV、PPV、SIV、姒hyopneumoniae)趁虚而入，继发感染，造成严重的经济损失。肺泡巨噬细胞(alveolarmacrophage，AM)是肺部防御系统抵御各种病原体的第一道防线。而在PMWS患病猪肺泡中常见组织细胞和多核巨细胞浸润的问质性肺炎14J。目前，PMWS的发病机制还不清楚，但是肺泡巨噬细胞感染PCv2对PMWs的发生有重要的作用。鉴于肺泡巨噬细胞是PCV2干HPPV共同的靶细胞[5]，本章实验采用PCV2与PPV混合感染猪肺泡巨噬细胞，检测细胞中病毒核酸拷贝数及细胞细胞因子mRNA表达水平变化，从细胞免疫层面探索PCV2与PPV混合感染的 万方数据猪圆环病毒2型和猪细小病毒体外混合感染致病机制的研究机制。1材料1．1病毒与细胞猪圆环病毒2型NJ株(PCV2．NJ株)由本实验室分离并保存(105一TCID50／mL)，猪细小病毒NJ株(PPV-NJ株)由本实验室分离并保存(107TCID50／mE)。猪肾细胞(PK一15)细胞由成都天邦惠赠，猪睾丸细胞(sT)细胞由本实验室保存。1．2主要试剂RPMI1640培养基、胰蛋白酶购自GIBCO公司；青霉素、链霉素购自哈药集团制药总厂；胎牛血清(FBS)购自浙江天杭生物科技有限公司；病毒DNA提取试剂盒购自美国0MEGA公司，PrimeScriptTMReverseTranscriptase、Oligod(T)15Primer、dNTPMixture、RNaseInhibitor、SYBRPremixEXTaq刑、购自宝生物(大连)生物技术公司(TAKARA)。1．3主要仪器AIRTECH超净工作台、Lightcycler480实时荧光定量PCR仪和实时荧光定量PCR加样板购自Roche公司、Eppendor微量移液器、倒置荧光显微镜(zeiss4．7)购自德国zeiss公司、C02恒温培养箱购自美国Thermo公司。1．4实验动物5周龄断奶仔猪，经EIISA检钡w]PCV2、PPV抗体阴性，经PCR／RT．PCR检测PCV2、PPV、PRRSV、PRV、SIV、CSFV和猪肺炎支原体均阴性。2方法2．1肺泡巨噬细胞(PAM)的分离对试验猪进行臂动脉放血致死，剖开胸腔，结扎气管后连同心脏取出完整的肺脏，去掉心脏及周围脂肪等组织后，用无菌生理盐水充分漂洗肺表面，清除血块、污物，从气管往肺脏注入含5％FBs的灭菌PBs100．150mL，轻轻拍打肺脏表面，2．5rain后回收灌洗液；同上方法重复灌洗2~3次，一直到共回收约300mL50 万方数据第四章PCV2与PPV混合感染对原代PAM的影响灌洗液，将回收的支气管肺泡灌洗液用吸管轻轻吹打，使其细胞团及黏液块分散，2000rpm离心10min，弃上清，用无菌PBS重悬细胞，2000rpm离心10min，弃上清，同上方法重复洗涤1次，用含10％FBS的RPMI1640营养液重悬细胞，取20pL细胞悬液于1．5mL离心管，加入80¨L0．2％台盼蓝染液混匀，室温作用3—5min，滴一滴至细胞计数板上计数，死亡细胞被染成蓝色。根据公式：每个大方格中蓝色细胞数／每个大方格中细胞总数×100％，计算PAM存活率。经台盼蓝染色检测活细胞比率达到98％以上后，调整细胞浓度，接种至6孔细胞板，置于37℃、5％c02培养箱培养，4h后弃去未贴壁细胞，用无菌PBS清洗细胞表面，置于37℃5％C02继续培养24h后以备接种病毒。2．2PCV2和PPV混合感染肺泡巨噬细胞实验设计将生长于6；fL细胞板上的肺泡巨噬细胞分为4组，分别为PCV2单独感染组、PPV单独感染组、PCV2与PPV混合感染组和空白对照组，每组3个重复孔。按照感染复数M．O．I．=0．1接种病毒，空白对照组接种等体积细胞培养液；吸附1h，每隔20rain摇动一次，之后用PBS沈涤2次，每孔加入1mL含有2％FBS的RPMI1640细胞培养液，分别于感染后12h、24h、36h、48h、60h署H72h取上清和细胞混合液，利用real—timePCR法检测混合感染后PPV和PCV2病毒核酸拷贝数，分别于感染后12h、24h、36h、48h、60h和72h在细胞板上用问接免疫荧光技术检测PCV2抗原阳性率以及分别于感染后12h、24h、36h、48h、60h和72h取细胞用real—timePCR法检测细胞因子mRNA表达水平。2．3PCV2和PPV在肺泡巨噬细胞中病毒核酸拷贝数的检测将收取的感染后不同时问的细胞和上清混合液，反复冻融3次后，提取病毒DNA待检，DNA提取方法按照试剂盒说明书提取。以提取的病毒DNA为模板(每个样品3个重复：fL)J趟Treal．timePCR，利用第一章建立的PCV2并flPPV标准曲线计算病毒核酸拷贝数。2．4PCV2和PPV混合感染PAM后PCV2IFA检测在感染后48h，将细胞板上的细胞用80％丙酮固定，参照第一章测定PCV2TCIDso方法做间接免疫荧光实验，每组设立3个重复孔，计数PCV2单独感染组和PCV2与PPV混合感染组PCV2荧光数。 万方数据猪圆环病毒2型和猪细小病毒体外混合感染致病机制的研究2．5细胞因子IFN-y，n虾．u，IL一10和13-actinmRNA的real—timePCR检测参照第一章细胞因子总RNA提取步骤提取各组肺泡巨噬细胞的总RNA，以第一章所述方法进行RT—PCR反应，以建立的real．timePCR检测方法计算IFN-y，TNF一值，IL一10和13一actin基因mRNA的拷贝浓度。2．6数据分析每个样品设立3个重复，使用Excel根据通用的2一△△‘方法(△△仁(检测样品目的基因ct值一检测样品内参基NCt值)一(参照样品目的基INCt值一参照样品内参基l天lCt值)，分析细胞因子不同时In-]12hpi、24hpi、36hpi、48hpi、60hpi、72hpi各样品的表达量。3结果与分析3．1病毒感染PAM后病毒核酸拷贝数的变化本实验利用real．timePCR方法检钡UPCV2单独感染，PPV单独感染和PCV2与PPV混合感染肺泡巨噬细胞后在12hpi、24hpi、36hpi、48hpi、60hpi和72hpi两种病毒核酸拷贝数的变化。根据图4—1的检测结果显示，PCV2单独感染组与PCV2与PPV混合感染组相比，在整个实验过程中PCV2与PPV混合感染组PCV2病毒核酸拷贝数都高于PCV2单独感染组l一2倍。根据图4．2的检测结果显示，PPV单独感染组与PCV2与PPV混合感染组相比，混合感染组PPV核酸拷贝数在48hpi后显著上升，并在60hpi、72hpi高于PPV单独感染组8倍。 万方数据第四章PCV2与PPV混合感染对原代PAM的影响6籁蒸5匡c錾4蜒3O12243648607284时间h图4一lPCV2单独感染组、PCV2与PPV混合感染组不同时间PCV2病毒核酸拷贝数的变化Fig．4—1PCV2viralnucleicacidcopynumbersofdifferenttimewithPCV2group，PCV2andPPVcoinfectiongroup6耧羹5叵(蓉4辎qO12243648607284时间h图4—2PPV单独感染组、PCV2与PPV混合感染组不同时l'a-]ppv病毒核酸拷贝数的变化Fig．4-2PPVviralnucleicacidcopynumbersofdifferenttimewithPPVgroup，PCV2andPPVcoinfectiongroup3．2病毒感染PAM后PCV2IFA检测病毒感染PAM细胞后，取48hpi样品，IFA检测结果如图4—3所示：48hpil舌m，PCV2单独感染组和PCV2与PPV混合感染组中PCv2阳性感染率均可达90％左右，且病毒抗原主要呈点状散在分布在细胞胞浆内，空白对照组无荧光信号。48hpi计数荧光数表4—1，PCV2与PPV混合感染组LgPCV2单独感染组荧光数高1．46倍，与核酸拷贝数结果相符。53 万方数据猪圆环病毒2型和猪细小病毒体外混合感染致病机制的研究400xPCV2感染组400xPCV2与PPV混合感染组400x对照组图4-3病毒感染48hpiIFA检测结果Fig．40PCV2fluorescentnumberofPCV2groupandPCV2与PPVgroupat48hpi表4—148hpiPCV2荧光数对照组PCV2单独感染组PCV2与PPV混合感染组0130190013519301251873．3病毒感染PAM后细胞因子表达水平的变化3．3．1PAM细胞中IFN吖mRNA表达水平的变化病毒感染PAM后，收取12hpi、24hpi、36hpi、48hpi、60hpi和72hpi的PAM提取总RNA进行反转录，之后进行reM．timePCR检测，检测结果如图4—4，PPV单独感染组IFN吖mRNA表达水平在36hpi、48hpi并160hpi时高于对照组，其他时间低于对照组；PCV2单独感染组IFN-ymRNA表达水平在24hpi后上升，并高于对照组，在60hpi时达到最高峰，之后下降；在整个实验过程中，PCV2与PPV混合感染组IFN一^rmRNA的表达水平在36hpi、48hpi和60hpi显著低于PCV2和PPV单独感染组，并低于对照组水平。相比于对照组，PCV2或PPV单独感染后都能显著促进IFN吖mRNA的表达，PCV2促进作用最大。由此说明，PCV2和PPV单独感染能促进IFN吖mRNA的表达，PCV2和PPV混合感染可显著抑制IFN吖mRNA的表达。 万方数据第四章PCV2与PPV混合感染对原代PAM的影响蚓趔惴靛皿i七一122436486072感染后时间(h)图4．4病毒感染后PAMIFN-ymRNA相对表达量的变化Fig．4—4RelativeexpressionoflFN吖mRNAchangesofdifferenttimewithPCV2andPPVcoinfection3．3．2PAM细胞中TNF一0【mRNA表达水平的变化real—timePCR法测定各组PAM感染后不同时间TNF．0LmRNA表达水平变化。如图4．5结果显示，PCV2和PPV单独感染都可以引起TNF．0LmRNA的大量表达，并分别在36hpi和48hpi达到最高峰，之后PCV2单独感染组骤降而PPV单独感染组缓慢下降；36hpi前，PCV2单独感染组TNF一仅mRNA表达高于PPV单独感染组，48hpi后，PPV单独感染组TNF．amRNA表达高于PCV2单独感染组。PCV2与PPV混合感染引起TNF—ccmRNA的持续表达并在48hpi达到最高峰，之后下降，并在整个实验过程显著高于PCV2单独感染组和PPV单独感染组。由此说明，PCV2对感染前期作用显著，PPV对感染后期作用显著，PCV2与PPV混合感染共同促进了TNF一0【mRNA的大量表达。5352515032l0 万方数据猪圆环病毒2型和猪细小病毒体外混合感染致病机制的研究蚓趔懈靛血七122436486072感染后时间(h)口对照组园PPV单独感染组囵PCV2单独感染组团PCV2与PPV混合感染组图4．5PCV2与PPV混合感染不同时间TNF．amRNA$目对表达量的变化Fig．4-5RelativeexpressionofTNF-nmRNAchangesofdifferenttimewithPCV2andPPVcoinfection3．3．3PAM细胞中IL．10mRNA表达水平的变化real—timePCR法测定各组感染后不同时间IL．10mRNA表达水平变化。如图4—6结果显示，PPV单独感染组IL．10mRNA表达水平在36hpi时达到顶峰，之后缓慢下降。PCV2猪IL一10mRNA表达水平也在36hpi时最高，48hpi后明显下降；在48hpi时PPV单独感染组与PCV2单独感染组IL．10mRNA表达量差异显著，其它时间差异不显著。PCV2与PPV混合感染组IL．10mRNA表达量在36hpi和48hpi上调并明显高于PCV2和PPV单独感染组，其他时间差异不显著。由此说明，PCV2和PPV混合感染后能促进IL．10mRNA短暂表达。叫廿q趔懈莨罂2436感染后I4860¨刚(h)图4—6PCV2与PPV混合感染不同时间IL．10mRNA相对表达量的变化Fig．4—6RelativeexpressionofIL·l0mRNAchangesofdifferenttimewithPCV2andPPVcoinfection560864202086420 万方数据第四章PCV2与PPV混合感染对原代PAM的影响4讨论断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)是目前公认的由猪圆环病毒2型(pcv2)感染引起的一种消耗性疾病，是世界各地养猪行业较为关注的一种疾病，最为典型的一个临床症状就是进行性消瘦[61。大量实验研究表明，单独的PCV2感染只能引起轻微的的临床症状和损伤，但是PCV2与PPV混合感染能引起严重的消耗性疾病【7-9]。PCV2与PPV混合感染可复制出典型的PMWS症状，促进PCV2在体内的复制和分布[10】。然而，PPV可增强PCV2感染引起的PMWS的机制尚不清楚。KimJ等[71研究表明，PPV与PCV2混合感染猪肺泡巨噬细胞能产生较高的TNF一0【，而两种病毒单独感染肺泡巨噬细胞产生的TNF一0【较低。Kai．ChuangShi等【lu的研究表明PCV2与其他病毒混合感染TNF—c【mRNA表达水平显著高于单独感染组。郭东辉等”21研究同样也表明pcv2与PPV体外混合感染PBMCTNF．ⅡmRNA转录水平明显高于PPV单独感染组，与PCV2单独感染组差异不显著。刘祥义等【l副研究表明，PCV2与PPV混合感染后7和14DPI，PPV单独感染组、PCV2单独感染组和PCV2与PPV混合感染组PAM表达IFN一^，mRNA水平均低于对照组，3和35DPI后，单独感染组IFN-?mRNA表达水平上调，高于对照组，PCV2与PPV混合感染组IFN—YmRNA表达水平显著低于对照组。Kai．ChuangShi等【ll】的研究也有相似的结果。L．Darwich等【14l研究表明，亚临床感染PCV2的猪能引起短暂的IL—lO的过量表达。LailaDarwich等[15】研究表明患有PMWS的猪胸腺中IL—10的表达量明显高于为患病猪，而且在不同组织中IL一10的表达量也明显不同。PCV2自身缺乏DNA聚合酶，因此其复制需要依赖宿主细胞中的聚合酶。D．F．Gilpin等13J研究证明PCV2在PAM中不能复制。本研究中，发现PCV2与PPV混合感染PAM细胞后，PCV2病毒核酸拷贝数高于PCV2单独感染组，但差异不显著，说明PPV能促进PCV2吸附感染PAM细胞，对PCV2的复制无显著影响。除此之外，PCV2与PPV混合感染后PPV病毒核酸拷贝数在60hpi后明显高于PPV单独感染组，而在感染前期低于PPV单独感染组。这与文献中报道的PCV2的感染能有助于PPV感染PAM，并能促进PPV在PAM中增殖相一致。IFN-Y作为主要的THl细胞因子，在免疫反应中主要发挥免疫调节的功能。IFN-?强大的抗病毒特性有助于急性感染的控制，是重要的细胞介导反应。本研究中PCV2与PPV混合感染PAM后，IFN．丫表达量明显降低，而单独感染组IFN。Y表达量上调，说明PCV2与PPV混合感染后抑制了IFN吖的表达，促进了病毒的持续感染，延迟了病毒的清除；Meerts-等[16J报道指出IFN吖能增强Pcv2的感染和复制能力，而PCV2单独感染组矛HPPV单独感染组IFN叫的表达上调，说明PCV2单独 万方数据猪圆环病毒2型和猪细小病毒体外混合感染致病机制的研究感染可能引起较高的病毒血症。TNF．值主要由活化的单核．巨噬细胞产生，主要参与机体的防御反应，是机体重要的促炎症因子和免疫调节分子，它与发热、多器官功能衰竭、恶病质等严重病理过程有关。本研究中PCV2与PPV混合感染PAM后，TNF．Q表达量明显上升，在48hpi时达到项峰，并在感染12hpi后明显高于其他组，说明PCV2与PPV混合感染相互促进引起的TNF．Ot的过量表达，而KimJ等【7】研究推测PMWS的病理损伤(淋巴细胞缺失、淋巴组织的巨噬细胞浸润及肉芽肿性炎症)与TNF一0【的过量表达有关，由此推测，本实验中PCV2与PPV混合感染组TNF．Ot的显著表达能促进机体的炎症反应的发生及淋巴细胞缺失，PCV2单独感染组与PPV单独感染组TNF一0t表达低于PCV2与PPV混合感染组但高于对照组，说明PCV2单独感染或PPV单独感染也能引起不同程度的炎症反应。IL．10能抑制巨噬细胞，抑$lJThl细胞分泌细胞因子，具有有效的免疫抑制性质，能抑制免疫应答。IL一10能显著抑制T细胞表达IFN．T弄I]TNF一Ⅱ117J。Kekarainen等[18J的报道称PCV2诱导产生的IL一10通过抑制IFN、丫，IFN-0c和IL一12的产生参与记忆性抗原反应的下调，同时Darwich等【14]研究证明PCV2亚临床感染后IL．10短暂上调与病毒血症相关，基于以上研究，本研究中PCV2与PPV混合感染组在36hpi和48hpi时IL．10表达量明显上调，PCV2、PPV单独感染组及对照组IL—10表达没有明显变化，说明此时PCV2与PPV混合感染通过抑制保护性免疫反应，以提高病毒的存活率，而PCV2和PPV单独感染组细胞抑制作用并不明显，此结果与IFN—Y的表达相符。 万方数据第四章PCV2与PPV混合感染对原代PAM的影响参考文献【1】AllanGM，EllisJA．Porcinecircoviruses：areview[J]．JournalofVeterinaryDiagnosticInvestigation2000；12(1)：3—14【2】OstanelloF，CapdoliA，DiFrancescoA，eta1．Experimentalinfectionof3-week—oldconventionalcolostrum-fedpigswithporcinecircovirustype2andporcineparvovirus[J]．Veterinarymicrobiology2005；108(3)：179-86【3】GilpinD，McCulloughK，MeehanB，eta1．Invitrostudiesontheinfectionandreplicationofporcinecircovirustype2incellsoftheporcineimmunesystem[J]．Veterinaryimmunologyandimmunopathology2003；94(3)：149—6l[4】RosellC，SegaldsJ，Plana—DuranJ，eta1．Pathological，immunohistochemical，andin·situhybridizationstudiesofnaturalcasesofpostweaningmultisystemicwastingsyndrome(PMWS)inpigs[J]．Journalofcomparativepathology1999；120(I)：59—78[5】KimJ，ChoiC，ChaeC．PathogenesisofpostweaningmultisystemicwastingsyndromereproducedbyCO—infectionwithKoreanisolatesofporcinecircovirus2andporcineparvovirus[J]．Journalofcomparativepathology2003；128(1)：52·9[6】ChaeC．Postweaningmultisystemicwastingsyndrome：areviewofaetiology,diagnosisandpathology[J]．TheVeterinaryJournal2004；168(1)：41—9[7】KimJ，HaYChaeC．Potentiationofporcinecircovirus2-inducedpostweaningmultisystemicwastingsyndromebyporcineparvovirusisassociatedwithexcessiveproductionoftumornecrosisfactor-a[J]．VeterinaryPathologyOnline2006；43(5)：718—25【8]KennedyS，MoffettD，McNeillyF’eta1．Reproductionoflesionsofpostweaningmultisystemicwastingsyndromebyinfectionofconventionalpigswithporcinecircovirustype2aloneorincombinationwithporcineparvovirus[J]．Journalofcomparativepathology2000；122(I)：9—24[9】MagarR，LarochelleRThibaultS，eta1．Experimentaltransmissionofporcinecircovirustype2(PCV2)inweanedpigs：asequentialstudy[J]．Journalofcomparativepathology2000；123(4)：258—69【10】ChaeC．Areviewofporcinecircovirus2-associatedsyndromesanddiseases[J]．TheVeterinaryJournal2005；169(3)：326—36【11】ShiK-C，GuoX，GeX—N，eta1．CytokinemRNAexpressionprofilesinperipheralbloodmononuclearcellsfrompigletsexperimentallyCO—infectedwithporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusandporcinecircovirustype2[JJ．Veterinarymicrobiology2010；140(1)：155—60[121郭东辉，张莉娟，李金磊，等．PCV2与PPV共感染猪外周血单个核细胞对其细胞凋亡相关因子表达水平的影响[JJ．畜牧兽医学报2013；44(1)：71，759 万方数据猪圆环病毒2型和猪细小病毒体外混合感染致病机制的研究【13】刘祥义．猪圆环病毒2型和细小病毒共感染对猪肺泡巨噬细胞免疫功能的影响【J】．河北农业大学：2010【14】DarwichL，SegalesJ，ResendesA，eta1．TransientcorrelationbetweenviremialevelsandIL一10expressioninpigssubclinicallyinfectedwithporcinecircovirustype2(PCV2)【J】．Researchinveterinaryscience2008；84(2)：194—8f15】DarwichL，Pi6S，RoviraA，eta1．CytokinemRNAexpressionprofilesinlymphoidtissuesofpigsnaturallyaffectedbypostweaningmultisystemicwastingsyndrome[J]．JournalofGeneralVirology2003；84(8)：217—25【16]MeertsP，MisinzoGNauwynckHJ．Enhancementofporcinecircovirus2replicationinporcinecelllinesbyIFN—VbeforeandaftertreatmentandbyIFN-aaftertreatment[J]．Journalofinterferon&cytokineresearch2005；25(11)：684—93[17】CharerntantanakulW'PlattR，RothJA．Effectsofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus．．infectedantigen-presentingcellsonTcellactivationandantiviratcytokineproduction[J]．Viralimmunology2006；19(4)：646-6l【181KekarainenT，MontoyaM，MateuE，eta1．Porcinecircovirustype2-inducedinterleukin一10modulatesrecallantigenresponses[J]．Journalofgeneralvirology2008；89(3)：760·5 万方数据第四章PCV2与PPV混合感染对原代PAM的影响THEIMPACToFPCV2ANDPPVCOINFECTIONoNPRIMARYPAMABSTRACT：Inthisstudy，itwasdetecttheviralnucleicacidscopynumberofPCV2andPPV，themRNAexpressionofIFN．Y，TNF-c【andIL一10atdifferenttimeafterPCV2andPPVcoinfection，andtheeffectsontheimmuneresponseofcellsbyPCV2andPPVcoinfecfionwasanalyzed．ThePAMisdividedintofourgroups：PPVinfectionalone，PCV2infectionalone，PCV2andPPVcoinfectionandcontr01．At12hpi，24hpi，36hpi，48hpi，60hpiand72hpitheviralDNAandtotalRNAofthePAMWasextracted．TheviralnucleicacidscopynumberandIFN吖，TNF—c￡andIL．10mRNAexpressiondynamicchangesweredetectedbyreal—timePCR．Theresultsshowedthat，afterPCV2andPPVcoinfections，PCV2andPPVgroupPCV2viralnucleicacidcopynumberwerehigherthanPCV2group，andinPCV2andPPVgroup，thePPVvirusnucleicacidcopynumberwassignificantlyhigherthanPPVgroupafter60hpi；TheexpressionlevelsofIFN-丫mRNAwereraisedinPCV2groupandPPVgroup，theexpressionlevelsofIFN—YmRNAweredowrtregulmedinPCV2andPPVgroup；TheviralinfectionCancausetheexpressionlevelsofTNF一0【mRNAraised，before36hpi，PCV2infectionplaysamajorrole，andPPVinfectionplaysamajorroleafter48hpi，theexpressionlevelsofTNF-amRNAinPCV2andPPVgroupweresignificantlyhigherthansingleinfectedgroup．At24hpiand36hpi，thePCV2andPPVinfectionaloneCancausetheexpressionlevelsoflL一10mRNAraised，PCV2andPPVcoinfectioncausetheexpressionlevelsofIL一10mRNAsignificantlyupregulated，theothertimeswerenotsignificant．KEYWORD：porcinecircovirustype2；porcineparvovirus；cytokines；real—timePCR；mRNA6l 万方数据 万方数据第五章PCV2与PPV混合感染对3D4／21细胞的影响摘要：本研究通过PCV2和PPV混合感染3D4／21细胞后，检测感染后不同时间PCV2和PPV病毒核酸拷贝数及IFN-y，TNF．。【，IL一10mRNA表达的动态变化，分析PCV2和PPV混合感染对细胞免疫反应的影响。将3D4／21细胞分为4组：PPV单独感染组、PCV2单独感染组、PCV2与PPV混合感染组、对照组。在接种病毒12h、24h、36h、48h、60h、72h各时间点提取病毒DNA及3D4／21细胞总RNA。用已经建立的real．timePCR法检测各组中病毒核酸拷贝数及IFN．Y、TNF．n、IL．10mRNA表达的动态变化。结果显示，PCV2和PPV混合感染后，PCV2与PPV单独感染组PCV2病毒核酸拷贝数和PPV病毒核酸拷贝数分别于36hpi和24hpi高于单独感染组；PPV单独感染组IFN一^，mRNA表达水平高于PCV2单独感染组IFN-ymRNA表达水平，PCV2与PPV单独感染组IFN．YmRNA表达水平在12hpi时高于PCV2单独感染组，24hpi后低于对照组及单独感染组；PPV单独感染组’INF．旺mRNA表达水平在24hpi后上调，PCV2单独感染组TNF一0【mRNA表达水平在24hpi后上调，在48hpi后高于PPV单独感染组，PCV2与PPV单独感染组TNF一0【mRNA表达水平在36hpi后上调，并明显高于单独感染组；PCV2单独感染组IL．10mRNA表达水平在24hpi及48hpi后轻微上调，PPV单独感染组对IL．10mRNA表达水平没有影响，PCV2与PPV单独感染组IL．10mRNA表达水平在24hpi后显著上调，48hpi达到高峰。关键词：猪圆环病毒2型、猪细小病毒、细胞因子、实时荧光定量PCR、信使RNA由猪细小病毒(porcineparvovirus，PPV)和猪圆环病毒2型(porcinecircovirustype2，Pcv2)弓l起的疾病严重危害我国养猪业。PPV可引起初产母猪产出死胎，畸形胎，木乃伊胎，流产及病弱仔猪。PCV2可引起断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)，皮炎和肾病综合症(PDNS)，增殖性坏死性间质性肺炎和繁殖障碍【l钏。PMWS通常影响5．12周龄的仔猪，典型的临床症状包括进行性消瘦、呼吸困难和淋巴结肿大，较少见的症状包括皮肤苍白、黄疸和腹泻。尸检可看到淋巴组织、脾脏、肝脏、肾脏、肺脏和小肠损伤I川。在试验条件下猪细小病毒(PPV)已被广泛应用于PMWS的发病模型Ⅳ71，并且PCV2和PPV有共同的靶细胞[8，91。本实验应用自己建立的检测方法检测PCV2与PPV混合感染传代单核巨噬细胞3D4／21后，PCV2和PPV病毒核酸拷贝数和细胞因子IFN一％TNF—Q和IL一10mRNA表达动态变化，与原代PAM细胞相比，以阐明PCV2与PPV混合感染的63 万方数据猪圆环病毒2型和猪细小病毒体外混合感染致病机制的研究致病机制。1材料1．1病毒与细胞猪圆环病毒2型NJ株(PCV2-NJ株)由本实验室分离并保存(105·亩rCID50／mL)，猪细小病毒NJ株(PPV-NJ株)由本实验室分离并保存(107TCID50／mL)。3D4／21细胞由本实验室保存。1．2主要试剂RPMI1640培养液、胰蛋白酶购GIBCO公司；青霉素、链霉素购自哈药集团制药总厂；胎牛血清(FBS)购自浙江天杭生物科技有限公司；病毒DNA提取试剂盒购自美国OMEGA公司，PrimeScriptTMReverseTranscriptase、Oligod(T)15Primer、dNTPMixture、RNaseInhibitor、SYBRPremixEXTaqⅢ、购自宝生物(大连)生物技术公司(TAKARA)。1．3主要仪器AIRTECH超净工作台、lightcycler480实时荧光定量PCR仪和实时荧光定量PCR加样板购自Roche公司、eppendor微量移液器、倒置荧光显微镜(zeiss4．7)购自德国zeiss公司、C02恒温培养箱购自美国Thermo公司。2方法2．1PCV2和PPV混合感染3D4／21细胞实验设计将3D4／21细胞铺于6孔细胞板上，分为4组，分别为PCV2单独感染组、PPV单独感染组、PCV2与PPV混合感染组和空白对照组，每组3个重复孔。按照感染复数M．O．I．=0．1接种病毒，空白对照组接种等体积细胞培养液。吸附1h，每隔20rain摇动一次，之后用PBS洗涤2次，每孔加入1mL含有2％FBS的1640细胞培养液，分别于感染12hpi、24hpi、36hpi、48hpi、60hpi并U72hpi分别取上清和细胞，利用real．timePCR法检测混合感染后PPV；flIPCV2病毒核酸拷贝数，分别于感染后12h、24h、36h、48h、60h和72h在细胞板上用间接免疫荧光技术检狈qPCV2抗原阳性率以及分别于感染后12h、24h、36h、48h、60hIU72h取细胞用real—timePCR法检测细胞因子mRNA表达水平。 万方数据第五章PCV2与PPV混合感染对3D4，21细胞的影响2．2PCV2和PPV在3D4／21细胞中病毒核酸拷贝数的检测方法同第四章2．3。2．3PCV2和PPV混合感染PAM后PCV2IFA检测方法同第四章2．4。2．4细胞因子TNF．Ⅱ，IFN-，l,，IL一10和13-actinmRNA的real—timePCR检测方法同第四章2．5。2．5数据分析每个样品设立3个重复，使用EXcel根据通用的2．△△‘方法(△△产(检测样品目的基因Ct值一检测样品内参基因Ct值)一(参照样品目的基因Ct值一参照样品内参基因Ct值)，分析细胞因子不同时间12hpi、24hpi、36hpi、48hpi、60hpi、72hpi各样品的表达量。3结果与分析3．1病毒感染3D4／21细胞后病毒核酸拷贝数的动态变化本实验利用real—timePCR法检i贝ljPCV2和PPV混合感染3D4／21细胞在12hpi、24hpi、36hpi、48hpi、60hpi和72hpi两种病毒核酸拷贝数的变化。根据图5—1的检测结果显示，PCV2单独感染组，PCV一2与PPV混合感染组相比，在36hpi后，PCV2与PPV混合感染组PCV2核酸拷贝数明显高于PCV2单独感染组3—6倍。PPV单独感染组与PCV2与PPV混合感染组相比，PCV2与PPV混合感染组PPV核酸拷贝数在24hpi后显著上升，并在24hpi后高于PPV单独感染组7一10倍。65 万方数据堕堕墅堑耋!型塑堑塑尘堕墨竺丛塑盒壁鎏塾壅塑型竺堑壅65．554．543．53O12243648607284时间(h)图5-1PCV2与PPV混合感染不同时间PCV2病毒核酸拷贝数的变化Fig．5—1PCV2viralnucleicacidcopynumbersofdifferenttimewithPCV2andPPVcoinfection籁莨籁E<鞑甾辎73012243648607284时间(h)图5—2PCV2与PPV混合感染不同时间PPV病毒核酸拷贝数的变化Fig．5—2PPVviralnucleicacidcopynumbersofdifferenttimewithPCV2andPPVcoinfection3．2病毒感染3D4／21后PCV2IFA检测400×400x400xPCV2单独感染组PCV2与PPV混合感染组对照组图5—348hpi，PCV2单独感染组与PCV2与PPV单独感染2_．flPCV2荧光数Fig．5—3PCV2fluorescentnumberofPCV2groupandPCV2与PPVgroupat48hpiPCV2与PPV混合感染3D4／21细胞后，取48hpi样品，IFA检测结果如图5—3：暴茛暴H盐攀甾辎 万方数据第五章PCV2与PPV混合感染对3D4／21细胞的影响48hpi后，PCV2单独感染组和PCv2与PPV混合感染组#pcv2m性感染率明显低于PAM细胞。48hpi计数荧光数表5-l，PCV2与PPV混合感染组比PCV2单独感染组荧光数高3．16倍，与病毒核酸拷贝数结果相符。表5-148hpiPCV2荧光数对照组PCV2单独感染组PCV2与PPV混合感染组0247502270025793．3病毒感染3D4／21后细胞因子表达水平的变化3．3．13D4／21细胞中IFN-7mRNA表达水平的变化根据图5—4结果显示，PPV单独感染组IFN-YmRNA表达水平在12hpi后缓慢上升，到48hpi时达到最高，之后缓慢下降；PCV2单独感染组IFN．1，mRNA表达水平在24hpi后缓慢上升，并在36hpi达到最高，之后缓慢下降；PPV单独感染组IFN—vmRNA在整个实验过程中明显高于PCV2单独感染组：而PCV2与PPV混合感染组在12hpi高于PCV2单独感染组，但在24hpi后明显低于PCV2单独感染组和PPV单独感染组，并显著低于对照组。10皿鲫8蚓6懈靛4rrrr长20122436486072时间(h)图5—4PCV2与PPV混合感染不同时间lFN．丫mRNA相对表达量的变化Fig．5-4RelativeexpressionoflFN-7mRNAchangesofdifferenttimewithPCV2andPPVcoinfection3．3．23D4／21细胞中TNF—amRNA表达水平的变化根据图5-5结果显示，PPV单独感染组组TNF—qmRNA表达水平在24hpi后高了二对照组，并持续不变：PCV2单独感染组TNF一ⅡmRNA表达水平在24hpi后也明67 万方数据猪圆环病毒2型和猪细小病毒体外混合感染致病机制的研究显高于对照组，并在48hpi后明显高于PCV2单独感染组；在36hpi后，PCV2与PPV混合感染组TNF．12,mRNA表达水平显著上升并明显高于其他感染组，且差异极显著。由此说明，PCV2和PPV单独感染都可引起TNF—nmRNA表达量的上升，但PCV2与PPV混合感染在感染后期能显著上调TNF．ⅡmRNA的表达。10080删趔60悄靛40血*200122436486072时间(h)口对照组囵PPV单独感染组囵PCV2单独感染组口PCV2／PPV混合感染组图5—5PCV2与PPV混合感染不同时间TNF．ⅡmRNA{=fl对表达量的变化Fig．5-5RelativeexpressionofTNF-cLmRNAchangesofdifferenttimewithPCV2andPPVcoinfection3．3．33D4／21细胞中IL．10mRNA表达水平的变化根据图5．6结果显示，在整个实验过程中，PPV单独感染组不能引起IL—lOmRNA表达水平的显著变化，PCV2单独感染能引起IL一10mRNA的表达轻微上调，PcV2与PPV混合感染在24hpi后使IL一10mRNA表达水平上升，在48hpiJ盘到最高，之后下降，并明显高于其他感染组及对照组。34删趔3帐：靛2皿*10122436486072时间(h)口对照组因PPV单独感染组圈PCV2单独感染组口PCV2与PPV混合感染组图5-6PCV2与PPV混合感染不同时间IL一10mRNA相对表达量的变化Fig．5．6RelativeexpressionoflL一10mRNAchangesofdifferenttimewithPCV2andPPVcoinfection 万方数据第五章PCV2与PPV混合感染对3D4／21细胞的影响4讨论大量研究表明，PCV2能在PMWS患病猪中存在，并与PMWS的显微病变有关，但PCV2单独感染不产生临床症状或轻微的组织病理病变[10-12],但当PCV2与PPV、PRRSV或其他病毒混合感染能促进PCV2的复制和传播，并导致临床疾病和更为严重的组织病理学病变[13，14l。目前，PMWS被看作是一种多因素疾病，PCV2的感染对PMWS的发病是必要的。S．Krakowka等【15】研究发现PCV2与PPV混合感染组比PCV2单独感染组有更为严重的PMWS临床症状和显微炎症病变。T．Opriessnig等【№J研究表明，PCV2与PPV混合感染与PCV2单独感染相比，混合感染组PCV2病毒核酸拷贝数明显高于单独感染组，混合感染组宏观和显微损伤也明显比单独感染组严重，并且PPV的免疫能增加PCV2核酸拷贝数和损伤的严重程度。本研究中通过PCV2与PPV混合感染3D4／21细胞利用real—timePCR法和IFA法对PCV2抗原进行检测，结果显示，混合感染24h后，PCV2与PPV混合感染组PCV2和PPV病毒核酸拷贝数都明显上升，并分别在36hpi、24hpi明显高于单独感染组，IFA结果显示，在48hpi，PCV／PPV混合感染组PCV2抗原阳性率明显高于PCV2单独感染组，并与real．timePCR结果相符，说明PCV2和PPV病毒能相互促进其复制，这与先前的研究结果相符。同时，本研究中利用real—timePCR法对PCV2与PPV混合感染3D4／21细胞不同时间IFN．扒TNF—Q、IL．10mRNA表达水平进行检测。PCV2与PPV混合感染3D4／21细胞后，对3种细胞因子mRNA的表达均有明显影响。有学者研究表明，PMWS患病动物体内细胞因子表达水平因组织器官不同表达量不同。LailaDarwich[19]掣"J研究表明，PMWS患病猪胸腺、腹股沟淋巴结、支气管淋巴结中IFN吖表达量下调，而脾脏和扁桃体中IFN吖表达量却上调。胸腺和扁桃体中IL．10表达上调，而脾脏、腹股沟淋巴结、支气管淋巴结中IL．10下调。IFN吖属于调节细胞因子，在维持机体体液免疫与细胞免疫平衡中发挥着重要的作用，本研究中PCV2与PPV混合感染组IFN吖mRNA表达下调，而PCV2、PPV单独感染组IFN-?mRNA表达上调，说明混合感染组免疫受到抑制，而PCV2或PPV促进了机体的免疫应答。同时，IL一10是具有多向性生物学活性的免疫抑制因子，能抑制THl细胞分泌细胞因子，PCV2与PPV混合感染组IL一10的大量表达，PCV2、PPV单独感染组IL一10表达水平没有变化，推测IL一10的表达抑制了IFN．v的表达，引起细胞免疫调节功能下降，从而造成免疫应答紊乱。TNF．0【作为主要的促炎细胞因子，与炎症的发生密切相关。PCV2与PPV混合感染组在36hpi69 万方数据猪圆环病毒2型和猪细小病毒体外混合感染致病机制的研究后，TNF—cc表达上调，并明显高于其他组，PCV2和PPV单独感染组TNF—amRNA轻微上调，可能是PMWS患病猪多灶性肉芽肿性炎症的一个主要原因。在J．Kim等[q的研究中支持这一推测。70 万方数据第五章PCV2与PPV混合感染对3D4t21细胞的影响参考文献[1】王先炜，姜平，李玉峰，等．华东地区PMWS患病猪群PCV-2的检测及其基因特征【J】．中国兽医学报2004；24(3)：240-2【2】HamelAL，LinLL，NayarGP．Nucleotidesequenceofporcineckcovirusassociatedwithpostweaningmultisystemicwastingsyndromeinpigs[J]．JVirol1998Jun；72(6)：5262-7【3】McNeillyF，McNairI，O’ConnorM，eta1．Evaluationofaporcinecircovirustype2-specificantigen-captureenzyme-linkedimmunosorbentassayforthediagnosisofpostweaningmultisystemicwastingsyndromeinpigs：comparisonwithvirusisolation，immunohistochemistry,andthepolymerasechainreaction[J]．Journalofveterinarydiagnosticinvestigation2002；14(2)：106-12【4】MeehanB，McNeillyF’McNairI，eta1．Isolationandcharacterizationofporcinecircovirus2fromCasesofSOWabortionandporcinedermatitisandnephropathysyndrome[J]．Archivesofvirology2001；146(4)：835-42[5】ChaeC．Postweaningmultisystemicwastingsyndrome：areviewofaetiology,diagnosisandpathology[J]．TheVeterinaryJournal2004；168(1)：41-9【6】KimJ，HaY’ChaeC．Potentiationofporcinecircovirus2-inducedpostweaningmultisystemicwastingsyndromebyporcineparvovirusisassociatedwithexcessiveproductionoftumornecrosisfactor-tl[J]．VeterinaryPathologyOnline2006；43(5)：718-25【7】KennedyS，MoffettD，McNeillyF，eta1．Reproductionoflesionsofpostweaningmultisystemicwastingsyndromebyinfectionofconventionalpigswithporcinecircovirustype2aloneorincombinationwithporcineparvovirus[J]．Journalofcomparativepathology2000；122(1)：9—24[8】ChoiC，ChaeC．Distributionofporcineparvovirusinporcinecircovirus2-infectedpigswithpostweaningmultisystemicwastingsyndromeasshownbyin-situhybridization[J]．Journalofcomparativepathology2000；123(4)：302—5【9】GilpinD，McCulloughK，MeehanB，eta1．Invitrostudiesontheinfectionandreplicationofporcinecircovirustype2incellsoftheporcineimmunesystem[J]．Veterinaryimmunologyandimmtmopathology2003；94(3)：149—61[10】OstanelloF，CaprioliA，DiFrancescoA，eta1．Experimentalinfectionof3一week—oldconventionalcolostrum。fedpigswithporcinecircovirustype2andporcineparvovirus[J]．Veterinarymicrobiology2005；108(3)：179—86【11】AllanGKennedyS，McNeillyF，eta1．ExperimentalreproductionofseverewastingdiseasebyCO。infectionofpigswithporcinecircovirusandporcineparvovirus[J1．Journalofcomparativepathology1999；12l(1)：1-1171 万方数据猪圆环病毒2型和猪细小病毒体外混合感染致病机制的研究【12】MagarRLarochelle1LThibaultS，eta1．Experimentaltransmissionofporcinecircovirustype2(PCV2)inweanedpigs：asequentialstudy[J]．Journalofcomparativepathology2000；123r4)：258—69【13]HarmsP’SordenS，HalburP，eta1．ExperimentalreproductionofseverediseaseinCD／CDpigsconcurrentlyinfectedwithtype2porcinecircovirusandporcinereproductiveandrespiratorysyndromeVilalS[J]．VeterinaryPathologyOnline2001；38(5)：528—39[14】RoviraA，BalaschM，Segal6sJ，eta1．Experimentalinoculationofconventionalpigswithporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusandporcinecircovirus2【J】．Journalofvirology2002；76(7)：3232-9【15】KrakowkaS，EllisJ，MeehanB，eta1．Viralwastingsyndromeofswine：experimentalreproductionofpostweaningmultisystemicwastingsyndromeingnotobioticswinebycoinfectionwithporcinecircovirus2andporcineparvovirus[J]．VeterinaryPathologyOnline2000；37(3)：254-63[16】OpriessnigT，FenauxM，YuS，eta1．EffectofporcineparvovirusvaccinationonthedevelopmentofPMWSinsegregatedearlyweanedpigscoinfectedwithtype2porcinecircovirusandporcineparvovirus[J]．Veterinarymicrobiology2004；98(3)：209—20[171DarwichL，Pi6S，RoviraA，eta1．CytokinemRNAexpressionprofilesinlymphoidtissuesofpigsnaturallyaffectedbypostweaningmultisystemicwastingsyndrome[J]．JournalofGeneralVirology2003；84(8)：2117·2572 万方数据第五章PCV2与PPV混合感染对3D4121细胞的影响THEIMPACToFPCV2ANDPPVCoINFECTIoNoN3D4121ABSTRACT：Inthisstudy，itWaSdetecttheviralnucleicacidscopynumberofPCV2andPPVthemRNAexpressionofIFN一1，，TNF—QandIL—10atdifferenttimeafterPCV2andPPVcoinfection，andtheeffectsontheilTllnuneresponseofcellsbyPCV2andPPVcoinfectionwasanalyzed．The3D4／21isdividedintofourgroups：PPVinfectionalone，PCV2infectionalone，PCV2andPPVeoinfeetionandcontr01．At12hpi，24hpi，36hpi，48hpi，60hpiand72hpitheviralDNAandtotalRNAofthe3D4／21wasextracted．TheviralnucleicacidscopynumberandIFN一％TNF—aandIL一10mRNAexpressiondynamicchangesweredetectedbyreal—timePCR．Theresultsshowedthat，thePCV2viralnucleicacidcopynumbersat36hpiandthePPVviralnucleicacidcopynumbersat24hpiinPCV2andPPVgroupwerehigherthansinglyinfectedgroup．TheexpressionlevelsofIFN-丫mRNAinPPVgroupwerehigherthantheexpressionlevelsofIFN—YmRNAinPCV2group，theexpressionlevelsofIFN-7mRNAinPCV2andPPVgroupwerehigherthanPCV2groupat12hpi，andthenafter24hpi，werelowerthancontrolgroupandsinglyinfectionedgroup．TheexpressionlevelsofTNF一伍mRNAinPPVgroupwereraised，theexpressionlevelsofTNF一0【mRNAinPCV2groupwereraised，andwerehigherthanPPVgroupafter48hpi．theexpressionlevelsofTNF一0【mRNAinPCV2andPPVgroupwereraisedafter36hpi，andweresignificantlyhigherthansinglyinfeetionedgroup．TheexpressionlevelsofIL一10mRNAwereslightraisedat24hpiandafter48hpiinPCV2group，PPVinfectionhasnoeffectontheexpressionlevelsofIL一10mRNA，theexpressionlevelsofIL一10mRNAinPCV2andPPVgroupweresignificantlyupregulatedafter24hpi，andpeakedat48hpi．KEYWORD：porcinecircovirustype2；porcineparvovirus；cytokines；real—timePCR；mRNA 万方数据 万方数据全文总结1．建立了检测PCV2、PPVDNA和IFN-y，TNF一0c，IL一10，13-actinmRNA的real—timePCR方法。2．通过PCV2和PPV体外混合感染PAM和3D4／21细胞，利用real．timePCR法检测PCV2和PPV病毒核酸拷贝数，结果表明两种病毒可以相互促进复制，初步明确两种病毒具有协同作用。3．通过PCV2和PPV体外混合感染PAM和3D4／21细胞，利用real—timePCR法检测混合感染后不同时间细胞IFN．YmRNA表达水平动态分析，推测PCV2和PPV混合感染抑制了机体的抗病毒特性，导致了病毒的持续感染，延迟了病毒的清除，还需进一步做体内实验进行验证。4．通过PCV2和PPV体外混合感染PAM和3D4／21细胞，利用real。timePCR法检测混合感染后不同时间细胞TNF—ccmRNA表达水平动态分析，推测PCV2和PPV混合感染加重了机体局部的炎症反应，导致淋巴细胞缺失和巨噬细胞浸润，使机体免疫机能降低，还需进一步做体内实验进行验证。5．通过PCV2和PPV体外混合感染PAM和3D4／21细胞，利用real—timePCR法检测混合感染后不同时间细胞IL一10mRNA表达水平动态分析，推测PCV2和PPV混合感染导致严重的免疫抑制，不能有效清除体内病原，导致严重的临床症状，同时更容易发生继发感染，还需进一步做体内实验进行验证。 万方数据猪圆环病毒2型和猪细小病毒体外混合感染致病机制的研究76 万方数据致谢本研究是在我的导师杨德吉教授、张道华研究员的悉心指导下完成的。在课题的研究中，张老师、杨老师为我指点迷津，帮我开拓思路，对我精心点拨，给予我鼓励与支持。杨老师、张老师一丝不苟的工作作风，严谨的治学态度，踏踏实实的科研精神，开拓创新的科研思维是我终身学习的榜样。教育三载，受益终生，在此谨向恩师致以崇高的致敬与衷心的感谢!感谢国家兽用生物制品研究中心的侯继波、何家慧、王继春、陆吉虎老师对我的关心与指导，感谢郑其升、唐应华、卢宇、冯磊、李鹏程、华涛、王志盛、刘娅梅博士的对我实验上的帮助与悉心指导，感谢陈瑾、于晓明、徐海、邓碧华、张浩明、吕芳、吴培培、揭鸿英、张金秋、赵艳红、赵晓娟等师兄师姐的帮助。感谢师兄唐波、刘振兴，师姐张雪花、王海燕、常晨、乔绪稳在实验中给予的悉心指导和在生活上的关心，感谢我的同学柯肖、李盟、亓鲁、夏思敏、赵琛、高思佳、侯羽弄、高新菊、张杰、周闯、查国飞、赵晓云等在实验中的帮助，感谢师弟郝政林、、袱景军、冯贻波、周鑫、丁阳、战力，师妹刑少华、顾逸如、李娜、沈琪琦、杨伦、韩立秋、王帅、余珊珊、赵晨星、黄春娟、李双洁等的关心与帮助。感谢侯加法教授、夏继飞老师、姚大伟老师给我的教育与启迪。行文至此，我的这篇论文已接近尾声；岁月如梭，我三年研究生时光也即将敲响结束的钟声。离别在即，站在人生的又一个转折点上，心中难免思绪万干，一种感恩之情油然而生。生我者父母。感谢生我养我，含辛茹苦的父母。是你们，为我的学习创造了条件：是你们，一如既往的站在我的身后默默的支持着我。没有你们就不会有我的今天。谢谢你们，我的父亲母亲!最后，衷心地感谢在百忙之中评阅论文和参加答辩的各位专家、教授!
此文档下载收益归作者所有
