犬瘟热病毒的分离及主要蛋白基因序列分析

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1、IsolationofCanineDistemperVirusandtheGeneSequenceAnalysisofMainProteinsThe"submittedt01heslssUQingdaoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofAqronomy1一一MengPeipei(DepartmentofAgronomy)Supervisor：ShanHuQingdao．ChinaJune，2

2、012独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得青岛农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：年月日关于论文使用授权的说明本人完全了解青岛农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩

3、印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意青岛农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研究生签名：导师签名：时间：年月日时间：年月Et青岛农业大学硕士学位论文摘要犬瘟热病毒的分离及主要蛋白基因序列分析摘要犬瘟热(Caninedistemper,CD)的病原是犬瘟热病毒(CaninedistempervirusCDV)，该病以双相热、急性鼻卡他、结膜炎、严重的胃肠炎和神经症状为特征。发病率和死亡率较高，给养犬业和毛皮动物饲养业带来极大的危害，加强本病的预防免疫极为重要，因此

4、采用重组DNA技术生产基因工程疫苗有重要意义。本文成功分离了一株犬瘟热病毒并进行了主要蛋白基因序列分析，为构建新型基因工程疫苗奠定基础。本文通过对从2009．2011年山东部分地区疑似犬瘟热的犬、貉、貂和狐狸临床症状和病理变化进行研究，探讨犬瘟热的-临床症状和病变特点，并进行流行病学调查。研究发现近几年患病犬、貉、貂和狐狸临床症状出现新的变化，足垫的角质化、皮肤病变现象逐渐减少，后肢瘫痪症状增多。广泛性出血，缺乏特征性病变。发病急、死亡率高。一年四季都有发生。采用Vero细胞从临床疑似患犬瘟热的犬组织

5、病料中分离出一株病毒，通过观察细胞病变，问接免疫荧光，提取细胞培养物RNA并扩增克隆分析N蛋白基因部分序列进行了鉴定。结果表明：该毒株接种于Vero细胞后，出现了典型的细胞病变；间接免疫荧光试验表明接种病毒的BHK-21细胞出现特异性的亮绿色荧光，而正常细胞则未见绿色荧光；对接种病料后的Vero细胞培养物提取总RNA进行RT-PCR扩增，得到了287bp的目的片段；序列分析表明该分离株与犬瘟热病毒弱毒(Onderstepoort、CDV3、recombinantSnyderHill等)的同源性较低为9

6、5．8％．97．2％，与标准强毒株(A75／17和254循an95)以及野毒株GU-4、ZJ7、98．2646等)的同源性较高为97．6％．99．3‰证明该毒株为犬瘟热病毒野毒株，命名为SDl0。根据Genbank上已发表犬瘟热病毒Onderstepoort(AF305419)株设计引物，参考有关文献合成9对引物，应用RT-PCR技术，从CDV分离株SDl0株的细胞毒中成功扩增出了9段cDNA，将这9段cDNA与pGEM．Teasy载体连接并进行克隆、测序，测得的序列经过拼接得到CDV核衣壳蛋白基因N

7、、磷蛋白基因P、基质膜蛋白基因M、融合蛋白基因F、血凝素蛋白基因H、大蛋白基因L的全基因序列。将分离株SDl0株与22株Genbank上发表的CDV全基因组参考毒株的6个蛋白全基因核苷酸序列及推导氨基酸序列进行比较分析。分析表明分离株SDl0株与疫苗株OndemtepooR(OP)和CDV3亲缘关系最远，属于强毒株，与中国分离株HLJl．06、HIA2．07、MKY-KM08的亲缘关系最近，同属于Asia-1基因型。青岛农业大学硕士学位论文摘要关键词：犬瘟热病毒；分离；基因；序列分析2青岛农业大学硕士

8、学位论文ABSTRACTIsolationofCanineDistemperVirusandtheGeneSequenceAnalysisofMainProteinsABSTRACTC．,ai血eDistemperiscausedbyCanineDistempervirus(CDV)．Thiscommunicablediseaseischar删bythesymptomsastwi·fever,acutecatarrhalicrhinitis，conjun