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分类号』丝三：丝UDC硕士学位论文密级玄军编号——广西猪流感病毒分离及全基因序列分析侯韶毅论文答辩日期2Q!Q生鱼旦垒旦．学位授予日期一答辩委员会主席睦童趑巫究员．论文评阅人拯盛硒究员嫠到主推亡硒究员． 学位论文原创性声明本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相关知识产权属广西大学所有。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮助的个人和集体，均已在论文中明确说明并致谢。谳⋯：P敖彻年莎月形日学位论文使用授权说明本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文的研究内容；按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。请选择发布时间：礅口时发布口解密后发布(保密论文需注明，并在解密后遵守此规定)论文作者签名：严彩旌导师签名：萎伟至励年步月矽日 广西猪流感病毒分离及全基因序列分析摘要2008年8月至2010年3月期间，本研究通过收集全区各地疑似猪流感(Swineinfluenza，SI)的临床样品进行病毒分离。应用鸡胚接种和细胞培养共分离到两株猪流感病毒(Swineinfluenzavirus，SIV)，通过对8个片段的全基因克隆及序列分析，证实为H1N2和H1N1亚型SIV。将分离株命名为A／swine／Guangxi／NNGN3／2009(H1N2)(简称GN3株)和A／swine／Guangxi／LBl44／2009(H?N1)(简称LBl44株)。另外，本研究也对本实验室保存的A／swine／Guangxi／LGXl／2006(H3N2)(简称LGXl株)和A／swine／Guangxi／LGX3／2005(H3N2)(简称LGX3株)进行序列分析。对GN3株和LBl44株各基因关键位点分析，发现GN3株HA基因第190、220、225、226、228位(H3亚型HAl位置)氨基酸残基分别为D、R、D、Q、G，表明其可与SAQ-2，6-Gal受体结合；在HA裂解位点只有单个R，不具备高致病性毒株HA序列特征；PB2基因第627、701位分别为E、D；PBI-F2为34个氨基酸组成的截短多肽；NSI第92位为D，且不具备PDZ配体功能域序列，这些都说明GN3株为低致病性SIV。耐药性基因位点中，NA基因l19E、274H、292R、294N和M2基因31S，表明GN3株对神经氨酸酶抑制类、M2离子通道作用类抗病毒药物依然敏感。LBl44株PB2基因627E、701N；NSI基因的PL基序(GPKV)都表明其为低致病性SIV。耐药性基因位点中，NA基因119E、274Y、292R、294N和M2基因31S，表明LBl44株已对奥司他韦产生耐药性，但依然对M2离子通 道作用类抗病毒药物依然敏感。系统发育进化与核酸同源性分析结果显示，GN3株为“人一猪一禽"三源重配SIV，且具有类似于北美地区三源重配SIV的TRIG(Triplereassortantinternalgene，TRIG)盒，其基因来源情况为：PB2和PA基因来源于北美禽源谱系；PBl基因来源于北美“三重配SIV株"人源谱系；HA、NP和M基因来源于古典HINI猪源谱系；NA来源于H3N2人源谱系；Ns来源于三重配猪源谱系。GN3株分别与Sw／Gx／13／06和Sw／Hainan／I／05保持较高的亲缘性，并与香港分离株Sw／HK／NS623／02关系最密切。而LBl44株PB2、NP、NA、M和NS基因都来源于欧洲类禽谱系，证实了LBl44株为欧洲类禽N1亚型SIV。LGXl株和LGX3株8个基因片段来源于人源谱系，证实LGXI株和LGX3株为近期类人H3N2SIV。关键词：猪流感病毒病毒分离全基因克隆序列分析系统发育进化分析Ⅱ ISOLATIONANDPH『YLOGENICANAI．YSIS0FSⅥ厂INEINFLUENZAⅥRUSINGUANGⅪABSTRACTDuringAugust2008toMarch2010，clinicalsamplesofsuspectedswineinfluenza(SI)werecollectedforvirusisolationinthisresearch．Twoisolates，A／swine／Guangxi／NNGN3／2009(H1N2)andA／swine／Guangxi／LB144／2009(H?N1)(abbreviatedtoGN3virusandLB144virus，respectively)，weregainedfrom9—11dayschickenembryoeggsandMDCKcells．PhylogenyandnucleotidesequencesanalysisdemonstratedthattheisolateswereH1N2andN1subtypeswineinfluenzaviruses(SIVs)．AndA／swine／Guangxi／LGX1／2006(H3N2)(LGX1virus)andA／swine／Guangxi／LGX3／2005(H3N2)(LGX3viurs)isolatedbylabbeforealsosequencedforanalysis．AnalysisofkeysitesofGN3virusindicatedmat190D，220R,225D，226Qand228G(accordingtoH3number)conferedbindingtoSAa一2，6-Galreceptor,containedamotifPSIQSRlGLFatHAcleavesitewhichrepresentedalowpathogenicinfluenzavirus．Moreover,GN3viruspossessedPB2-627E，PB2-701D，34aatruncatedPB1一F2，NS1—92DandlackedthePDZdomainmotifthatwasalsoinferredtoalowpathogenicvirus．Thefindingsof19E，274H，292Rand294NinNA，andM2-31S，whichimpliedGN3viruswassensitivetoneuraminidaseandM2inhibitors．PB2-627E，PB2—701NandNS1．PLmotifIII (GPKV)suggestedthatLB144viruswasalowpathogenicstrain．Theaminoacidresidue19E，274Y,292R,294NinNA，andM2·31SimpliedLB144virusWasresistanttoOseltamivir,butsensitivetoM2inhibitors．PhylogeneticsandnucleotidesequenceshomologiesanalysisrevealedthatGN3viruswas“human-swine—avian'’triplereassortantH1N2viruswithTRIG·like(TripleReassortantInternalGene，aVaG)cassetteoriginatedfromNorthAmericanswineherds，PB2andPAfromNorthAmericanavianlineage，PB1wasNorthAmerican‘'triplereassortantSIV’human—origin,HAandNPandMfromclassicalH1N1swinelineage，NAfromH3N2humanlineage，NSstemmedfromtriplereassortantswinelineage．GN3virushadageneticrelationshipwithSw／GX／13／06andSw／Hainan／I／05，wastheclosesttoSw／HK／NS623／02．Inaddition，PB2，NP,NA，M，NSofLB144virusoriginatedfromEuropeanavian—likelineagethatconfirmedLB144virusbelongtoEuropeanavianinfluenzavirus—likeN1subtypeSIV．AllsegmentofLGX1andLGX3virusesderivedfromhumanlineagethatshowedmeywererecenthuman-likeH3N2viruses．KEYWORDS：swineinfluenzavirus；virusisolation；molecularcloning；analysisofviralsequences；phylogenicanalysisIV 目录第一章综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1第一节猪流感病毒概述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l1．1．1二十世纪以来历次流感大流行简介⋯⋯⋯．．’⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11．1．2猪流感病毒病原学⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．51．1-3猪流感病毒分子生物学特性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯61．1．4流感病毒的遗传变异⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．14第二节猪流感流行病学概述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．161．2．1国外SIV主要亚型的流行病学概述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．161．2．2中国及周边部分国家地区SIV主要亚型的流行病学概述⋯⋯⋯．．211．2．3猪流感公共卫生学意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯22第三节研究目的与意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．24第二章猪流感病毒分离鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．25第一节材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯252．1．1主要材料及试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯252．1．2仪器设备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯262．1．3临床样品的采集及处理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯262．1．4技术路线⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯272．1．5病毒RNA提取及反转录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯282．1．6病毒分离⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯289Ol23423●一一隆●I一一克 2．2．4分析与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．35第三章GN3株全基因遗传进化分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．36第一节全基因序列测定及NCBI—BLAST分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯36第二节PB2基因分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．363．2．1PB2基因序列分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．363．2．2PB2基因系统发育进化分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．37第三节PBI基因分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．393．3．1PBI基因序列分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．393．3．2PBI基因系统发育进化分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．41第四节PA基因分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯423．4．1PA基因序列分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．423．4．2PA基因系统发育进化分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯43第五节HA基因分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯44478O145780l1456●■●■●■●-●-●．●I．．”T 3．10．3HA基因⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯623．10．4NA基因⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯623．10．5M基因⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．633．10．6NS基因⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯633．10．7病毒溯源推测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．64第四章LBl44株部分基因片段遗传进化分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯67第一节PB2、NP、NA、M和NS基因序列测定及NCBI-BLAST分析⋯⋯⋯⋯．67第二节PB2基因分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．674．2．1PB2基因序列分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．674．2．2PB2基因系统发育进化分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．68第三节NP基因分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯694．3．1NP基因序列分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．694．3．2NP基因系统发育进化分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯70第四节NA基因分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯704．4．1NA基因序列分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．704．4．2NA基因系统发育进化树分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．71第五节M基因分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．724．5．1M基因序列分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯724．5．2M基因系统发育进化分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．73第六节NS基因分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯734．6．1NS基因序列分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．744．6．2NS基因系统发育进化分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯75第七节讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯754．7．1PB2基因⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯754．7．2NA基因⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．754．7．3NS基因⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．764．7．4病毒溯源推测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．76第五章LGXI株和LGX3株全基因遗传进化分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．77第一节全基因序列测定及NCBI-BLAST分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯77第二节LGXI株和LGX3株全基因序列核酸同源性分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．78Vn 第三节LGXl株和LGX3株全基因序列系统发育进化分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．81第四节讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯89第六章全文讨论与结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯91第一节全文讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．91第二节全文结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．93参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．95致{射⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．108攻读学位期间发表的学术论文目录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．110VⅢ 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析第一节猪流感病毒概述第一章综述猪流感(Swineinfluenza,SI)由猪流感病毒(Swineinfluenzavirus，SⅣ)引起的一种急性高度接触传染性的群发性猪呼吸道疾病，能够给感染畜群带来巨大经济损失的疾病，1918年在美国首次发现该病。SIV感染宿主后可引起呼吸道系统疾病，主要以咳嗽、喷嚏、流鼻涕、呼吸困难、直肠温度升高、嗜睡和食欲下降为主要特征，偶可引起如流产等繁殖障碍，继发性细菌感染可加重临床症状。SI造成最直接的经济影响为体重下降，结果导致上市日期延长，耗料增加，因此SIV对养猪业危害严重。目前流行于世界各地的SIV主要是经典H1N1、类禽H1N1、类人H3N2及各种基因型的H1N2亚型毒株【l】。SI有两种传播形式：一种是地方性流行，在猪场中传播迅速，如无继发细菌感染，感染的猪只康复也很迅速。另一种是全球性大流行，感染猪只临床症状不明显，并且不是所有猪群都表现典型症状。以发病率高，死亡率低为特点。由于猪呼吸道上皮细胞具有禽流感病毒(Avianinfluenzavirus，√州)和人流感病毒(Humaninfluenzavirl,lS，H州)受体，因此是禽、猪、人等不同流感病毒基因重组或重配的“混合器"和流感病毒新流行毒株产生的“孵育器”121，对人类公共卫生产生一定的威胁，2009年甲型H1N1流感病毒便证实了这一点【3】。1．1．1二十世纪以来历次流感大流行简介1．1．1．11918"1919年西班牙大流感(H1N1)1918年暴发西班牙大流感的影响异常严重，全球约有2亿人被感染，至少2,000""4,000万人死亡，是有历史记录的最严重的一次全球性流感大流行，也称1918年大流感。这次大流行中的死亡人数大大超过由于第一次世界大战引起的死亡人数。与季节性流感l 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析显著不同的是，在西班牙大流感死亡的人群中，健康年轻人占很大的比例。据相关研究显示，1918年大流感分为三波，第一波发生在1918年春季，死亡率较低；第二、三波则在1918年秋季和1919年春季掀起，引起超额死亡率【4】。期间，在美国一些城市，每周有超过10，000人死亡。嘲，留liter蝴●椭1,oi'扮坍'臻辅¨榭●黼图l—l1918"-"1919年大流感期间英国流感与肺炎混合感染死亡翠的3次高峰Fig．1·1．ThreepandemicWaVeS：weeklycombinedinfluenzaandpneumoniamortality,Unitedmngdom,1918-1919141．1918年流感病毒的研究专家Taubenberger、Reid、Tumpey等人都对1918年流感开展了大量深入的研究，他们的研究结果表明【5舌7】，使用不同的系统发育进化方法分析时，1918年流感病毒有时处于人病毒谱系，有时处于猪病毒谱系，但都属于哺乳动物类流感病毒谱系。另外，根据推测显示，他们应该在流行之前就已经传入并定植在哺乳动物群体中。在Reid的研究中发现，1918"--1919年的几个代表株A／NewYork／I／1918、A／London／I／1919具有与A／Sw／Iowa／1976／31一样的受体结合关键位点氨基酸序列，故它们具有结合禽类、哺乳动物类受体的能力。这些说明西班牙流感病毒具有传染人的能力，也具备在猪群中传播的能力。在美国、中国、匈牙利猪群中发生类似猪流感的情况证实了这一点。2005年Tuml)ey[8】等在拯救出1918年流感病毒时发现，病毒的复制和毒力与NA介导的HA可裂性有关，HA与聚合酶基因又与病毒的最大复制量密切相关。目前，关于西班牙流感病毒的起源仍然疑惑，主流的两种起源假说为：一、在暴发前西班牙流感病毒已经侵入哺乳动物中，通过适应性地变异进化而进入人群中；二、在暴发前一种类似于西班牙流感的H1N1亚型禽流感病毒传入并适应人体，最终引发大流行。2002年Fanning等f9】从25个1915～-1920年的鸟类标本中检测出6份流感阳性标本，并从一只1917年的黑雁标本中扩增出流感病毒(A／Brantgoose／Alaska／I／1917(H1N?))2 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析部分HA、NP基因。而这部分HA基因包括在人流感病毒中正向选择压力大的24个氨基酸抗原位点，以及288bp的HA2片段。系统发育进化分析显示，在亲缘关系上，这株1917年流感病毒HA基因比1918年西班牙流感病毒更接近现代禽流感病毒，表明在过去的85年间禽流感病毒抗原漂移很小，并且西班牙流感病毒并没有直接从禽流感病毒中获得HA基因。这个结果也否定了西班牙流感病毒作为禽流感病毒直接传入人群的观点。1．1．1．21957年亚洲流感(H2N2)这次流感起源于1957年2月中国的贵州省，并且在同年3月和4月分别传播至新加坡和香港，紧接着第一波在美国和英国10月份暴发，第二波次年1月份暴发。1957年在日本就分离到了这次流感的毒株【101。感染的人群中，5"-'19岁的比例超过50％。这两波暴发都以死亡率高为特征，在美国大约有70，000人死亡，而全球有超过1,000，000人死于这次流感。研究表明这次亚洲流感病毒为“人．禽“重配株，它包含了禽源H2HA和N2NA，另外PBl也为禽源基因片段。由于这次流感并没有呈现特别的致病性，所以死亡率的增高来源于人群中没有H2N2流感病毒表面抗原的抗体【11】。1．1．1．31968年香港流感(H3N2)1968年香港流感始于东亚地区，且1968年7月份在我国香港地区分离到H3N2毒株。这次流感在随后的同年冬季和1969年冬季至1970年期间蔓延至全球各地，发病率高达40％，且发病群体为10,--,14岁人群。在美国，估计有33，800人死于这次流感。1986年香港流感毒株具有禽源的HA基因片段，而在人群中已经存在有对N2NA的抗体也许可以解释这次大流行严重程度为何比较温和。另外，它还和上一波亚洲流感一样具有禽源的PBl基因。香港流感的HA和PBl基因都来源欧亚禽源谱系基因，这与中国南方可能是流感大流行源发地的发现相吻合。1．1．1．41977年俄罗斯流感(H1N1重现)1977年俄罗斯流感始发于我国天津地区，1977年11月"'1978年1月中在前苏联和中国的青年人群中流行。美国则与1978年1月暴发相似的流行，其它国家也在接下来的冬季相继暴发。在适龄儿童中出现超过50％的感染率。在这次流行中，大于25岁的死亡病例几乎没有，表明这些人群中已经具有相应的抗体水平。随后分离到的这次流行的原发性病原为H1N1病毒(A／USSI∽7)证实了这个推测，因为在50年代初期与之相关的毒株已经流行。俄罗斯流感病毒这种与以前流行毒株密切的关系，和在病毒复制过3 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析程中缺乏突变的特点，否定了它在非人宿主体内定植的观点。1．1．1．52009年H1N1大流感目前流行病学数据显示，甲型H1N1流感在2009年3月中旬在墨西哥的LaGlaoda镇开始暴发【12】。2009年4月29日，美国出现首例首例人传人的病例，并且发现第一宗死亡病例。同日，WHO正式公告在此前一周一种H1N1流感病毒在全球范围内快速蔓延的情况，并批准通过将这次全球性大流行的警戒水平由4级提高至5级。5级的警戒水平表示在WHO范围内，一种新的动物源流感病毒持续在人际间传播，并且在另一个地区已报道这种病毒。同年5月21日，共有41个国家报道了11，034个感染案例，其中包括85例死亡。墨西哥和美国以外的大多数感染者是从墨西哥旅行归来。而大多数感染者症状轻微，并不需要住院f13】。在香港、德国等国家和地区出现系列感染病例之后，WHO在6月11日决定把甲型H1N1流感的警戒级别从5级升至第6级。这是WHO40年来第一次把传染病警戒级别升至最高级别。截止至2010年4月16日，WHO和ECDC共报道了1,353，141个病例，15，934个死亡病例，共有186个国家／地区确诊了病例，其中72个国家／地区出现死亡病例。相关研究口。13d41表明这次大流行毒株8个基因片段都来源于猪，而且这些流行株的共同祖先和关系最密切的猪源毒株早已在2000年以前就已经存在，并提出在此次爆发前人们长期没有采集到合适的样本及分离到那些“祖先毒株”，导致在爆发后人们对这次疫情的恐慌及不了解。这次流感大流行有许多名称，如爆发之初WHO使用的猪流感(Swinenu)、人类猪源流感(Humanswine—origininfluenza)、墨西哥流感(MexicoF1u)、北美流感(NorthernAmericaF1u)、H1N1新型流感(NovelH1N1virus)、甲型H1N1流感和2009年H1N1大流感(PandemicH1N12009)等【15】。目前WHO采用的是“2009年H1N1大流感"这个称谓，但许多学术文献上也采用“H1N1S．OIV’’(即Swine-originH1N1influenzavirus)这个称谓。中国大陆则采用甲型H1N1流感这个名称。甲型H1N1流感病毒的基因组来源如下：4 2010年广西大学硕士论文广两猪流感病毒分离及全基因序列分析一⋯爨基＼J一·o■■嗤■-■■，、H‘·0■■c■■啊赫黪——-瞳I’马突j羁．J，■◆—兰一羁■◆——-■肄图1-22009年甲型HINI流感病毒的基因组成与来源【M7】Fig．1-2Genesisandoriginofthe2009PandemicHINlinfluenzavirusesll矗1711．1．2猪流感病毒病原学1．1．2．1猪流感病毒概述流感病毒属于正黏病毒科(Orthomyxoviridae)，在正黏病毒科中目前共有5个属：A型流感病毒属、B型流感病毒属、C型流感病毒属、托高土病毒属(Thogotovirus)和传染性鲑鱼贫血症病毒属(Isavirus)。A型流感病毒可根据两个表面抗原一血凝素(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)的不同，可区分为不同亚型。目前，HA共有16个亚型(H1～H16)而NA有9个亚型(N1,-～N9)。现今流行于世界各地猪群中的主要是H1N1、H1N2、H3N2等亚型。1981年郭元吉【1酗在猪只中分离到C型流感病毒，但传统意义中猪流感病毒都属于A型流感病毒属。早在西班牙大流感流行期间(1918～1919年)就有学者【19-20]发现美国爱荷华州猪群存在一种临床症状和病理变化与当时人群中流行的流感有许多相似之处的流行病类流感症状。1930年Shope[211首次分离鉴定A／Swine／Iowa／15／1930(H1NI)，这也是人类分离到的第一株流感病毒。A型流感病毒可以感染很多种动物，包括人类、猪，马、海洋哺乳动物和鸟类【22】。世界范围内的人类、猪、鸟类和其他哺乳动物都是相互关联的，所以自然条件下流感病毒跨物种传播就有非常高的可能性。猪被认为是流感病毒生态学上的一个重要宿主，由5 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析于经常近距离接触人类和禽类，所以常常参与跨物种传播【¨。禽流感或人流感病毒传给猪后，这些病毒一般就被称为禽源SlY或人源SlY，以体现它们的前一宿主。1．1．2．2流感病毒理化特性A型流感病毒具有一层来源于宿主细胞的液态类脂膜的复杂结构。HA、NA以及M2离子通道蛋白从病毒表面突起，M1蛋白位于类脂膜下方而形成基质膜。核蛋白(Ribonueleoprotein,RNP)复合物构成病毒粒子核心，RNP复合物由病毒RNA(vRNA)片段、PB2、PBl、PA和NP组成。NSl／NS2主要在纯化的病毒中出现。病毒粒子所有成分为约I％RNA、5％～8％碳水化合物、20％脂质以及大约70％蛋白质。流感病毒粒子具有不同的纤突，这些纤突由HA和NA组成，长度约为10---14ilnl，它们之间的比例约为4：1团】。流感病毒呈现多形态，球状型粒子的直径约100nm，丝状型粒子具有细长的病毒结构(超过300nm)，后者在病毒最初分离时最常见，经过鸡胚或细胞培养物连续传代后主要变为球型。在病毒粒子冰冻切片电镜和负染下可以发现病毒的主要结构，如M1蛋白层以及病毒内部的螺旋结构。Duesberg【24】首次从分离并观察到RNP复合物。流感病毒为单股负链RNA(--sRNA)病毒，基因组共分为8个大小长短不一的RNA片段，每个节段都有核蛋白包被形成RNP复合体。如图1．3所示。图1-3流感病毒结构图Fig．1-3IllustrationofthestructureofinfluenzaAvirus1．1．3猪流感病毒分子生物学特性SIV的基因组由8个独立片段单股负链RNA构成。6国一圈～■一圈 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析表1．1猪流感病毒基因组及其编码的蛋白Fig．1—1SIVgenesegmentsandtheencodedproteinsRNA片段编码蛋白氨基酸(aa)主要功能lPB2759二。2PBI757耻。，PBl-F287PBI-N4040“；一!j3PA，7164HA566掌5NP498；，．～+r6NA4547一?“⋯⋯’”?1’j7MI252m，／，，，M297t。，’：8NSl230NEP，NS2121。识别宿主RNA帽子结构及内切酶活性⋯催化RNA的合成凋亡前体因子雩与病毒复制有关RNA聚合酶的酸性亚基毒主要抗原决定簇／表面糖蛋白，唾液酸受体结合结合功能与vRNA结合形成核糖核蛋白，参与从mRNA合成向模板RNA合成的转变，参与vRNA的合成，哆主要抗原决定簇，表面糖蛋白，神经氨酸酶活性保持病毒形态，病毒装配、转录，出芽o7j膜蛋白，病毒脱壳时酸化病毒粒子的内部环境可能抵抗宿主细胞产生的干扰素的活性j引导病毒的RNP从细胞核转到细胞质其所有基因组片段具有共同的特点：具有高度保守的3’末端前12个核苷酸【3'-HO—UCGU(C)UUUCGUCC．5’】和5’末端13个核苷酸【3'-GGAACAAAGAUGA-ppp．5’】。在这些共有序列部分互补，形成锅柄环状结构，该结构是vRNA聚合酶结合所必需的核苷酸识别位点，这对病毒RNA复制很重要。据目前我们了解，流感病毒8个片段共编码12个蛋白多肽，分别是PB2、PBl、PBI．F2、PBl-N40[251、PA、HA、NA、NP、MI、M2、NSl、NEP／NS2。据HA和NA的不同可分为16个HA亚型和9个NA亚型矧，如表1．1所示。1．1．3．1RNA聚合酶复合物(PB2、PBl、PA)SIV的RNA依赖性RNA聚合酶复合物主要由3个蛋白组成：PB2、PBl和PA。PB2为碱性蛋白，主要具有识别和切割宿主mRNA5’末端帽状结构引物的作用；PBl也为碱性蛋白，主要的功能为催化RNA合成，当结合到vRNA和cRNA末端启动催化转录和复制；PA为酸性蛋白，与转录复制有关，也有研究表明PA具有蛋白水解活性，靶向酪蛋白激酶II和磷酸化丝氨酸(Scr)和苏氨酸(The)残基。1．1．3．2血凝素(HA)HA由vRNA第4片段编码，最重要的功能受体结合和融合活性，但在萌芽和粒子形成的过程中HA也可能起结构性作用。HA是一个三聚体棒状I型糖蛋白分子，即羧基端在囊膜内，氨基端形成纤突而远离囊膜表面。在早期，HA需要经过翻译后修饰(糖基化、棕榈酰化)，在内质网将信号肽切除，HA0前体蛋白分子切割形成HAl和HA27 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析亚基这个过程对HA分子充分发挥活性是必需的。图1-4HA立体结构及抗原位点[2"／IFig．1-4ThemodelofHAmoleculeandmajorantigenicsitc吲Wilson等【冽在1981年首次成功解析HA分子的晶体结构。到目前为止，发现即使HA的全部氨基酸同源性低于50％，其分子结构和功能都高度保守。这说明HA的进化及序列的变异是快速的，而其结构及功能依然保守。未被酶裂解的HA晶体结构由HAl和HA2叠加形成(除裂解位点氨基酸位点外)。HA的结构特征主要表现为：3个HA2分子呈盘绕状肛螺旋形成HA分子的纤维状长茎，3个结构域一样的HAl分子形成HA分子的球状头部。HA最重要的功能位点——受体结合位点位于HA分子的球状头部。在I-13亚型流感病毒中，禽类病毒HA的受体结合凹槽在226位氨基酸为谷氨酰胺(Glu)，偏嗜SAa-2，3-Gal受体，而在人流感病毒HA的这个位点为亮氨酸(Leu)，偏嗜SAa-2，6-Gal受体。8 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析‘，—j‘一、一》：樾毫溅黼锄。撼辨棒军黼妊攮壤溉叠钵，}早羊群鹩堂网结构．iL—一‘■JC∞群图1-5偏嗜禽或人的流感病毒唾液酸类型示意图Fig．1-5Sialicacidlinkagespreferredbyavianorhumaninfluenzaviruses．A：Alpha2，3linkage(avian)：ThesialicacidisattachedbyitsC-atom2tothethreeposition(C-atom3)ofthepenultimatesugar,gal雒tose．B：AI．pha2，6linkage(human)：ThesialicacidisboundtoC-atom6ofthegalactosemoleculeviaitsC—atom2．Thesedifferentlinkagesresultinreceptormoleculeswithdifferentstericconfigurations．HA第二个主要功能为酸性pH触发的融合，这种融合对病毒粒子脱壳过程是必需的。低pH值的酸处理能显著改变HA的结构。HA对胰蛋白酶消化敏感，且由二硫键连接的HAl和HA2亚基对巯基乙醇也敏感。然而，在融合肽形成与HA2的锚定膜反向平行排列的过程中，酸性环境介导的结构变化起着重要作用。^la幻愀?7’‘咯’，7。～7i，aw^删』，：7’乒’’。nz’蜉“‘-；。．≯。、麓／．：i、?扣▲∥，★，f，‘ii∥’-a,am靛_?。“～⋯蓉堂捷妻’每磷蜘I，‘。，：曩|~j事守?i移jj_捻哪·邓“哆图1-6HA介导的病毒囊膜与细胞内质膜接触融合变形的模式图Fig．1-6ModelforjuxtapositionofviralandendosomalmembranesresultinginformationofafusionporeandreleaseofRNPs．Structuresofinfluenzavirushemagglutininintheirpostfusionstatemodeledintoapossiblefusionintermediate(A)andintoafusionpore03)．最终这个融合肽使细胞内质膜与病毒囊膜并列嵌接而融合。在两个以上的HA分子存在时，将形成融合小孔供vR．NP通过而进入细胞质中。酸性条件下制备HA蛋白始终9 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析没有融合肽存在(由于蛋白酶活性)，因此这种制备方法没有能得到直接的融合肽晶体分析。但通过核磁共振技术已经解析了带有去污剂微团的融合肽结构。推断长度为19aa的融合肽形成转角钩结构的两性结构，浸入脂质双层膜的小叶中。这种转角钩结构可能有助于牵扯细胞内质膜靠近病毒囊膜，触发融合过程的开始。胞浆尾区是HA的第三个主要结构，在所有的亚型中都高度保守。在这个区域有棕榈酰化三个半胱氨酸(Cys)，其中的一个位于跨膜区。这个区域的功能仍未完全了解。对于H1亚型病毒来说，在HA跨膜区半胱氨酸的替换可导致病毒高度致弱，并且胞浆尾区Cys的突变则完全不形成感染性病毒。相反，对H3亚型流感病毒来说，在这些Cys位点上的突变或者是缺失胞浆尾区的病毒，都能在组织培养中有效复制，仅在小鼠模型中表现出致弱的特性。最近，已经证实HA的棕榈酰化对囊膜的有效流动性至关重要，对融合孔结构及病毒感染性也至关重要。因此，HA的棕榈酰化胞浆尾区对病毒的有效复制很重要，但可能存在病毒亚型、细胞／宿主的特异性差异。在受体结合、融合及装配中HA还扮演者重要角色。HA是宿主适应性免疫系统识别的主要抗原决定簇。病毒的感染和复制，引起机体剧烈的免疫应答而产生中和抗体。中和抗体又迫使病毒产生“抗体逃逸"的变异毒株。所以产生氨基酸变异的片段几乎都是HAl。随着时间的推移，这些累积的变异表现出固定性，称为流感病毒的抗原漂移。Fab抗体片段分子结合到HAl的不同区域，有趣的是并不是所有的情况都是三个Fab片段结合和一个三聚体纤突结合。据发现，一个Fab分子与一个单聚体纤突结合或者两个Fab分子与一个三聚体纤突结合。在某些情况下，两个Fab分子与连个单聚体相交联，致使HA分子不能发生酸性条件系的构象改变。1．1．3-3核蛋白(NP)RNA病毒也其它病毒不同的是它对细胞核功能的依赖性，这也是流感病毒整个生命周期的特点之一。所有vRNA的合成都在细胞核中进行，病毒基因组入核及出核运输都是紧密协调的过程。流感病毒的基因组不存在以裸RNA的形式，而是与4个病毒蛋白形成病毒核糖核蛋白复合物(viralribonucleoproteincomplexes，vRNAs)。在v对岬s中最主要的就是包裹vRNA的核蛋白(Nucleoprotein,NP)。其余三个蛋白(PB2、PBl和PA)与vRNA的部分互补末端相结合，形成独特的锅柄状结构。vRNA的宽度为10～20nIIl，由于形状过大而被认为是被动扩散到细胞核里的。因此，一旦从进入细胞内的病毒粒子中释放，它们必须依赖于一种主动核输入机制。所有的vRNAs都具有核定位信号(Nuclearlocalizationsignals，NLSs)，NLSs介导vRNAs与核输入开关结构相互作10 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析用。已证明正是在NP上的NLSs，对vRNA的输入是充分必要的。NP由第5片段编码，是主要的结构蛋白，为病毒核衣壳的主要蛋白成分。NP基因在各个基因中为最保守的基因之一，具有型特异性。因和聚合酶蛋白一起与vRNA结合，所以起稳定vRNA并使之免受RNA酶降解的作用。宿主细胞毒性T细胞免疫应答的主要靶基因为NP，但其抗体不足以提供宿主完全保护力例。1．1．3．4神经氨酸酶(NA)NA是流感病毒第二个主要糖蛋白，也是典型的II型糖蛋白(氨基端在囊膜内，羧基端在囊膜外)，是流感病毒表面另一种重要的抗原。9个NA亚型的流感病毒依照基因序列主要分为两个群：一群为N1、N4、N5和N8；另外一群为N2、N3、N6、N7和N9。NA具有一个短小的高度保守胞浆尾区和一个疏水跨膜区，后者起锚定另两个结构域——茎部和头部区的作用。NA头部的结构是一个同源四聚体，每个单体由六个拓扑结构相同的B．折叠片组成，这些折叠又排列成螺旋状。在头部区，5个糖基化位点中的4个与糖残基相连。有9个保守的活性氨基酸残基与唾液酸配体相互作用。用NA缺陷型的温度敏感突变株感染细胞时，在电镜下发现有大量完整的病毒粒子聚集在细胞表面附近。 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析1．1．3．5基质蛋白(M1、M2)M由vRNA片段7编码的非糖基化蛋白，是病毒粒子中含量最大的蛋白，占病毒粒子总量的30"--40％。M基因有2个蛋白——Ml、M2。M1由252个氨基酸组成，是病毒的主要结构蛋白，是核衣壳的主要成分，具有型特异性，其抗原性的差异是流感病毒分型的依据之一。M1位于病毒囊膜的类脂双层内侧，核衣壳外侧，是维持病毒形态的结构蛋白。M2由97个氨基酸组成，是一种跨膜离子通道蛋白，M2主要作用是在HA合成过程中作为质子通道控制高尔基体内的pH值，在病毒脱壳时酸化病毒粒子的内部环境【矧。随着病毒复制的进行，新的RNP在胞核中装配并运输至胞浆。两种病毒蛋白M1和核输出蛋白NEP／NS2参与引导vRNPs的核输出。据有关研究结果显示，在胞核内M1与RNPs关系密切，并且M1可能在RNP复合物的形成过程中起促进作用。M1与vRNA和NP都有联系和接触，有证据表明，M1也与核小体结合并，推测由于M1的作用引起RNP从核基质上脱离。这些都符合M1核输出需要随后RNP复合物输出的发现。而且，在高温的条件下，发现热休克蛋白70与RNP结合，以阻断与M1接触并与RNP一起运输出胞核。M1是病毒粒子中含量最高的蛋白，位于脂质囊膜下方，这个区域被认为与糖蛋白胞浆尾区和vRNPs相接触，因此M1在内核成分和膜蛋白之间形成桥梁联系。对其结构分析显示，M1的由两个球形螺旋结构域组成，这些结构域通过一种蛋白酶敏感区域相连接。M1单体为6眦长棒状，在负染电镜下发现其一端囊膜相连，另一端则指向病毒粒子内部。这些棒状体形成有序的结构，这与M1同源寡聚性相吻合，它们的排列使带阳性和阴性电荷的残基以低聚体相对立的形式呈现。相关研究【3伽表明M1的作用与脂质膜有关，如M1与vRNPs和NEP／NS2的相互作用。因此，在病毒装配过程中M1被认为具有至关重要的作用，在质膜上M1补充病毒各种组分至装配场所。M1对病毒样粒子的形成是充分必要的，也进一步说明了它在病毒出芽过程中的重要。M2蛋白是流感病毒一种四聚体Ⅲ型(缺乏信号肽序列)完整膜蛋白。它具有一个短小的胞外域、跨膜区、棕榈酯化和磷酸化的胞内域。M2具有离子通道活性，主要作用是使酸性核内体质子流入病毒粒子内部使vRNPs从病毒其它组分脱离，从而完成脱壳过程。离子通道活性涉及控制高尔基体的pH值使HA剪切成熟，但这个功能只对携带高度酸性敏感的HA起作用。具有多个碱性残基裂解位点的H5和H7亚型的HA对早期酸性介导的构象变化更为敏感。M2蛋白可以影响病毒粒子呈纤维丝状和球状的比12 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析例。另外，M2在病毒的装配和出芽也起作用。M2的结构和遗传分析表明它是一个酸性旷粒子通道，为两性螺旋环螺旋，平行于囊膜和跨膜区。跨膜区有四个螺旋，在类脂双层膜中呈一定角度并形成孔隙。从截面来看，它能容纳金刚烷胺分子，从而堵塞离子通道。M_2胞外部分的结构及确切功能仍未清楚。但M2胞外部分已被众多研究者认为是通用流感疫苗研究的基础，因为所有流感病毒M2长期存在高度保守序列口11。1．1．3．6非结构蛋白(NSl、NEP／NS2)NS由vRNA节段8编码，包括编码NSl和NS2。NSI是一个二聚蛋白，由230个氨基酸组成，编码NSl开放阅读框(Openreadingfragment,ORF)的mRNA不需要剪切加工。NSI主要参与到感染的细胞核中，在早期感染细胞中大量表达，并且具有与dsRNA结合的活性，与RNA结合区域位于N末端73个氨基酸区域。NSlRNA结合区形成对称六螺旋折叠同型二聚体，每个单体第二个螺旋组成的富含精氨酸(Arg)的核酸结合位点上是NSl的表位。突变分析进一步表明，这些二聚体的形成是与RNA结合的关键，由于第二螺旋中的38位(R)而不是41位(K)增强了结合亲和力。由于缺乏序列的特异性，也提示这些核酸序列与RNA磷酸骨架间可能是通过静电相互作用。另外一些研究进一步表明【32】，无论病毒NSl或靶RNA发生何种结构变化，NSl蛋白二聚体都能跨越典型的A型dsRNA小沟。NSI其余的蛋白被称为poly(A)结合蛋白II(agaII)、30一kDa裂解亚单位和多聚腺苷酸特异性因子(CPSF)的结合位点和效应区。图1-8NSI与靶RNA结合模式图【321Fig．1-8TheRNA-bindingdomainofNSl(residuesl习3)isshownaSadimerboundtoahypotheticaldsRNAmolecule[32l13 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析NS2蛋白由121个氨基酸组成，但与NSl不同的是其编码ORF的mRNA需要剪切。NS2在感染的后期合成生产，在不同的毒株中高度保守。1．1．4流感病毒的遗传变异系统发育进化分析表明，所有已知的流感病毒都在禽类体内保存，所以推断所有的哺乳动物流感病毒都来源“禽流感病毒库"[33】，如图8所示。在核酸和氨基酸水平上禽流感病毒(Avianinfluenzavirus，AIr)的进化速率都明显比哺乳动物流感病毒低。事实上，特别是在野生水禽体内，流感病毒的进化似乎是停滞的，提示这些病毒在“寻找’’最合适的宿主。在这种情况下，氨基酸替代没有选择性优势。因此，虽然发生相似频率的突变，但不会引起氨基酸含量的变化。与此相反，哺乳动物和所有陆基家禽病毒基因片段的不断积累氨基酸替换，它们不停地改变其抗原性，主要是为了逃脱宿主已获得的免疫。对流感病毒的保护与病毒表面糖蛋白的抗体水平有关，而表面糖蛋白更有抗原性变化的倾向。流感病毒通过两种主要的机制改变其抗原性：抗原转换(Antigenicshift)和抗原漂移(Antigenicdrift)。图1-9流感病霉循环模式图Fig．1-9CocirculationofinfluenzaAviruses1．1．4．1抗原漂移抗原漂移是由于产生点突变而导致A型和B型流感病毒HA或NA基因发生细微、渐进地抗原性变化。在哺乳动物中，A型流感病毒的抗原漂移是由中和抗体引起正性选择的结果。产生的突变株不再被父本毒株抗体所中和。在陆基家禽流感病毒也同样发生抗原漂移，但变异程度比人流感病毒要小。人流感病毒HA或NA氨基酸序列发生变异的频率低于1％／年，然而抗原漂移通常在2～5年引发一次地区性流行，然后不断被其14 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析它突变株取代。1．1．4．2HA基因抗原漂移HA蛋白是流感病毒的主要抗原成分。X射线晶体学分析显示【3¨51，(以H3为例)5个抗原区(A～E)通过序列比较分析和突变体鉴定技术已经得到确认。A区为140"--146位氨基酸残基(缸)形成的突起环；B区由155"--160位88,形成的环以及188～198位aS．形成的a．螺旋组成，位于HA膜顶部末端；C区位于HAl反向平行片段上的球状域底部；D区在球状头部域的三聚体接口附近；E区位于A区与C区之间的球状远端域的底部附近。对于H1亚型流感病毒来说，有五个抗原位点【36】，分别为：Cal、Ca2、Cb、Sa和Sb。已证实在这些抗原区之间存在某些重叠区域。在HA抗原区的单个点突变足以引起抗原性变异【351。在病毒检测过程中，可以随时发现病毒抗原的差异。在血凝抑制试验(m)中则可以检测到抗原较大的变异，这种变异通常需要病毒2"--5年突变的累积。实验室条件下，在病毒增殖过程中可以通过对单个位点单抗以1"--105的变异频率来筛选、模拟抗原漂移。相反，在目前针对几个抗原区的抗体中筛选突变株是不可能的，原因是这样的概率十分低。因此，在存在多种抗体的人体中选择这些抗原漂移的突变株很难进行。病毒感染后，人体血清的抗体所有成分很有限，而且已证实某些动物血清中主要是单抗。因此，抗原漂移突变株的筛选，可能是通过不同个体连续发生逐步突变累积造成的。1．1．4．3NA基因抗原漂移NA基因抗原漂移的机制与HA相似，在体外突变株选择与变异频率模拟实验中已得到证实。单抗与氨基酸序列的研究分析表明NA具有2～3个抗原区【371。在NA的三维结构中，包括有两个抗原表位，他们位于分子表面的唾液酸结合位点的侧翼。另一个可能存在的抗原表位在分子头部的底端，但是很难想象抗体是如何结合到这个位点而导致免疫逃避突变。对此，详细的研究分析显示，N9亚型NA单抗Fab片段位于酶活性位点边缘的五肽环区，而五肽环区组成NA的抗原表位。第二个表位的单抗可以与N8亚型NA结合，位于两个邻近NA四聚体的接触面上，它包括在各个单体上的肽环区。抗体只与这个表位结合而不是与NA四聚体结合。1．1．4．4抗原转变由于抗原突变幅度较大(主要是HA或NA)，导致新的亚型产生，这种变异称为抗原转变。抗原转变的蛋白在免疫原性上与以前流行毒株不同，这将引发在无免疫人群的高感染率继而引起大流行。lS 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析在20世纪，大流行流感病毒发生了四次抗原转变的事件，分别是：出现H1N1的1918年“西班牙流感"；1957年H2N2亚型取代H1N1亚型引发的“亚洲流感"；1968年H3N2亚型取代H2N2亚型的“香港流感"；以及在1977年重现H1N1亚型的“俄罗斯流感"。这些新的亚型突然爆发，并没有规律性和可预测的爆发间隔时间。抗原转变由基因片段重配引起，通常发生在人和禽流感病毒之间。有充分证据显示人与人、禽与禽以及人与禽体内都会发生重配现象【221。“亚洲流感’’和“香港流感"就是人与禽流感病毒重配的典型例子。抗原转变的另一个机制，禽或猪流感病毒直接传给人，并定植在人群中。虽然没有直接证据确定，但系统发育进化证据表明“西班牙流感"是通过禽流感介入人群中引发的【5柏8．391。第二节猪流感流行病学概述猪流感病毒进化明显比人流感病毒慢，由于地域限制性和免疫压力的选择，世界各地区的SIV呈现比较明显的进化差异。目前，对猪流感病毒的流行病学及相关研究主要集中在欧洲、北美、东亚、东南亚等，其它地区的研究报道较少。1．2．1国外SIV主要亚型的流行病学概述1．2．1．2北美地区SIV主要亚型流行情况1998以前猪群中流行的流感病毒基本上全都属于古典猪H1N1亚型，但之后的几年间由于发生基因重配，北美地区猪流感病毒的流行情况趋复杂。1．2．1．2．1古典SwHlNl病毒：在美国SIV进化与变异的历史进程中，SIV都具有与人流感相似的可预测的方式一一发生在秋末和冬初的几个月份里。1998年之前，美国猪群中发生急性呼吸道疾病的病原几乎由典型猪H1N1亚型谱系流感病毒(cHlNl)引起。1930年，cHINl首次由Shope在北美中分离并鉴定，1918年西班牙大流感期间在猪群中也发生类似人流感的症状，cHINl也被认为这此期间传入猪群(图10一A)。在此后几乎70年内，cHlNlSIV在北美猪群中相对稳定并成为唯一的优势毒株。16 o。9酣18nuHINl·瞄一州州，帕2嚣盘‰，二：暑‰。2器：龆卅纳3器帮；篱船帕篙∥一H3一N2叫眦麟It-1卤Ⅸl"w愀1，!图1-10A流行于北美地区的猪流感病毒谱系的重配情况嗍Fig．1．10ASchemeofreassortmenteventsleadingtotheprevalentNorthAmericanSIVlineagest40l图1-10B北美地区主要SIV基因片段重配模式图‘删Fig．1．10BDiagramofviruseswiththeireightgenesegmentconstellationsincurrentlycirculatingSIVsinNorthAmedca【硼1．2．1．2．2基因重配SwH3N2病毒：相关血清流行病学调查显示，1998年前在美国猪群中类人H3SIV已经低水平流行[41】，但还没有形成稳定的谱系(图1．IOA)。1998年，美国北卡罗丽娜州、明尼苏达州爱荷华州和德克萨斯州的猪群中相继暴发严重的类流感状猪病，这次流行病暴发的致病原被证实是H3N2SIV。分子遗传学分析显示这些H3N2SIV至少有两种基因型SIV组17 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析成(图1．10A)。北卡罗丽娜州SwH3N2分离株由类人谱系HA、NA、PBl基因片段，和古典型猪谱系NP、M、PB2、PA片段构成，为二重配株；而其它三个州的分离株则为三重配株(HA、NA、PBl：人；NS、NP、M：猪；PB2、PA：禽)【42】。1999年底，这种三重配株开始在美国猪群中大范围流行[431，而二重配株并没有在猪群中流行。另外，这两种重配株在相同的HA基因，且在关键受体结合区也具有一致的序列，表明这些不同的重配株暴发与HA和受体结合位点以外的因素有关。两种重配株的不同主要在于，三重配H3N2株获得了两个禽类基因片段_呻A、PB2(图1．10B)。H3N2三重配株一开始在猪群中定植，就通过基因突变以及与cHlNl重配的方式来进化。目前，已经发现许多种重配型株，也包括其它H3N2重配株阳川51，H1N2株[46-471，H1N1重配株(rHlNl)【451，和H3N1株【48-49](图1．10B)。北美地区猪群中，H3N2、rHlNl和H1N2已经形成地方性流行，且呈现共同循环的形式。最近，加拿大猪群中出现新的类人H1亚型SIV，在遗传与抗原水平上均与古典型猪H1亚型谱系不同【50l。目前美国猪群中形成地方性流行的重配株中，它们都具有一个相似的基因构成——三重配内部基因(Triplereassortantintemalgene，TRIG)盒，包括禽谱系PB2和PA基因，古典猪谱系NP、M和NS基因，人谱系PBl基因(图1．10B)。提示TRIG盒可以接受多种HA和NA基因，同时可能赋予新重配株基因最优组合的优势。获得禽谱系PB2和PA基因以及人谱系PBl基因的SIV显示了其抗原漂移和重配的概率比以往毒株高，因此能逃避猪群免疫压力。这与cHlNl不同，因为cHINl的抗原性在几乎70年里都保持相对稳定【5l’52巧31。1999年eHlNl与几十年前的H1N1SIV分离株仍保持中度至良好的交叉反应【54J。Richt和Webby等已对1998年的H3N2SIV分离株评估遗传性和抗原性水平[44451，研究发现在美国至少出现3种类人H3亚型SIV，形成遗传关系密切的I、Ⅱ、Ⅲ进化分支。在分支间存在不同的抗原交叉反应。第Ⅲ支H3N2SIV已成为北美地区猪群流行的优势毒株之一。随着第Ⅲ支的不断变异、进化，已出现了第Ⅳ支变异株H3N2SIV[551。1．2．1．2．3基因重配Swill亚型病毒：有关学者已经对1930年以来的10株H1SIV和最近的分离株的致病性进行比较研耕541。H1亚型SIV分离株间在致病性方面存在差异，而且近期分离株倾向于表现：更严重的病变、鼻分泌物增多、肺部病毒滴度更高。血清学研究表明，古典型毒株之间具lR 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析有较好的交叉反应，而“现代’’毒株与古典型毒株以及“现代"毒株间有些只有较少交叉反应。这些呈现了毒株遗传和抗原性多样性现象的增多，而这种现象与1998年三重配H3N2SIV的出现以及新毒株TRIG盒的获得同时发生。最近许多分离株在HA预测的抗原和受体结合位点都出现氨基酸的累积变异。H1N1和H1N2SIV中抗原多样性的存在，与三重配H3N2SIV出现的多样性相似。从2005年以来，H1N1和H1N2SIV的传播已经横扫美国所有猪场，它们的HA来源人流感病毒。在遗传学和抗原性上，这些来源于类人型猪H1流感病毒(hu-H1)的HA基因都与cHlNl不同。然而它们六个内部基因却与同期三重株的TRIG盒相似。新毒株的NA基因也主要来源于人谱系毒株N1或N2亚型毒株。hu．Hl也成为猪群暴发呼吸道疾病所分离毒株中主要SIV亚型毒株。有研究表明，huoHlNl与rHlNl强毒株的肺部病变变化动力学、病毒载量和排毒情况都存在差异，说明这种新出现的基因型毒株并不能完全适应猪，因为hu-H1N1在肺部的复制和鼻腔排毒情况都比同期出现的rHlNl毒株轻微。虽然如此，hu-H1也已经在美国猪群中定植。1．2．1．1欧洲地区SIV主要亚型流行情况目前欧洲猪群中流行的主要是类禽H1N1、H1N2和H3N2病毒，其中后两者是基因重配病毒。1．2．1．1．1类禽swHlNl病毒：目前的欧洲猪流感H1N1亚型病毒主要是类禽SwHlNl病毒，其8个片段完全来源于禽类流感病毒，即由禽HINl流感病毒跨越种间屏障直接传给猪的。在1979年首次发现欧洲地区猪群中的类禽SwHlNl病毒，代表株为A／swine／Amsberg／6554／1979(H1N1)，病毒的抗原性和遗传性方面与古典SwHlNl病毒完全不同。与古典SwHlNl病毒相比，类禽SwHlNl病毒具有明显的选择优势，所以在类禽病毒传入猪群几年后就完全取代了古典SwHlNl病毒，成为目前欧洲猪群中SIV的优势毒株之一。1．2．1．1．2基因重配SwHlN2病毒：1994年Brown等‘561从英国发病的猪体内分离到的H1N2亚型流感病毒，分子遗传研究表明病毒的这个H1N2毒株的HA和NA基因分别来源于人H1N1和基因重配的SwH3N2亚型病毒，6个内部基因由欧洲猪群中类禽SwHlNl病毒提供。之后此类人SwHlN2病毒传播到欧洲其他地方，在欧洲大陆的猪群中广泛流行。19 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析睁麓IA／swrnalyF309183Il≮瑟，10扣l：苎!l”-图1．1l流行于欧洲地区的猪流感病毒谱系的重配情况Fig．1·11SchemeofreassortmenteventsleadingtotheprevalentEuropeanswineinfluenzaAviruslineages．2005年Zell等[571在德国分离到的两株新型SwHlN2毒株[A／Sw／Dotlingen／IDT4735／05(H1N2)和A／Sw／Cloppenburg／IDT4777／05(H1N2)]，系统发育分析显示这两株病毒内部6个基因片段由类禽SIV病毒提供，而HA和NA基因分别由欧洲类人SwHlN2病毒和类人SwH3N2病毒提供。目前，这些基因重配SwHlN2病毒也成为目前欧洲猪群中SIV的优势毒株之一。1．2．1．1．3基因重配SwH3N2病毒：1984年Castrueei等人‘581首次在意大利的猪群中发现基因重配SwH3N2病毒，其中HA和NA基因来源于人H3N2病毒，而内部基因则来源于流行猪群中的类禽H1N1病毒，这个例子首次证实了猪可作为流感病毒“混合器"。1991年，在英国分离到一株重配株A／swine／UK／11940／1991(H3N2)，至少有NA和NS基因来源当时的人H3N2病毒，形成基因重配型SwH3N2。这种基因重配SwH3N2病毒也是目前欧洲猪群中的另一个优势流行株。20翮一赢一p丽丝■曛一孕 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析1．2．2中国及周边部分国家地区SIV主要亚型的流行病学概述1．2．2．1古典猪H1NlSⅣ早在1918年西班牙大流感期间，在中国就发现猪流感的存在嗍。香港【59-60]、日本【6l】、台湾【删、中国大陆‘蚓和韩国【叫等国家和地区分别报道古典H1N1SIV的存在。1991年郭元吉等【回首次从我国猪群中分离到古典H1N1SIV。此后不断有从猪群中分离到古典H1N1的报道【6“51，核苷酸同源性分析显示分离株与美国古典H1N1SIV同源性很高，亲缘关系相近【6确刀。1．2．2．2类禽H1N1SIV1993年管轶【删等从中国南方地区分离类禽H1N1SIV，但是这不大可能是来源于欧洲，应该是中国已存在的，因为这些分离株在欧亚禽谱系中的形成了一个亚洲谱系，提示我国已存在H1N1流感病毒由禽到猪种间的传播。2007"2008年刘金华等眇1首次从中国浙江、北京、山东等地分离到欧洲型类禽H1N1SIV，由于在这些地区的猪群已存在各种亚型SIV[701，提示在中国猪群中产生潜在大流行的可能性有所提高。1．2．2．3类人H1N1SIV1981"-'1984年间魏启珍‘71-72]等的研究表明，我国黑龙江部分地区的猪血清中同时存在抗人H1N1和抗人H3N2抗体，可能存在人流感病毒感染猪的情况，同时证实在m抗体水平上H1N1、H3N2SIV与人流感病毒呈现平行关系。1．2．2．4类人H3N2SIV在1969年，Kundin等【删首次发现H3N2亚型“香港流感’’病毒由人传入台湾猪群中。此后，这种类人SIV不断在欧洲及亚洲猪群中流行[741，但这种类人SIV仅零星引起猪的临床症状。1998年PeiriSt【75】从外观健康的大陆供港猪群中分离到类人H3N2病毒。同时，也有中国大陆的学者不断报道在猪群中检测到类人H3N2SIV[71m-76]。2001年，李海燕【77】等对全国各省50个猪场进行血清学调查和病毒分离鉴定，结果显示大部分猪场呈血清抗体阳性，并从东北地区多株H3N2亚型SIV，说明东北地区猪群中已经出现由H3N2引起的猪流感。另外，在对华北、华中、华东、华南和西南地区部分猪场的调查㈣也显示流行的SIV以H3亚型为主。康文彪【咧等对甘肃猪场的血清学调查也显示H3N2SIV阳性率为27．9％，2005""2007年广西区H3亚型【8嗍1·娩’83】的阳性率为25．7％,---49．1％。2008年于海‘踟等也在广东地区分离到类人H3N2SIV。这些都说明在中国猪群中H3亚型已经成为SIV流行的优势毒株之一。21 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析1．2．2．5基因重配H3N2SIV香港学者在80年代初从华南地区的供港猪中分离到3株基因重配的H3N2病毒【851，它们的HA和NA基因来自人源H3N2SIV，而内部蛋白基因来自古典猪H1N1病毒，但这种重配株没有造成流行，对猪体的致病性也不清楚。1．2．2．6基因重配H1N2SIV1978年日本‘s61首次从猪体内分离到H1N2亚型病毒。相关研究表明，发生于日本[861、法国【871、英斟黯-891、美国【891、韩国例、中国‘91-92】、加拿大哪!和泰国【舛1等的H1N2亚型SIV是HINl和H3N2的重组产物，因为H1N1和H3N2疫苗的双重免疫猪对H1N2亚型SIV感染具有交叉保护作用。这些地方都相继分离出该亚型SIV。但这些国家所分离的H1N2SIV的基因来源并不完全相同。日本分离株为人H3N2病毒(提供NA基因)与cHlNl形成二重配株；中国分离株一种与日本株基因组成相同，另一种与韩国分离株即】贝0为三重配株，与北美流行的含TR／G盒三重配SwHlN2类似(HA：cHlNl；NA：人H3N2流感病毒)[40-951。1．2．3猪流感公共卫生学意义猪流感是规模化猪场普遍存在且难以根除的猪群发性疾病，不仅可直接引起患猪死亡，更重要的是使患猪生产性能和免疫力下降，直接影响猪群健康状态和猪的质量，对养猪业危害极大。SIV是“猪呼吸道病综合征"的原发性致病原之一，由于SIV主要侵袭猪呼吸道上皮细胞，致使其呼吸上皮管壁损伤，同时SIV也引起免疫抑制，使猪只免疫力下降，继而引发继发或混合感染，使死亡率增高，引起巨大的经济损失。 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析图l一12SI症状、家庭养殖模式、猪作为中间宿主的模式图Fig．1-12SymptomsofSIandModelofyard-breedingandroleofswineasintermediatehostofinfluenzaviruses中国南方，特别是华南地区，被认为是世界流感暴发和流行的中心嗍，家猪传统的家庭饲养体系使得猪和家禽、人保持密切的接触，给病毒的共循环和基因重配提供了理想的场所和机会。尽管AIV可以直接感染人，但是目前还没有报道AIV可以在人群中有效传播。由于猪呼吸道上皮细胞表面同时存在流感病毒两种受体：唾液酸a-2，3半乳糖苷(SAa一2，3一Cab和唾液酸a．2，6半乳糖苷(SAa-2，6．C,a1)，所以猪能被人、禽等多种流感病毒感染，并且成为“禽一猪—人"流感病毒种间传播链中重要的中间宿主，是禽、猪、人等不同流感病毒基因重组或重配的“混合器”【9刀和流感病毒新流行毒株产生的“孵育器”，SIV既可以直接感染人类又可以在人群中传播‘粥势100l。1976年新泽西州发生的一起人感染SIV致死事件【1011，引起美国甚至世界对SIV公共卫生的重视。并且此后不断有SIV感染人甚至致死的报道【102·103-1睥105-106-107·1惦l。报道猪有可能是人类流感的“储存库”，一些古老的人流感病毒从人传入猪后就定植在猪群中，而当人群对这种流感病毒的免疫力消失之后又重新介入而再引起流行。因此，SIV作为一种人畜共患病，对人类公共卫生安全具有深远的意义。23 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析第三节研究目的与意义流感病毒从发现到现在，给人类健康及养殖业造成了严重的威胁。20世纪四波流感大流行造成数以万计人死亡，1997香港和2003年亚洲数个国家高致病性H5N1AIV传染人更引起感染者平均死亡率高达60．6％，引起人们巨大的恐慌。也因此各国都加强对人群和禽类流感病毒的监测。2009年暴发于墨西哥的甲型H1N1流感病毒无疑给不完善的流感监测体系沉重的打击，感染人数超过135万例，死亡超过1．5万人。虽然这次大流行的传播速度、感染率和死亡人数都比季节性流感相当或略低，但其8个基因片段都直接来源于猪，为“人一猪一禽”重配株，同时也具有TRIG盒，这8个基因片段的组合在此次流感暴发前从未发现。在其它国家依然有使用猪源流感病毒(Swine．origininfluenzavirus，S．OⅣ)、北美流感、墨西哥流感等术语。正如GavinJ．D．Smith在(Nature)上所言，由于长期对SIV监测的忽视，临床样品和毒株都缺乏，致使人们对这次流行的毒株的过去流行历史一无所知，呼吁建立和完善对流感病毒包括猪源流感病毒在内的流感病毒立体监测网络。本实验室在2005"--'2006年间分离了3株SIV，包括l株H1N2和2株H3N2SIV，其中它们的NA基因都来源人谱系流感病毒。在此期间，蒙雪琼分离到一株三重配H1N2SIV，2008年于海分离到4株类禽H9N2SIV。目前所分离出的毒株数量还不够多，时间跨度也不够长，为进一步了解广西区猪流感流行的现状及其各基因片段的来源，本研究主要针对全区主要养猪业发达的各地市，采集类似SIV临床症状的组织材料进行病毒分离，扩增并分析分离株各片段基因来探究其遗传变异规律和来源，丰富分子流行病学调查资料，为我区流感监测体系提供毒株及其基因来源信息，并为我区SI防制提供参考依据。 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析第二章猪流感病毒分离鉴定第一节材料与方法2．1．1主要材料及试剂2．1．1．1样品材料及其来源2008年8月"-2010年3月间广西区及广东化州、湛江疑似SI的猪肺组织病料、气管粘液和鼻拭子。广西样品采集地包括南宁、来宾、玉林、柳州、桂林、贺州、崇左等16个县市。本研究采集样本共计375份。表2-1本研究中所采集的样品类型、数量及采集地Table．2-1Typeandamountofclinicsamplesandsampledlocationinthisreseach2．1．1．2主要试剂分子生物学试剂：Trizol、dNTP(各10mmol／L)、琼脂糖凝胶、LrNIQ一10柱式DNA胶回收试剂盒和UNIQ．10柱式质粒小量抽提试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司；TaqDNApolymerase(5U／止)和DreamTaqDNApolymerase(5U／此)购自Fermentas公司；M-MLVReverseTranscriptase(200U／lxL)购自Promega公司；LATaqDNApolymerase(5U／此)和RNasin酶抑制剂(40U／此)购自大连宝生物公司；DEPC为瑞兴化学有限公司产品；氯仿购白天津市北方天医化学试剂厂；异丙醇购白天津市博迪化工有限公司；无水乙醇购自成都市科龙化工试剂厂。细胞培养试剂：DMEM培养液为Hyelone产品；胎牛血清为杭州四季青产品；PBS为福建迈新生物技术开发有限公司产品；O．22岫针头式滤器为Millipore公司产品； 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析2．1．1．3鸡胚9．11日龄SPF鸡胚购自济南斯帕法斯家禽有限公司。2．1．1．4细胞MDCK细胞由广西壮族自治区疾病预防控制中心惠赠，由本实验室保存。2．1．2仪器设备细菌恒温培养箱：上海跃进医疗器械有限公司；漩涡振荡器：江苏麒麟医用仪器厂；超净工作台：江苏安泰有限公司；恒温水浴锅：上海齐欣科学仪器有限公司：电泳仪：北京君意东方电泳设备有限公司；移液枪：Eppendorf和Acura公司：电动仪器枪：Gilsom公司：PCR仪：BIO．RADS1000Thermalcycler；凝胶成像系统：上海天能科技有限公司；超低温冰箱：ThermoForma公司；倒置荧光显微镜：Nikon公司。2．1．3临床样品的采集及处理2．1．3．1肺组织病料处理无菌剪出组织样品中病变明显的数个部位，剪碎充分研磨后用PBS配成1：5的悬液，冻融3次后8000r／rain离心8"-'10min，取上清液，用于RT-PCR检测；检测结果为阳性后取适量上清液过滤，并作无菌检查，一份用于鸡胚接种，其余部分置于一70℃超低温保存备用。2．1．3．2鼻拭子及气管粘液采集及处理用灭菌棉拭子涂搽有呼吸道症状病猪的鼻咽部或气管内的分泌物，放入PBS液(pH=7．2～7．6)中，在振荡器振荡5～10rain后弃去，加入适量青、链霉素，4℃感作26 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析4h或过夜感作，8000r／rain离心8rain，取上清液进行检测。阳性粘液在冰上经0．22lain滤器过滤分装到1．5rnl无菌Ep管备用。一份用于鸡胚接种，一份用于接种MDCK细胞，其余保存于--70℃备用。2．1．4技术路线1r阳性质粒、菌液测序上NCBI．BLAST检验1r序列分析 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析2．1．5病毒RNA提取及反转录2．1．5．1病毒RNA提取采用T抗zol法提取总RNA。取320pl样品(临床样品上清液、尿囊液或病毒液)至1．5InlEp管中，加入750山Trizol后剧烈摇晃混匀，静置10min，加入220lxl氯仿混匀后静置5min，12000r／min离心10rain，小心取上层500"--700山水相层至新Ep管中，加入等体积异丙醇混匀后静置10rnin，12000r／min离心10mill，小心弃去上清，加入75011175％乙醇(用DEPC处理过的水配制)颠倒几次洗涤，8000r／min离心8rain后，再次用750rtl75％乙醇洗涤，离心后55℃烘干5""10rain。加入35rtlDEPC处理过的水溶解RNA。直接保存在--70℃备用，或低速离心后置55℃水浴锅中溶解RNA以进行反转录。，2．1．5．2反转录(Reversetranslation,RT)采用一步法RT。将新的0．2mlEp置于冰上，每管加入以下反应体系成份：5×BufferdNTPmix(2．5mmol，LLl)Ulli12M—MLVReverseTranseriptase(200㈨RNasin酶抑制剂(40I-聊岫RNA加完后混匀并低速离心2S，置PCR仪或水浴锅中42℃反转录lh。直接用于PCR反应或一70℃备用。2．1．6病毒分离2．1．6．1接种9"-11日龄SPF鸡胚经常规无菌检查后，将检测为阳性的处理过的样品经尿囊腔接种9"'11日龄SPF鸡胚，O．2ml／胚，37*(2孵育，每天照蛋2次，连续观察4天，弃去24h污染死胚。将其它死亡和存活的鸡胚置于4"C冰箱4h以上，然后收集鸡胚尿囊液并测定血凝价(HA)，对于血凝阳性的鸡胚尿囊液则暂认为病毒分离阳性，并进行RT-PCR检测。无血凝性尿囊液则在SPF鸡胚上盲传两代，仍无血凝性者经RT-PCR检测阴性后弃去。2．1．6．2接种单层MDCK细胞2R叫州Ⅲ州圳叫～叫孔幻’：帖”№～筋 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析鉴于SIV对鸡胚适应性较差，故同时将0．2Inl检测阳性样品接种生长至75％～90％的单层MDCK细胞。单层MDCK细胞用PBS洗涤2次后，加入样品，37"(2吸附1．5h，期间每15rain轻轻摇晃一次。弃去样品，用PBS小心洗涤2次，加入含0．5ug／mJ胰蛋白酶的DMEM培养基。5％C02，37℃培养，每天观察两次细胞病变(Cytopathiceffect,CPE)，72h后反复冻融3次细胞，3000r／min离心8rain，取培养上清测定HA效价，并进行RT-PCR检测。无HA效价则在MDCK细胞上继续盲传2代，仍HA效价者经RT-PCR检测阴性后弃去。2．1．7SlV检测参考Fouchier[109]和WHOll101推荐的引物设计，如下：表2-2检测引物Table．2-2PrimerpairsofdetectionforinfluenzaAvirusP咖啊胁啪rdM眦峭．3·)触蹦I吲弘，)Eq耐一M-M52e：5'—mCTAACCGAGGTCGAAACG-3’M2豁k5’-AGGGCAll广rTGGACAAAKCGTeTA-3’244MbM∞F2：5'-ATGAGYCl-rV'rAACCGACGTCGAAACG,-3’M264lU：5'-TGGACAAANCGTeTACGCTGCAG-3’244PCR反应程序为：95℃5min95℃30S45℃(PrimerMa)or50℃(PdmcrMb)72℃30S42cycles30s72℃10min退火温度为50℃(PrimerMa)／52℃(PrimerMb)，取样品cDNA进行PCR反应，反应体系如下：25山反应体系10×BufferdNTPmix(2．5mmol／u1)Primcr1Primer2Taqpolyrnerase(5U|mCDNAddH202．5m0．25山0．5m0．5山O．25山2．5山补足至25m 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析2．1．8病毒全基因扩增和克隆2．1．8．1病毒全基因扩增取分离株的RT产物扩增各个片段全基因，50山反应体系和引物如下：50山反应体系10×BufferdNTPmix(2．5mmoⅢ)PrimerlPrimer2Dream／LATaqpolymerasecDNAddH205．0ul0．5u11．0LLl1．0uJ0．25／0．5LLl5．0ul补足至50山参照Hoffmann[川】、Li[1121、Zhou[1131发表的引物，送上海生工合成，并参照其PCR反应程序：表2-3全基因扩增引物Table．2-3Primerpairsofamplificationforentiregenome2．1．8．2凝胶电泳取10山PCR产物加入1．2％琼脂糖凝胶(含EB替代液)，在130V电压下电泳30--- 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析40rain后，在凝胶成像系统中观察或切下含目的带的胶块。2．1．8．3基因克隆从含目的带的胶块中回收DNA，操作按UNIQ．10柱式DNA胶回收试剂盒说明书进行，最后用35山ElutionBuffer溶解DNA。目的基因的连接：将纯化后的产物与pMDl8．T载体连接，按以下体系操作，4℃或16℃连接6h以上。，pMDl8一TVeetor(50ng／p1)PCR胶回收产物LigationSolution10．8山4．2～4．5山5．0pl转化：从超低温冰箱取出感受态细胞，立即冰浴10min。将连接产物放入感受态细胞中(100叫管)，轻轻旋转混匀，冰浴30min。42"C热休克120s，立即冰浴3～5rain，期间不能摇动Ep管。然后加入890山普通LB培养基(Amp一)，200r／min37"(2恒温振荡3h。用无菌弯头玻棒铺菌器将100m菌液和50山Amp混合物涂布于LA平板，16～18h后挑取疑似阳性单菌落至含50mAmp的4IIll普通LB培养基，37"C振荡培养6～8h后进行质粒提取，或4℃保存。质粒提取：操作按UmQ．10柱式质粒小量抽提试剂盒说明书进行。重组质粒PCR或酶切鉴定：使用1～2IIl质粒作为模板进行PCR鉴定；根据实际情况选择限制性内切酶进行酶切鉴定，加入各成份后混匀低速离心置37℃3h以上。酶切鉴定按以下体系进行：ddH20TangoBufferBamHI／KpnI／SacI|EcoRISalI／矗．枷质粒3．4山1．0山0．3山5．0山10山电泳后在凝胶成像系统中观察结果。2．1．9序列测定、分析处理2．1．9．1序列测定将鉴定为阳性的质粒、菌液；或用无菌接种环粘取阳性克隆菌株，穿刺接种于Amp—LA培养基中(倒在1．5nllEp管)，37"(2培养过夜，送上海生工或北京诺赛测序。3l 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析2．1．9．2序列分析处理糖基化位点分析网站http：／／www．expasy．org／tools／scanprosite／；流感病毒参考序列下载网站：流感病毒资源中心流感病毒序列数据库网址http：／／www．ncbi．him．nih．gov／genomes／FLU／Database／select．cgi?go=database；应用LasergeneDNAStar7．1软件包拼接并编辑所得序列，在NCBI(BLAST，megablast；http：／／www．ncbi．him．nih．gov／)上进行检索确认，E值<10巧则认为是同源性显著。测序序列用Lasergene7．1软件包EditSeq程序编辑后，经ClustalW(1．83版)多重序列比对后。本研究中使用Lasergene7．1软件包MagAlign程序进行分离株和参考株序列的同源性分析，用MEGA4．1beta软件来构建系统发育进化树进行评估【114】。在MEGA4．1beta中，使用的进化树构建模型是Neibof-Joining法【1151，核酸进化使用MaximumCompositeLikelihood法评估【1141。内部节点通过自举(Bootstraping)1,000次重复进行评估置信值。第二节病毒分离与鉴定2．2．1病毒分离及HA效价在所采集的375份临床组织样本、气管粘液和鼻拭子样品中，通过RT-PCR检测出的阳性样品共35份，经鸡胚尿囊腔接种及MDCK细胞分离病毒，观察到接毒72h细胞出现CPE(如图2．1)，尿囊液或细胞上清液经常规微量鸡红血球凝集试验检测HA效价，RT-PCR检测为阳性，2株分离株初步鉴定为SIV，具体如表2_4所示。表2-4分离株分离接种及血凝效价情况Table．2-4IsolationandHAofSIVisolatesl南宁2来宾3北海4玉林5祟左6贺州A／列viBe／C_nnmgxi／NNON3／2009(H1lq2)GN3A棚豫—GII柚群i，IBl44，2009(mNl)LBl44■■__-一●-。_-一32l343¨=：二二 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析2．2．2GN3株全基因扩增与克隆图2．1GN3和LBl44株在MDCK上的细胞病变(72h)Fig．2-1啊他CPEofGN3andLBl44virus011MDCK(inoculatexi72h)采用Hoffmann[1111、Litll21、Zhou[1131发表的引物及PCR反应程序扩增分离株的各个基因片段，基因扩增或酶切情况如图2．2所MlPANPMNS№不oM1』L卫 2010年广两大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析M1图2-2GN3分离株各基因片段扩增或酶切鉴定Ml：MarkerkM2：D2000．图C中PB2基因为分两段(PB2．1、PB2-2)扩增克隆Fig．2-2AmplificationoridentificationofallsegmentsofGN3vil'l娼M1：MarkerⅫM2：D2000．Fig．CpresentedamplificationoftwofragmentofPB2．2．2．3LBl44株PB2、NP、Nh、■、NS基因扩增与克隆采用Hoffmann[川1、Zhou[1131发表的引物及PCR反应程序扩增分离株的各个基因片段，基因扩增或酶切情况如图2．3所示。M2NS盐M2图2．3LBl44株PB2、NI'、NA、M和NS的扩增或酶切鉴定图MI：MarkerkM2：D2000．图A中PB2基因为分两段(PB2．1、PB2．2)扩增克隆Fig．2—3AmplificationoridentificationofallsegmentsofLBl44vi础Ml：MarkerkM2：D2000．F远．CpresentedamplificatiOiloftwofragmentofPB2 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析2．2．4分析与讨论扩增分离株的基因，经NCBI．BLAT检验可以确定GN3株和LBl44株的亚型情况，GN3株为H1N2亚型SIV，LBl44株为N1亚型SIV。本研究在375份临床材料中检测出35份SIV阳性样本，并分离到2株SIV，总分离率为0．53％，阳性率为9．33％，阳性分离率为5．71％。与近期Liu等【69】在中国部分地区的分离率相当。分离株的样品来源为气管粘液和鼻拭子，而非肺组织，可能与这些组织所含病毒量有关，处于排毒期时肺、气管、支气管及鼻腔等呼吸道组织器官会大量分泌粘液，其中含有丰富的病毒粒子。在肺组织悬液及其气管粘液的RT-PCR检测偶见后者为阳性，前者为阴性的结果，原因可能是在肺组织研磨的过程可能会使病毒量减少，也可能与剪取肺组织的部位有关。因此，提示气管粘液和鼻拭子类样品可能比肺组织悬液的病毒分离成功率会高一些。本研究所采集样本的地点分布于广西9个地级市15个县市，具有比较广阔的采样点，具有一定的代表性，研究结果对广西区SI的监测、防控起一定的辅助作用。35 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析第三章GN3株全基因遗传进化分析第一节全基因序列测定及NCBI—BLAST分析测序序列经拼接编辑后，在NCBI．BLAST比对验证，结果如下：表3-1GN3株8个基因片段NCBI—BLAST结果与来源Table．3-1NCBI—BLASTresultof8fragmentsnucleotideacidsequenceandoriginofthesefragmentsofGN3virusA／swine／GuangxVNNGN3／2009(HIN2)基冈片段基因溯源同源性最高的毒株同源性GenBank注册号PB2AvianA／swine／HongKong／NS623／2002(H1N2)’97．5％GQ229369PBlHumanA／swine／HongKong／NS623／2002(HIN2)97．3％GQ229364PAAvianA／swine／HongKong／915／2004(H1N2)97．2％GQ229272HASwineA／swine／Hainan／1／2005(H1N2)97．9％EF556203NPSwineA／swine／HongKong／NS623／2002(H1N2)98．1％GQ229366NASwineA／swine／l-IongKong／NS623／2002(H1N2)96．2％GQ229370MSwineA／swine／HongKong／NS623／2002(H1N2)98．7％GQ229367NSSwineA／swine／I-longKong／NS623／2002(HIN2)97．7％GQ229363同时证实GN3株为H1N2亚型猪流感病毒。第二节PB2基因分析3．2．1PB2基因序列分析重要位点(毒力因子)PB2基因的637aa被认为起决定宿主范围的作用‘116"1，而701aa被认为与促进PB2蛋白和输入蛋白伍相结合有关，也是流感病毒的毒力因子之一【117‘11引。从推导的PB2基 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析因氨基酸序列发现，其第627、701位分别为E(Glu)、D(Asp)。l。．。。1．．．．芏。．．。1．。。。芏，。．．I。．．。芏．．．．I．。。l芏。．。．I。．．，望．1。．1．．．．望。．1。1．。。．芏．．．。1．．．．望。．．．1。。．．翌。。．．I．。．：芷∞陋WLGTF掰0：：珏LPFAsAPp∑口SRMQPSs工：哪BGS弧：隅GNS即FNY鼹A强王}IITVI嬲0A6aI。AE0pD￡∞AG琵sA礼RG扎：L繇E700鳓GPALSZN￡LSmAKc礤：'棚Il二∞∞VvIlv陈RKRDSSI船黯∞A蜀墨I鼬谯：758图3-IGN3株PB2基因氨基酸序列重要位点Fig．3—1AnalysisofthecriticalsiteofPB2geneinGN3virus同源性分析与1990--一2009年间北美、欧洲和中国周边地区H1N2SIV和2009年甲型H1N1流感病毒代表株的PB2基因核苷酸同源性如下图所示：表3．2GN3株PB2基因核酸同源性分析Table．3—2NeucleotidehomologiesofPB2ofGN3virusl％北美地区欧洲地区中国及周边地区2009pdmH1NIGN3。PB283．6"96．483．2～83．782．6～96．894．8NorthAmerica：AF250131；AF455736；AF455734；AF455737；AF455735；AF455732；AF455731；DQ280221；DQ280205；FJ63831l；CY035430；CY045708；CY045580．TheEuropeanRegion：CJQl61101；GQl61160；EU053138；EU053130；GQ495129．Chinaanditssurroundingil'Ca$：AYl29163；GQ229321；EU798920；GQ405859；DQl39325；AB434333；EU798921；GQ229337；AB441177；EU798924；EU798926；GQ229377；EU015993；EU798928；FJ374512．2009pdmH1NI：FJ969516．GN3．PB2基因核酸同源性与北美地区和中国及周边地区H1N2SIV最接近，而与欧洲地区同源性较远。此外，与2009年甲型H1N1流感病毒代表株同源性较高，为94．8％。3．2．2PB2基因系统发育进化分析通过MEGA4．1beta软件构建GN3株PB2基因的系统发育进化树，如下图所示：37 P‘————————_1O．坛图3-2PB2基因核苷酸系统发育进化树◇：类人流感病毒基因；口=类猪流感病毒基因；△=类禽流感病毒基因；●=分离株基因Fig．3-2NucleotidephylogenieanalysisofthePB2genes<)=Geneofhuman．1ikeviruses；i-1=Geneofswine-likeviruses；△=Geneofavian—likeviruses；●=Geneofisolatedviruses构建PB2基因进化树，可知进化树分为4个分支：人源谱系、猪源谱系、北美禽源谱系以及欧亚禽源谱系。GN3株PB2基因位于北美禽源谱系中。与甲型H1N1流感病毒代表株A／Califonia／06／2009和A／Califonia／07／2009株同于一个分支，亲缘关系较近。38 第三节PBl基因分析3．3．1PBl基因序列分析PBl．F2分析PBl-F2蛋白被认为是流感病毒的毒力因子之一，定位于细胞线粒体中，主要诱导细胞凋亡‘1191。但有研究表明‘120】，在第12位氨基酸残基S突变为终止子的截短的PBl．F2可能与2009年甲型H1N1流感病毒的传染性和致病性有关。比对GN3株与PR／8／34株、1918年西班牙大流感代表株、甲型H1N1流感代表株、广西Sw／GX／13／06三重配株，如图3-3所示。可知，GN3株和甲型H1N1流感代表株一样只有截短的PBl．F2阅读框，前者在第35位氨基酸残基出现终止密码子(第105位核苷酸发生C—A的改变)，而后者则在第12位出现终止密码子；与GN3株不同的是Sw／GX／13／06具有完整的PBl．F2。GN3(PBl-F2)A—BredgMIssion-1·1918(H1N''A-California--04-2009(HINl)AopR-8—34(HINl)A-swine-Guangod--13--2006(HIN2}10203040∞面厦I疆五更三亍芦i函I’osTEHINloKIKGGGRo丁oRLIGHPsIRL蹦DIHYLRI掰Nov5I磊再霄玎MCQEQDTPWLST(3HISTOKREDGQQTPRLEHHI',ISTRLMDHCQKTHNQVVMPKHMEQEQDTPWrQ．TEHTNTQKRESGRQTORLVHPSSTRLMDHYLRIMNQVGMHKHMGOEODTPWLSTGHISTQKREDGQQTPKLEHPJISTRLMGHCQKTMI',IQVVMPKHMEOEQGTP盯QSTEHINIQKKGSGRQTQRLGHPS$TO&MDHYLRTMNQVGMI-IKH图3-3GN3株PBl．F2片段分析Fig．3-3AnalysisforPBI-F2fragmentofGN3virus同源性分析与1990"2009年间北美、欧洲和中国周边地区H1N2SIV和2009年甲型H1N1流感病毒代表株的PBl基因核苷酸同源性如下图所示：．表3-3GN3株PBl基因核酸同源性分析Table．3-3NeucleotidehomologiesofPBlofGN3virusNorthAmerica：AF250130；AF455728；AF455726；AF455729；AF455727；AF455724；AF455723；DQ280222；DQ280206；EU692897；FJ638312；EU692903；CY045613；CY045581．TheEuropeanRegion：DQ836179；GQl61161；EU053139；EU053131；GQ495130．2009pdmH1NI：GQ229354；AYl29162；GQ229308；EU798900；GQ405858；39 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析ChinaanditssurroundingareaslDQl39327；CRQ229332；AB434334；EU798902；AB441176；EU798904；GQ229372；EU015992；EU798908；FJ374513；GQ229340．2009pdmH1NI：GQ377049．由上表可知，GN3株PBl基因与北美地区H1N2SIV的PBl基因核酸同源性普遍很高，而与欧洲地区H1N2SIV关系较远。说明GN3株PBl基因与北美地区H1N2SIV的关系密切，推测GN3株PBl基因来源于北美地区H1N2SIV。 20lo．芏广堕查堂堡圭丝茎￡堕垄鎏壁堕耋坌塞墨全茎里壁型坌堑———-—_———_———___—__-'_—-_—-__●---_—__●_-—___-_—●—●_——●—--_____-—————————————————一一3．3．2PBl基因系统发育进化分析图3—4GN3株PBI基因核苷酸系统发育进化树reassortantHuman◇=类人流感病毒基因：口=类猪流感病毒基因；△=类禽流感病毒基因：●=分离株基因Fig．3-4NuclcotidephylogenicanalysisofthePBlofGN3virus<>=Geneofhuman-likeviruses；口=Geneofswine-likeviruses；△=Geneofavian-likeviruses；●=Geneofisolatedvirus41 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析构建GN3株PBl基因系统发育进化树，由图可知PBl基因进化树分为4个分支：禽源谱系、“三重配SIV株”人源谱系、H1N1人源谱系、猪源谱系。GN3株和2009年甲型H1N1代表株的PBl基因同处在“三重配SIV株"人源谱系分支上，亲缘关系较近。第四节PA基因分析3．4．1PA基因序列分析同源性分析与1990"'2009年间北美、欧洲和中国周边地区H1N2SIV和2009年甲型H1N1流感病毒代表株的PA基因核苷酸同源性如下图所示：表3-4GN3株PA基因核酸同源性分析Table3-4NeucleotidehomologiesofPAvirus％北美地区欧洲地区中国及周边地区2009pdmHINlGN3．PA81．9"-95．984．5～86．180．6～97．194．0NorthAmerica：AF250129；AF455720；AF455718；AF455721；AF455719；AF455716；AF455715；DQ280223；DQ280231；FJ638313；CY035432；CY045622；CY045582；CY045526．TheEuropeanRegion：AJ311207；AJ311205；AJ312838；AJ311210；GQl6t103；AJ311209；C,Q161162；EU053140；EU053132；GQ495131．Chinaanditssurroundingareas：AB434415；AYl29161；GQ229351；GQ229368；CJQ229312；EU798880；GQ229272；GQ405860；DQl39326；AB434335；EU798882；GQ229336；AB44117；EU015991；GQ229376；EU798888；FJ374517；CJQ229344．2009pdmH1NI：FJ969515．由上表可知，GN3株PA基因核酸同源性与北美地区和中国及周边地区H1N2S1V最接近，而与欧洲地区的同源性较低。此外，与2009年甲型H1N1流感病毒代表株同源性较高，为94．O％。42 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析3．4．2PA基因系统发育进化分析构建GN3株PA基因系统发育进化树，由图可知PA基因进化树分为3个分支：禽源谱系、人源谱系和猪源谱系。AvianEmropeanAvimnSwine图3．5GN3株PA基因核苷酸系统发育进化树◇=类人流感病毒基因；口=类猪流感病毒基因；ZX--类禽流感病毒基因；●=分离株基因F远．3-5NucleotidephylogenieanalysisofthePAofGN3virus◇=Ge鹏ofhuman-likeviruses；I-'I=Geneofswine-likeviruses；△=Geneofavian-likeviruses；禽源谱系中有一个较为特殊的分支——欧洲型禽源谱系。GN3株与广西分离株A／swine／Guangxi／13／2006株、甲型H1N1流感病毒代表株A／California／07／2009株同时位于禽源谱系中，但都不在欧洲型禽源谱系上，属于北美禽源谱系。于此不同的是A／swine／Zhejiang／01／2007株则在欧洲型禽源谱系中。43 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析第五节HA基因分析3．5．1HA基因序列分析糖基化位点在糖基化位点分析网站上分析GN3株HA基因的推导氨基酸序列可知，其潜在的糖基化位点共有7个，分别位于11．13aa(-NST-)、23—25aa(-NVT一)、87—89aa(-NGT-)、274．276aa(-NCS．)、287．289aa(-NTS．)、481-483aa(-NGT-)和540-542aa(-NGS-)，其中后两个位于HA2区，如图3-6所示。裂解位点GN3株的HA裂解位点位于HAl推导氨基酸第327位的Asp残基上，基序为：“PSIQSRIGLF"。与所采用的参考株基序一致，如图3．6所示。抗原位点如表3．5所示，HAl区抗原位点共有5个区域：Sa(124，125，155，157，159，160，162，163，164)；Sb(153，156，189，190，193，195)；Cal(166，170，179，204，237，271)；Ca2(136，140，142，221，222)；Cb(70，71，73，74，75，115)。GN3株的Sa区为(PNGS_．PKSKS)，Sb(KNQSQA)，Cal(VGI溲)，Ca2(PGSRD)，Cb(些AS鲤)，其中粗体下划线处残基为推导的保护性抗体结合位点。 2010年广西大学硕士论文广两猪流感病毒分离及全基因序列分析GN}H^^于R·8—1934IHlHl】t-,-Bre．191．hssion．1．1&Hlrlll&．-Cald'omla-04．2009qHlrH】～s^lne-loca-11—30tHlrJl：¨●e^Jerse．-8．1976IHitJ1：上rs州ne．BeI鲫um．1．83lH'r11；‘seme—Zhejzang-1—2007'HItll)^皓埘ne．Gu钟渺13·2006IHlrl2)GN}H^^rPR·8·1934tHINl)A-Bre．191．1lsslon．1-1B,HlrJllA-CalrtornJa-04．2009=H1lJl)A-s削ne—Io^a-11．30lHltJ1：A4'Je^Jerse．一8．19"r5jHllll】blv-S^111e-Belf；lum-1．83IHlHl：^．s*me·Z11e,ang-1-2007jHlill】¨帅ne-GIJ钠必13-2005tHlt,12)GN}H^坤R-8·1934．tHltllj肆目re．t91．hsslon-1-18fHlNllA-Callfom=a-04—2009】H1tll：^．s削ne一口^a．11．30}H1rJ1：¨|e^Jerse．岳1976IHllll】‘s^1ne-8eIoIum．1．83tHIill：Ars^tne—Zhepang一1．2007【H1r,11j—§wlne-Guangnl3-2005(H1|垃)G，●}H^伸R·8—19弘H1N1)Jb-gre．'91．hgslon-'．1自H1N1)^rCaI—Omla—04—2009,H1U1)．rsd,lne-Iod-a-1苎．30rHltJl：^-Ue*Jerse～8197昏H1ril：^rs^价e-8elg)um·1．83lHltll：&-shine—ZneJl3Ng-1·200'7rHltll)A-smne-GuangxPl3-200自Hltl2JGN3+I^^．PR·8-193舢H1N1】～-Bre．191．fission·1．18IHlNl)^-Cal们m●a·04．2009lHlrll】A-S_,lne·IO^a-11．30=H1rll：A-tJe^Jerse．·8-197目Hlt|1：^-s,,dne·Belgmm-1．83lHlHl：A-s,～tne—Zhepang-1—2007IHllll】‘s朋n“扪口耻13-2006tHlN2)GN}H^钟只．8—1934lHlNl：戽弓re．191．1zss=on．1．18IHlNlIA-Calfforma-04-2009lHlUljA-s^me-toea一11-30,H1fJl：Jdle^Jerse．-8．1975rHlUl：^．sMne—Belgmm．1．83IHlill：^-s州ne—Zhejvang．1·2007H1111：^．s州怕．Gu加渺13·2006(Hlt投)HAi—DTLCIGYH^t■巧TDTVDTVLEK}|vTVTHS’，r也LEDS坩●GKLCKLRGVAPLQLGKCⅫ^GW102030405060．．．．．．．．．．．．RHV．．．．．RKI．．．．．K．I．．．K．．．．．．．．．．．H．R¨NR．．VN．，V22口2292均些咝塑!：!!!!兰堕!!{墨!塾坚塑堕g!塑!!Q!!；￡墼坠塑!!{!￡壁鱼!!坚70∞100110120■■■_1■}—■■■—■—■■t■■1F，■■■■_‘■■■一4∞PPVR．．．．．．P．E．I．．．E409．．．．．．．．．．．．．．．．．E．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．K．．．409I．．，．．ES3．．．．．．．PS．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．409I．．．．-．．．V．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．K．．．．．409．．．．．．．E．．．．V．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．N．．．．．．．．．．．．．．．．．．．409I．．．．M．．．．I．．．．EE．．．．．．．．．．A409I．．．．K．．．N．．．．．I．．．．．K．A．．E^．．．．K．．．．T．．．．．．．．A409．．．．．ES．F．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．409§曼!兰釜!!墨垒正丛c毒H^&§sFY褂u些，氛：怨Y；：L：：§Y?川K&EvLvL时H皇曼翌堡坚骂强正盐翌坠鞋§§!!塑兰￡甚丛!塑堕!：；!!竖!：!苎坐挲E∑k!k堕!掣130140150170180●■■■—■■■■—百■■1’■■■■●■■r■t■■-L∞9．．-．．NG．．．．SEK．．．．．．TEEG，．NKN．．．．K．．．．．．．．．．589．．．．．，TK．．．．．SY．．．．．．T．3．．．．．．．V．589．．．．．DSK．．．．K．．．K．．I．．．．，．．．．．．．ID．．．．．．．．．589T．．．．．．Y．．．．．．．．E．．．．．．．．．．．．．．．．．．．V589．．．n．．．．．．．．．．．YM．．．I．．．．．．．．．．，．．．．．．．．．．E89H．．．．．．TK．I．．．．SYSTR．．．．．．I．．RE．．．．．．．．．．T．．．．．．．II．V．589T．．．DT．TV．．．8．H．．．．．．．I．．．．．．，．．．．．．．T．．．．．．I．．V．589．．．．D∞．．．．．．．．．．．H，．．．．I．．．．．．．．．．．．．I．．．．．．．．．．．．．．589190200210220230240■F百■■—■■1■右葡’1蔫^■■■—《—了鼍■■●—F—-_L769．sN崛N．．．EN．．．．．vTH．．．．．．．耳‘．．．i．．H}．．．．．．K．．．．．769．．．Gn：．．．．．．．．11．．}：』}．．．．．．．．．．．769．．s．jI．I．．T．．F．．．．RSKKK．．IiI．．．：蚓I．．．．．V．K759TI}．．．．．．．．．．．．．D．．．．．I1．1GH：．769，n}．．．．．．．．．F．．．．．．．．K．K．．．}}}G：：lI769．．．TtL；．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．1l吲G，il．．．．．．．．OQ．．759．．D&；T．．．．NHT．．．．．．．YK．．vl}．．tS¨}．．．．．．．．DO_．．769丛．．．．．．．．．．．F．．．．RSKKK．．TI}．．．1．¨}．．．．．．．V．．K．769●TFEATGNLvvPRYAFALNRGSGSGIISD&,PvI-'IDCNTKCQTPKGAINSSLPFQNIHPVTI2502602702802903∞．．愀N．S．T，．．T949I．．．M．I^■8F．．．T．NS■E．．．．．．L．．．．．．．．Y．．．．．．．949．．．．．．IA性．．．．．．T．．．．．．．．．．．．H．．．．．．．．．．，．．．949．．．．．．．．．．．．．．．．I．NA．．．．．．．．T．．．．．．．T．．．．．．．．T．．．．．．．．．I．．949．．．^．．．．．．．．．E．．．．T．．．．．．．0。．．．H．．．．．．．．．949．．．．．．．．．．．．．．■．．T．．．．．．．．．949．．．．．．．．IA惶．KTND．．H．L．．．．．V．I949．．．I小KKM．Me．0NT．．．H．LKM．．．．V．．．949．．．．．．．．．．．．嗽¨．TS．．T．T．．．．．．．．．．．¨9310320330340350360．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．1129．．R．A．．．．V．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．1129．．．．．．．R．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．1129．K．．．．．．．．．．L．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．V．．．．．．．．．．．．．．1129．．．．．．．．．．．V．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．L．．．．．．．．．G．．．1129．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．1129．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．V．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．1129．．．．．．．，．．Q．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．'129．．．．．．．．．．．．．．．．．．．V．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．1129图3缶GN3株HAl推导氨基酸序列的主要功能位点分析l：裂解位点；-：Sa；◆：sb；▲：Cal；△：ca2；●：Cb；红色下划线：受体结合位点；绿色下划线：抗原位点中推导的抗体结合位点；受体结合位点关键残基：红色线框．Fig．3_6ThefuactioaalkeysiteofHAlaminoacidscqucaceofGN3virlJIS45H●●KGNRS 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析表3-5GN3株与代表株HA抗原位点差异性分析Table．3-5AntigenicsitesdiversitybetweenGN3virsandthereferencesGN3PNGSPKSKSKNQS09lxlmPNGSPKSKSKNQS1918PNGSPKSKSKSQSGXl3PDGSPKSKSKNQSPR8PNESPNKNSEGQNCalCa2Cb受体结合位点GN3株与参考株中的PR／8／34株、A／BrevigMission／I／1918(H1N1)株(西班牙流感代表株)、A／California／04／2009(H1N1)、A]Sw／Guangxi／13／2006(H1N2)株的受体结合位点都很保守(如图3-6所示)。除Sw／Guangxi／13／06株的190位(对应于H3亚型HAl位置，在H1亚型HA的位置为第187位，以下同理)为N外，其余受体结合位点关键残基均为190(D)、220(R)、225(D)、226(Q)、228(G)。同源性分析与1990"-'2009年间北美、欧洲和中国周边地区H1N2SIV和2009年甲型H1N1流感病毒代表株的HA基因核苷酸同源性如下图所示：表3-6GN3株HA核酸同源性分析Table．3-6NeueleotidehomologiesofHAofGN3virus％北美地区欧洲地区中国及周边地区2009pdmHINlGN3．HA76．5～92．274．9～76．986．4---97．989．9NorthAmerica：AF455680；GU289665；AY060052；AF455676；AF455681；AF455675；EUl39830；EUl39831；EU053133；EU053141；CY041903；FJ638314；CY045639；CY045535；GU480919．TheEuropeanRegion：AM920737；GQl61163；GQl61143；GQl61145；GQ495132．Chinaanditssurroundingai'ess：GQ229348；AYl29156；GQ229365；AB294217；GQ229309；AY377936；EU798780；GQ229269；DQ447187；GQ405861；DQl39320；EF556201；EF556203；46 2010年广西大学硕丝塞．￡堕堕堕壁堕墨坌塞丝全苎里壁型坌塑—●-—_-__-I_—●●—--l———-_--●_●_●_-●----_--I____------_●___-____●--_-__-__●___--—_--●●—-——__—-—-——__—-_——————一一GQ229333；EU798781；DQ666933；EU296607；AB441170；EF556199；GQ229373；EU798784；EU798786；EU798788；FJ374511；AB514930；GQ229341．2009pdmH1NI：GQ280797．由上表可知，GN3．HA基因核酸同源性与北美地区和中国及周边地区H1N2SW最接近，而与欧洲地区的同源性较低。此外，与2009年甲型H1N1流感病毒代表株同源性相对不高，为89．9％。3．5．2HA基因系统发育进化分析通过MEGA4．1beta软件构建GN3株HA基因的系统发育进化树，如下图所示：卜——一O．∞图3．7GN3株HA基因核苷酸系统发育进化树◇=类人流感病毒基因：口=类猪流感病毒基因；△=类禽流感病毒基因；●=分离株基因47 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析Fig．3-7NucleotidephylogenicanalysisoftheHAofGN3virusO=Geneofhuman-likeviruses；口=Geneofswine-likeviruses；△=Geneofavian-likeviruses；●=Geneofisolatedvirus为了追溯GN3株HA基因片段来源，本研究选取世界各地分离的主要代表株，并查寻相关参考的HA基因片段来源，构建HA基因系统发育进化树(图3．7)。从图中可知，H1亚型HA基因进化树分为3个分支：猪源谱系、人源谱系及禽源谱系。其中，GN3株HA基因位于猪源谱系流感病毒群中。从HA基因进化树来看，GN3株HA基因与海南株亲缘关系最近，与NCBI．BLAST情况相符。GN3株与A／swine／Guangxi／13／2006(Sw／GX／13／06)相比，和甲型H1N1流感病毒代表株A／Califomia／07／2009(H1N1)的亲缘关系较远，但这三个毒株的HA基因都同位于猪源谱系。第六节NP基因分析3．6．1NP基因序列分析与1990"--2009年间北美、欧洲和中国周边地区H1N2SIV和2009年甲型H1N1流感病毒代表株的NP核苷酸同源性如下图所示：表3■GN3株NP基因核酸序列同源性分析Table．3-7NeucleotidehomologiesofNPofGN3virus％北美地区欧洲地区中国及周边地区2009pdmH1N1IGN3-NP82．8～97．182．4～83．983．9""98．194．9NorthAmerica：AF250127；AF455704；AF455702；AF455705；AF455703；AF455700；AF455699；DQ280225；DQ280233；DQ280209；FJ638315；CY041904；CY045624；CY045584；CY045528；CY045536．TheEuropeanRegion：AJ307074；AJ307062；GQl61105；AM920739；GQl61164；EU053142；EU053134；GQ495133．Chinaanditssurroundingareas：AB434417；GQ229349；AYl29159；GQ229366；AY623836；48 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析GQ229310；EU798840；GQ229270；GQ405862；DQl39324；AB434337；EU798841；DQ666928；GQ229334；EU850624；EU850621；AB441173；GQ229374；EU015990；FJ374515；AB514931；GQ229342．2009pdmH1NI：FJ969512．由上表可知，GN3株HA基因核酸同源性与北美地区和中国及周边地区H1N2SIV最接近，而与欧洲地区的同源性较低。此外，与2009年甲型H1N1流感病毒代表株同源性较高，为94．9％。 20103．6．图3．8NP基因核苷酸系统发育进化树◇=类人流感病毒基因；口=类猪流感病毒基因；△=类禽流感病毒基因；●=分离株基因 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析Fig．3。8NucleotidephylogenicanalysisoftheNPgenes◇=Geneofhuman—likeviruses；口=Geneofswine—likeviruses；△=Geneofavian-likeviruses；●=Geneofisolatedviruses构建NP基因系统发育进化树，由图中可知NP进化树分为5个分支：早期猪源谱系、近期猪源谱系、早期人源谱系、近期人源谱系以及禽源谱系。GN3株NP基因位于近期猪源谱系分支，且与广西、海南、上海以及韩国分离株关系密切。而甲型H1N1流感病毒代表株也处在近期猪源谱系上，但与GN3株关系稍远。第七节NA基因分析3．7．1№基因序列分析糖基化位点．在糖基化位点分析网站上分析GN3株NA基因的推导氨基酸序列可知，其潜在的糖基化位点共有6个，分别位于62．64aa(-NTr-)、71—73aa(-NTl’-)、87—90aa(-}wvs．)、147—149aa(-NDT-)、201-203aa(-NAT-)、235-237aa(-NET-)。耐药位点分析GN3株NA基因长度为1413bp，共编码470个氨基酸，与甲型H1N1流感代表株(A／California／04／2009)、广西Sw／GX／13／06三重配株以及A／swine／Hainan／1／2005(H1N2)株相比，在第55位插入了1个氨基酸残基(E)。10如，0∞％蚰Ⅺ∞蛐'∞r5xD群siR厶s置G锄工wvTR主bwscDPHxcYoFAL∞B?TL埒snE矗DTv苴DR2P强tLtⅫELGvpNATAS：IYDGRLVDSIGSWSKKlZ盘2Q￡SZC研=：眦量C?y懈D6S^SG怠矗册置zLFz￡￡G，口VE工SPL】GSAQHVEZCSCYPRypG絮RCVCRENWK6S冀300RGDRSGYSGIFSVEGKHCI煎Cl啊ELZ氛GItKOZT毫可■■?SHSZVVFcGfSGtYGTGS曩PDRADi冀：脚I．471图3-9GN3株NA基因氨基酸序列Fig．3—9AminoacidsequenceofNAgeneofGN3virus51 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析相对于甲型H1N1流感代表株的氨基酸序列，GN3株第274位氨基酸残基为H(His)，第294位为N(Asn)；而第119位为E(Glu)，第292位为R(Arg)。抗原位点及唾液酸结合(册)位点分析NA蛋白头部区的五个可能的其抗原位点(328"--'336aa，336～347aa，360"--370aa，400"-．-403aa和431--．-434aa：对应于GN3株的329"-'337aa，337"-'348aa，361"一371aa，401～-404aa和432--一435aa，以下同理推导)如下图所示：G．．D．^．FT．．OD．RK．8i：：：．}玉：：!!：譬：．．}GlG．L．．．．．E．．．．．LQA．．’00519-s朋ne．hana口a^a．2·19781HI比-,-00618·5*lnG-Ehlme·I·1980,H1t12’-．-05131·s,～me41agasa)l-1．1989,Hlt拉j-H02’82-s^,ine-Sa怕m8-1995cHlU2；辱03=-7二·s枷e．[Ji．a伊一!-2003[H1H2：：-G49522-$^lne圳I．a二a¨·1-2006HItl2l-483393-s朋ne．T0cnI口I．I-2008．H1『J2可口弱翻n五鬲F而磊F日曩只巧卫硼2^CE7’989一s,',Ine-korea．4-10ngscn92·20041H1N^CE-rY990-selne^orea-JL01-200=-一H1t12：lJBr．．3．t2505*lne-korea-S1：·2305Hltl2，ACE??997·s棚ne．kOrea·CY08-200"trHltJ2：^CR839v5·s^me-Hongkon941$623-2002,H1N2^C只83969-5^,lne-Hongkong-"78．2003fHltl2：ACR83964-s*me-Hcngkong·91j．2004-H11'12：JkCR83972-s州ne州0n口keng-'152—20吒1HItl2)&CR839"r，·sMne-Hongkong-1110-2005lHltl2】^DG08233-s．me-Hongkong·143=-·2009‘H1IJ2：^DG083：2·$朋t3e—Hongkorig-2314-2009-Hltl2：^D60847=-·s*lne-HongK0ng-tISl889．2009,HIN^8D81120-5=～lfle-Tat．an·C093j．2004*H11'妲：ACT97059-s村ne—Tlanpn·1·2004,H1U2：：^^Z79393-s削ne．Zheyang-1-2004．H1U2j蛆042447·s朋ne‘uan口日-17-200=-IHIt|2"AB0．：2449-S棚ne4-1aman-1—200．=IHlfJ2：：^B04244=-．s^lne．Guang--13·2005rH"12))ACl．：．875A．s_nne—Shan口hapl·2007(Hltl2)口J34／～pro：SDII．．．．．．R．R．．．．．．．．．．．3T．．．．．Sl舯J竹R．．．．．．●+‘‘●‘●●●●’●‘‘‘●‘-●-TT．．．．．ISD¨^R．．．．．．．，．．．，．．，．．T．T．．．．．IIDlM．．I．．．．．．．．．．．．．．．．‘，．艮．．．．．．．．．．．．．．，．．8．T．I．IS3¨．．．．．．．．．．．．．．．．．．．E．R．．．．．．．．．．．．。．ST．．．I．ISllI'I．．．．．．．，．．．．．E．R．．．．．．．．T．T．．I．aⅢ●．．．．．．．．．．．．．．，．．．．￡．。RL．．．．．．．．．．．．．．．．1．．．．．．．．．．．．．．：．，···-·-··Lt·．．．．．．．．．．．．．．．．．．．：．。I．．．．．．．．．d。．．’，．．．．．．C．．．．．．．．．，．．．．．．．‘．●●‘●●●。_·‘●●c●‘．．⋯．．．．。．G．．．．．．R．．．．．．．．．．．．．i⋯．．．．．．．．．^D。。’‘‘。‘‘‘‘‘‘‘‘‘。‘。。‘‘p●●．．．．．．．．．．D．，⋯．．．．丘．．．．．．RG．．．．．．．．．．，．．．．L，。．T．．．．．．．．．，‘．N3．8SII．．．．．．．．．．．．，．R毫．．．．．．．．．．．．．．．．．1Gt1。。‘’。’‘’‘‘‘+‘+。i’‘．．．．．．．1G¨．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．L．。．．，．．．．．．．．K．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯蠢．．．T．．．．．．．GN●‘’。。‘。。。‘‘’‘’●。’‘‘‘●^●‘．T．．．．．．．：．N．．．．．．．．．．．．．．．S．．．：⋯．．．．．．．V．．．．．．．．．．．．T．．．．．．；．．。．．．．．．H．．．．．．．．．．．Li．．---00618．s^)ne．EhIme-1-1980IHlll2．．-．-06131．S^llle．tlagasah一1·1089rHlU2—H02182·s棚ne-Sailam3-1996,H1t12：．F03=-74一s州ne．I．h．ag*-!·2003*H1r12：-G-"0522一s．me_LlIa：ah·1-2006H1f垃：-J83393-S^me．T0曲删·1-2008{H1『12orea-0YUZ·Z^cE77989-s,～me-korea-Hongson92-2004(H1N^CE77990·smne-korea-儿01-200=-一H11／2：^园63425"·sMne-kore争S11·2006,H1¨2：^c￡77997．smne-korea-CY08·2007【HItl2：^cR83976-swine-Hongkong—fJ3623-2002,H1№^CR83959·s^,me-Hongkong·78·2003HIfJ2：^CR83964-s*me-Hongkong一91=--200-',H"12】ACR83972-s^,me-Hongkong·1：52·2口O三·H1r拉)ACR83077·S^lhe·Hongk．ong·”10—2006‘H1l拉：^DG∞233一$^lne-I-Iongl-,orl哥143f·2000-H11'J2j^DG083．=2．s^Ine·H0ngkong·2314·2009,HIfl2：^DG0847：·s*me4-10ngkong-I'ISl889·2009,H1N‘旧D8j120-smne·Tal^an·C093=-·2004=H1『|2)^CT97359一s,～ine-Tianjm·1．2004IHlfl2，：^Az79393·5．1r)e-Zhepang．1-2004,H1U2：^B042447·s,^lne·Guang日·仃·2D01fH"J2j)嵋Q02“9-S^,lne-Halnan-1．2005H1112：：^BQ42．o=-·s*me-Guangq一13—2005,H1『12))ACl48"z54-Sw～nlle-Sharlanat-1·2007IHlr12)G|13．t“Im；图3．10GN3株NA蛋白头部区五个可能的抗原区域(红色方形空框)及唾液酸结合位点(阴影框部分)Fig．3—10Anfigendcsites(redblankboxed)andFIBsites(shadeboxed)ofNAglobularheadregion唾液酸结合(1iB)位点位于NA蛋白367--'368aa，401---．403aa和第432aa，具体如52DD．．．．．一润 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析上图所示。相对地，GN3株为SE，GDR，Q。其中所有大陆地区的第一个HB位点都非常保守，为SE。第二个HB位点则差异较大。除了05年海南株外，第三个HB位点在所有的毒株中都为Q。这三个HB位点中，GN3株与Sw／GX／17／2005株保持一致。而在抗原位点区域与Sw／GX／13／2005株相比，只有401aa、403aa位存在差异，GN3株为401(G)、403(N)，Sw／GX／17／2005株为401(R)、403∞)。另外，由图可知，亚洲地区H1N2SIV的NA蛋白的抗原区域及唾液酸结合位点，在地域范围上存在差异和规律，总体来看，日本毒株与其它国家、地区的毒株有比较明显的差异，日本H1N2SIV之间在多处位点存在许多相似之处，且与亚洲其它毒株不同，如329(N／S)，330(D)，335(K／N)，339(R)，345(R)，347(N)，357(N)，359(D)，369(D)，370(D)，382(G)，386(T)，404(W)。同源性分析与1990---,2009年北美、欧洲和中国周边地区H1N2SIV的NA核苷酸同源性如下表所示：表3-8GN3株NA基因核酸序列同源性分析Table．3-8NeueleotidehomologiesofNAofGN3virus1％北美地区欧洲地区中国及周边地区2009pdmHINIGN3-NA9l-3～95-381．8％～87．781．3～96．1NorthAmerica：AF250126；AF455696；AF455694；AF455697；AF455695；AF455693；AF455691；DQ280226；DQ280211；FJ638316；FJ519970；CY045617；CY045673；CY045585；GU480921．TheEuropeanRegion：AJ412697；AJ412705；AJ412704；AJ412702；AJ412693；AY590829；GQl61106；AM920738；AY590826；AJ412694；AY590828；AM777822；GQl61165；EU053143；EU053135；AM777820；GQl61142；GQl61146；GQ495134．Chinaanditssurroundingareas：D29659；AB434418；GQ229370；GQ229353；AYl29157；GQ229314；AB270752；AY377935；EU798820；GQ229274；DQ447184；GQ405863；DQl39321；EF556202；EF556204；DQ666927；GQ229338；AB434338；EU798824；GQ229378；DQ666946；AB441172；EF556200；EU798828；FJ374514；AB514932；GQ229346．由上表可知，GN3株NA基因与北美地区H1N2SW的NA基因核酸同源性普遍很高，而与欧洲地区H1N2SIV关系相对较远。说明GN3株NA基因与北美地区H1N2SIV的关系密切，推测GN3株NA基因来源与北美地区H1N2SIV。53 垫!!笙￡堕奎堂堡圭垒苎￡堕堕堕堕堑耋坌壅垄全茎里壁型坌堑--_--_-_-_-_-●---____●_-__-_--___-_-_●_-●_-●__________________●__-_I_-__-__●-_l_-I-___-●-_●-_--____。__。’_’———————————————一一3．7．2NA基因系统发育进化分析N1和N2亚型NA基因进化树同样分为3个谱系：猪源谱系、人源谱系及禽源谱系。由图可知，GN3株NA基因位于人源谱系。卜—————10．05图3．11NA基因核苷酸系统发育进化树◇=类人流感病毒基因：口硪猪流感病毒基因；△=类禽流感病毒基因；●=分离株基因Fig．3．11NucleotidephylogenicanalysisofNAgenesofON3andLBl44viruses◇=Geneofhuman-likeviruses；口=Geneofswine-likeviruses；A=Geneofavian-likeviruses；●=Geneofisolatedviruses从NA基因进化树来看，GN3株处在N2亚型的人源谱系分支上，远离～C2Llif．0nlia／07／2009(I-11N1)所处的N1亚型支，所以亲缘性较远；而与Sw／GX／13／06株和Sw／Hainan／I／05株的亲缘关系较近。 第八节M基因分析3．8．1M基因序列分析耐药性位点分析GN3株M基因共有2个阅读框，分别为M1和M2。M2与Ml共享起始密码子，M1由第1"-759位核苷酸组成其阅读框，共编码252个氨基酸；M2由第1""26位、第715"-'982位核苷酸组成其阅读框，共编码97个氨基酸。172．03040506070MsLz|T￡1叮tTYVLs工VPsGPLKA已=AoRLEDvFAGKNTD乙!：A乙MEw=．xTRplLs；i：ii苫i三j；；i；；i；；=；；__-一70ERGLO腿门懋AII靖锹GDP黼黼XLYRKL聪E工T髓6A髓V乩SYSAG矗!．矗SCMGL工搬RMGT们哩140挑FG五删俚Q工ADSQ丑Rs职Q埘TTTNPz．z柏嘲蝴’z"订籼Q媛GSSEQA矗EAM酣矗SQ敞210aM工QAMRA工钌EPSSSAGI|KDDz．z-EKLQAYQKRMGVQ强QRF五．(GN3-1}期2．proIGN3-1闱2．proMa=lori婶CGN3-M2．pmOXl3-M2．proMaiorityCGN3-M2．proGXl3-M2．pro图3-12GN3株M1氨基酸序列253Fig．3—12AminoacidsequenceofMlgeneofGN3virus1020304050两瓦琵滩评IIKNG难cf(cNIDssDPLIAAAIsIlGILHL|L1wLDRLFFK石l5060708090斤丽F泛两晾IRGP8TEGVPEIsMREEYRQKQIQsAvDvDDG丽I丽可r98图3—13GN3株M2氨基酸序列Fig．3-12AminoacidsequenceofM2geneofGN3virus堕竖堕里罂型巡垡掣堕型型丛掣L壁生幽；塑生旦坠￡￡缉102030毒O50。—————————一III：I．’’’‘··t·········⋯··-···．．．．．．：．．．．．．．．．．．．．。．．．．．∞··．．⋯⋯．．．．⋯．⋯．．E．．．T．．U．．．．．．．．．．H．．．．⋯．50图3—14GN3株与Sw／GX／13株M2氨基酸序列比较∞98Fig．3·14AlignmentofaminoacidsequencesbetweenGN3andSw／GX／13vimS55 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析M2第3l位氨基酸残基对金刚烷胺类药物的敏感性起关键作用。根据推导的氨基酸序列可知，M1第41位氨基酸为A(AIa)；M2第3l位氨基酸为S(Ser)，表明GN3株对作用于M2离子通道的金刚烷胺类药物依然敏感。Sw／GX／13株与GN3株一样对金刚烷胺类药物敏感，GN3与Sw／GX／13两株广西三重配H1N2SIV的M2推导氨基酸序列存在4处差异，分别位于第24(D／E)、28(A／T)、42(I／M)、60(K／Q)位。同源性分析与1990""2009年北美、欧洲和中国周边地区H1N2SIV和2009年甲型H1N1流感病毒代表株的M基因核苷酸同源性如下图所示：表3-9GN3株M基因核酸同源性分析Table．3-9NeucleotidehomologiesofMgeneofGN3virus％北美地区欧洲地区中国及周边地区2009pdmH1N1GN3．M87．9"～96．586．5～89．388．2～98．887．8NorthAmerica：DQ280228；DQ280234；DQ280210；CY041906；CY045522；CY045714；CY045586；CY045530；CY045538；GU480920．TheEuropeanRegina：EU478802；AJ316049；AJ316052；EU478804；GQl61107；AM920740；EU478815；EU478819；EU478824；EU053144；EU053136；EU478837；EU478843．Chinaanditssurroundingareas：AB434419；AY377931；GQ229367；GQ229311；GQ229271；GQ405864；DQl39322；AB434339；DQ666926；GQ229335；EU850625；EU850622；AB441171；DQ666945；GQ229375；EU015989；FJ374518；GQ229343．2009pdmHINI：FJ969513．由上表可知，GN3株M基因和北美地区与中国及周边地区H1N2SIV的M基因核酸同源性较高，而与欧洲地区H1N2SIV关系相对较低。 }—————_O．Ol图3．15GN3株M基因核苷酸系统发育进化树◇=类人流感病毒基因；口=类猪流感病毒基因；△=类禽流感病毒基因；●=分离株基因Fig．3—15NucleotidephylogenicanalysisofMgenesofGN3andLBl44vi_rus器◇=Geneofhuman-likeviruses；r-l--Geneofswine-likeviruses；△=Geneofavian-likeviruses；●=Geneofisolatedviruses由所构建的M基因进化树可知，M基因明显分为3支：人源谱系支、猪源谱系支和禽源谱系支，前两个分支亲缘关系比较近。GN3株M基因位于猪源谱系分支上，与57 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析广西Sw／GX／13／06三重配株以及2007年上海H1N2SIV分离株关系最近，而甲型H1N1流感代表株M基因来源于欧亚类禽谱系，所以GN3株、Sw／GX／13／06株及上海H1N2SIV分离株都与之的亲缘关系较远。第九节Ns基因分析3．9．1NS基因序列分析NS基因编码NSl和NS2／NEP两个蛋白，分别由660、366个核苷酸组成，编码219、121个氨基酸。其中，NSI由NS基因编码区第1"--660位核苷酸组成，NS2／NEP由NS基因编码区第1"-'30位和第503"-'838位核苷酸组成。10柏∞4050硼7'8∞91}l∞撕n叫P敏Q熏工工GSLC订氆∞Q置iZ￡I蕊芏"rLKANFS'VIF5象l芷：mLR瓦rT￡66A工下GE工SPLP5LPG丑!D￡F订圆矸m工GGL明辩G茸T哪S￡SZ．QR200FAWRNRNEDGRSS■5P￡Q置．·-P—_．·．_P卜_-+-．_--一+220102030405060708090l∞GN3-NS2MDSNTVSSF30IU倒蛄XMOLGsssED瑙af"RFESL￡VY宣DS；GZ：vMa?GD：HY乙0SRNE鄹iRZ0乙G0＆FE己IR阿二：￡艺VR划K玉X甜搿sP芒QITP翟1．00+’_．_PpPH_．_}十十．_-卜_．_．’卜122图3．16GN3株NSl、NS2／NEP氨基酸序列Fig．3-16AminoacidsequencesofNSlandNS2／NEPgeneofGN3virus毒力因子分析NSl基因第92位氨基酸残基与流感病毒的毒力相关，通常92D为低致病性，而92E为高致病性【161。在d,g模型中，将高致病性H5N1AIV或1918年流感病毒的PDZ配体区序列替换入人流感病毒中时，人流感病毒对小鼠的毒力会轻微提古【1211。GN3株NSl基因在第220位氨基酸残基出现终止密码子TGA，所以形成截短的NSl蛋白。因此，GN3株NSl基因共编码219个氨基酸。第92位残基为D(Asp)。同源性分析与北美、欧洲和中国周边地区H1N2SIV和2009年甲型H1N1流感病毒代表株的5R 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析NS基因核苷酸同源性如下图所示：表3．10GN3株NS基因核酸同源性分析Table．3—10NeucleotidehomologiesofNSofGN3virusI％北美地区欧洲地区中国及周边地区2009pdmH1N1GN3-NS81．4,-一96．881．0～82．380．9～97．693．1NorthAmerica：AY060149；AF250128；AY060127；AF455712；AY060133；AF455710；AY060148；AY060147；AY060141；AY060135；AY060139；AY060126；AY060140；AF455713；AF455711；AF455708；AF455707；DQ280224；DQ280232；DQ280208；GQ910962；G(汐10921；CY045547；CY045587；CYD4553l-TheEuropeanRegion：AJ344034；AJ344026；；AJ344031；AJ344028；AJ344032；EU053151；AJ344039；AM920741；AJ344030；C硷161166；EU053145；EU053137；GQ495136．Chinaanditssurroundingareas-AB434420；AY377932；GQ229347；AYl29160；GQ229363；GQ229307；EU798860；GQ229267；DQl39323；GQ405865；AB434340；EU798861；DQ666929；GQ229331；EU850626；EU850623；AB441174；EU798864；EU798865；EU015988；GQ229371；FJ374516；GQ229339．2009pdmH1NI：FJ969514．由上表可知，GN3株NS基因和北美地区与中国及周边地区H1N2SIV的NS基因核酸同源性较高，而与欧洲地区H1N2SIV关系较低。且与2009年甲型HINI流感病毒代表株NS基因同源性较高，为93．1％。 3．9．2NS基因系统发育进化分析薯∞F—一O．oI杆葛145口^舟-．nI『b_a麒啪1(Ⅲ嘲一口^，9-h酣(a旧副。丫啪O小^国口^肠群洲憎瑚厅啪9(ⅢN1)————而酽口^倒删砚009(H1州)HlNlHtlmanH3N2HumanAvian图3．17NS基因核苷酸系统发育进化树◇=类人流感病毒基因；口=类猪流感病毒基因；△=类禽流感病毒基因；●=分离株基因Fig．3·17NucleotidephylogenicanalysisofNSgenesofON3andLBl44virusesQ==Geneofhuman-likeviruses；I-1=Geneofswine-likeviruses；△=Geneofavian-likeviruses；●=Geneofisolatedviru∞$由所构建的NS基因系统发育进化树可知，分为3个分支：人源谱系、禽源谱系以 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析及猪源谱系。其中，在本研究构建的进化树中，人源谱系又主要可分为3个亚支：H1N1人源谱系、H2N2人源谱系和H3N2人源谱系。而猪源谱系也分为2个亚支：古典型猪源谱系和三重配型猪源谱系。猪源GN3株NS基因位于三重配猪源谱系亚支中，并且与Sw／GX／13株、Sw／HongKong／NS623／02株的亲缘关系较近，并且与甲型HINt代表株A／California／07／2009(H1N1)和A／Califomia／06／2009(H1N1)同处一个亚支中。第十节讨论3．10．1PB2基因PB2可能通过影响病毒增殖，而被认为是流感病毒重要的毒力因子之一。在细胞培养研究中，PB2基因的第627位氨基酸残基被认为起决定宿主范围的作用【1161。目前在一些哺乳动物中，PB2Lys627被认为是病毒致病性的决定因子之一。第627位为Lys时，病毒在哺乳动物上呼吸道能有效增殖【l凋，这可能是病毒在33℃(人上呼吸道的温度)时能有效增殖的原因，相反这个位点为Glu时病毒不能有效增殖【123】。总的来说，这些发现表明，PB2Lys627能够有效地在哺乳动物上、下呼吸道有效复制，而在上呼吸道的复制是促进病毒传播的特征。事实上，K627N的转变可降低在豚鼠模型中人流感病毒的传播能力【12,q。PB2第701位氨基酸残基也被认为是流感病毒的毒力因子之一【117-1251，与在哺乳动物细胞中促进PB2蛋白和输入蛋白伍相结合有关。在对鸭源H5N1流感病毒对小鼠致病力的研究中发现，701为由D—N的突变能提高其致病力【ll刀。GN3株与甲型H1N1流感病毒代表株一样，其第627、701位分别为E(GIu)、D似sp)，就PB2基因推测GN3株可能不具备高致病性。3．10．2PBl基因与甲型H1N1流感代表株类似，GN3株只有34个氨基酸残基的截短PBl一F2。作为6l 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析毒力因子之一，PBl。F2被认为具有多个免疫原性表位，并且定位于细胞线粒体中，诱导细胞凋亡【1191。Zell等n蚓已证实，与全长PBl．F2蛋白的线粒体内膜分布相比，在细胞中截短PBl．F2蛋白具有更广的细胞质分布，这可能是病毒在细胞中持续复制以及炎症反应增强的原因。Ramakrishnan等【120】提出，截短的PBl．F2并不是最近发生在美国猪群中的发病严重的原因，但也没有发现截短PBl．F2会减少这些发病的情况。对于GN3株截短PBl一F2对猪的具体致病性影响仍需有待动物实验来阐明。3．10．3HA基因在HA受体结合位点中，GN3株与1918年西班牙大流感代表株、甲型H1N1流感代表株以及广西Sw／GX／13／06三重配株的氨基酸残基基本保守，分别出现3、2、5个残基不同(详见图3—6)。值得注意的是，GN3株与西班牙大流感代表株、甲型H1N1代表株的差异位点并没有出现在保护性抗体位点上，而且两者的Sa区完全相同。与广西Sw／GX／13／06三重配株的差异位点则有的位于这些保护性抗体位点上。在受体结合的关键位点中，第190、220、225、226、228位(H3亚型FLAl位置)氨基酸残基对SAa-2，3．Gal或SAa-2，6．Gal受体的结合具有决定性作用【127·1捌。【对应于GN3株HA基因序列位置为第187(D)、217(R)、222(D)、223(Q)、225(G)位】。重要的是，通常SIV在受体结合区的第190和220位都为D，能够与人上呼吸道的主要受体SAa．2，6．Gal结合【129彤m131m21。有研究表明，在雪貂模型中，D190E和D225G的替换将使H1N1亚型流感病毒的传染性丧失‘1331。Glaser等f1矧的研究也发现D190E的替换，使得HINl亚型流感病毒对SAa-2，3．Gal的亲和性提高，而对SAa．2，6．Gal的亲和性降低。另外，Mochalova等【135】的研究也发现，在人流感病毒中，第226位氨基酸残基为Q时可提高病毒对SAa．2，6．Gal的亲和力，而在H1N1亚型流感中R220也起同样的作用。GN3株具有这些特征性位点表明其可与SAa-2，6一Gal受体结合。3．10．4NA基因目前抗流感病毒的神经氨酸酶抑制类药物主要为：达菲喇(奥司他韦，Oseltamivir)、乐感清／瑞乐沙(扎那米韦，Zanamivir)、帕拉米韦(Peramivir)以及A．315675。NA氨基序 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析列中第l19(E一、，)、274(I-I一Ⅵ、292(R—K)、294(N---S)位的突变会使病毒产生对奥司他韦、扎那米韦等这些药物的耐药性【13每1371。GN3株在这些位点上都没有发生耐药性突变，说明GN3株仍对这些神经氨酸酶抑制类药物敏感。类似地，Sw／GX／13／06和Sw／Hainan／I／05分离株在这些位点上都为敏感性残基位点，说明广西的两株三重配株对神经氨酸酶抑制类药物敏感。NA蛋白能特异性识别唾液酸受体，裂解细胞表面受体末端的唾液酸残基，从而促进病毒粒子由胞内释放到胞外并防止病毒粒子聚集【231。据图3．10可知，广西SwH1N2分离株在NA抗原区中仅存在401aa和403aa两处变异；并且亚洲的HIN2SIV在地域范围上存在一定差异和规律。对于这种差异是否会影响NA蛋白的活性还需进一步研究和探讨。3．10．5M基因M1第41位和位于M2胞浆尾肽的第74'--79位氨基酸残基对病毒的形态有重要作用，M1第4l位Ala突变为Ⅶ则使病毒失去丝状形态1132。M2蛋白分为胞外域(1"-'25aa)、跨膜区(26-'-'55aa)、胞内域(56,---97aa)=个区。胞浆尾肽的第74"-'79位氨基酸在病毒形态形成过程中起一定作用，而且能影响病毒的感染性【l捌。抗病毒药物金刚烷胺和金刚乙胺等离子通道抑制类药物靶向M2蛋白，而S31N的改变可使这些毒株产生耐药性【1似141～421。Sw／GX／13／06与GN3株一样，均对M2离子通道类药物敏感。值得注意的是，这两株毒株在M2仍存在4处差异，这4处差异分布于M2的3个功能区中，目前我们仍不清楚这些位点的差异是否会影响离子通道活性进一步影响vRNPs的脱壳。3．10．6NS基因NSl为干扰素的拮抗剂，可阻断转录因子和促IFN—p基因产物的活性。通过NSl与dsRNA相结合，可抑制2’．5’寡聚A合成酶的依赖性dsRNA的活性，同时抑制RNaseL的活性，而RNaseL在初始的免疫应答中扮演重要角色。HSNl高致病性禽流感病毒的NSl对干扰素的抗病毒作用具有拮抗作用，它与高水平的前炎性因子有关‘143-1似1451。NSl蛋白中有几个氨基酸位点与毒力有关，如第92位，92D通常具有较低的致病性，而92E 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析则具有较高致病性。甲型H1N1各代表株的NSl第92位均为D，也符合这个推论【16】。在本研究中，GN3株以及Sw／GX／13／06在这个位点都为D，推测这两株均为低致病性。通过Obenauertl461的研究发现，NSl的四个羧基端氨基酸残基形成一个PDZ配体功能域。并且相关研究表明u2lJ，在小鼠模型中，将1918年流感毒株和高致病性H5N1毒株的PDZ配体区序列替换入人流感病毒时，其毒力会轻微提高。由于GN3株、甲型H1N1各代表株以及Sw／G)【／13／06都缺乏NSl羧基端11个氨基酸残基，所以这些毒株都没有PDZ功能域基序。另外，比较发现GN3株和Sw／GX／13／06的NS2第14、16、19位都为M，第21位都为L，据了解，这些位点参与NSl的核输出信号序列的功能【1471。3．10．7病毒溯源推测由系统发育进化与核酸同源性分析可知GN3株8个基因片段的来源(PB2：北美禽源谱系；PBl：北美“三重配S1V株’’人源谱系：PA：北美禽源谱系；HA：古典H1N1猪源谱系；NP：古典H1N1猪源谱系；NA：H3N2人源谱系：M：古典H1N1猪源谱系；NS：三重配猪源谱系)。根据GN3株核酸序列在NCBI—BLAST的结果(详见表3．1)，推测GN3株各个基因片段直接来源的时间在2002""--2005年之前。除NA基因外，其它基因片段与GenBank中毒株基因片段的同源性均在97％以上，NA基因同源性偏低，为962％(详见表3．1)。为了逃避免疫压力，流感病毒的表面抗原HA和NA的变异较其它基因快。在中国，猪群几乎没有进行SIV免疫接种，猪体内SIV免疫压力小，不可能是NA基因持续在猪体内保持高度的变异性，因为同样的HA基因同源性在97％以上，提示这种情况可能的原因是由于2002年前北美地区三重配SwHlN2传入本地区，而NA基因由N2亚型人H3N2流感病毒或者SwHlN2在2002年之后某一时间传入猪群，并与其它基因片段重配形成GN3株。GN3株各个基因片段来源如下图所示(图3一18)： 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析1116cj韬彦№t。—一⋯～⋯———盘图3．18GN3株各基因片段溯源推测TRIGcassette：三源重配内部基因盒Fig．3-18IllustrationofgenesisandorionoftheGN3virusTRIGcassetterepresentedtriplereassortantinternalgenecassette另外，从NCBI．BLAST和研究中核酸同源性分析都发现，GN3株与Smith等【31最近提供的Sw／卿I(／1562／05和Sw脚K／NS623力D2的序列的TRIG盒同源性很高(表3．11)，这两株毒株均与Sw／HK／915／04有7个片段处于“姐妹谱系"中(除M基因外)，后者与2009年甲型HINl流感病毒具有“姐妹关系一(除NA基因外)[31，这些表明GN3株与香港地区分离的毒株及2009年甲型H1NI流感病毒代表株之间有密切的关系，推测可能TRIG盒的M基因发生变异或新重配后，可以与H1HA和N1NA重配成新毒株，进而形成新的流感大流行。表3—11GN3株与部分参考株各基因编码区核酸同源性分析Table．3-11HomologiesofcodonregionnucleotidebetwcellGN3andsomereferencestrains2009年甲型HINI流感病毒的M基因来源于欧亚猪群中的禽源基因谱系，该基因65 欧亚地区猪群中蔓延。提示本研究分离的GN3株的TRIG盒与2009年甲型H1N1流感病毒之间具有密切的关系，可能在早期它们的TRIG盒来源相类似。同时GN3株可以通过与类禽谱系中M基因重配，并通过获得新的表面抗原基因，具有提供大流行毒株基因片段的潜在可能性，本研究中分离到的我区首株欧洲类禽N1亚型SIV提升了这种潜在可能性。GN3株与Sw／I-Iainan／I／05的HA基因同源性最高，系统发育分析也证明它们之间亲缘关系最近，GN3株HA基因可能来源于Sw／I-Iainan／I／05。而GN3株与Sw／GX／13／06的HA基因核酸同源性仅为91．1％，表明这两株病毒属于不同的毒株，这有可能与大规模养殖场猪群引种地多元化模式有关。广西SwHlN2的多样性也给SI的防控带来一定的困难。 2010年广西大学硕士论文广两猪流感病毒分离及全基因序列分析第四章LBl44株部分基因片段遗传进化分析第一节PB2、NP、NA、M和NS基因序列测定及NCBI—BLAST分析测序序列经拼接编辑后，在NCBI—BLAST比对验证，结果如下：表4-1LBl44株5个基因片段NCBI．BLAST结果及其来源Table．4-lNCBI—BLASTresultsofnucleotideacidsequenceofPB2，NP,NA，MandNSgeneandoriginofthesegenesofLBl44virus证实了LBl44株为欧洲型类禽N1亚型SIV。第二节PB2基因分析4．2．1PB2基因序列分析重要位点(毒力因子)102030柏翮6070∞90100量》【，口召PALs工K￡Ls葛z·A工G己KAIrvL工GQGDv可“7MK巍，【麟ss工LtDsoTAT嚣RI．1【I“．工蟑．图4-lLBl44株部分PB2氨基酸序列Fig．4·lAminoacidsequenceofparticalPB2oftheLBl44virus677007G0 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析LBl44株PB2基因由2341个核苷酸组成，共编码759个氨基酸。从推导的PB2基因氨基酸序列发现，其第627、701位分别为E(Glu)、N(Asn)。同源性分析与1990"-'2009年间北美、欧洲和中国周边地区H1N1SIV和2009年甲型H1N1流感病毒代表株的PB2基因核苷酸同源性如下图所示：表4-2LBl44株PB2基因核酸同源性分析Table．4-2NeucleofidehomologiesofPB2ofLB144virusI％北美地区欧洲地区中国及周边地区2009pdmH1N1LBl44-PB280．7～84．691．6"--94．881．O～98．683．7NorthAmerica：CY035077；CY028787；CY027162；CY022484；AY619954；DQ280197；DQ280213；EU409953；DQ280245；FJ638295；EU409963；GQ484358；EU604691；CY042313．TheEuropeanRegion：CY038012；CY038004；CY038020；CY037903；CY037911：CY037919；CY037926；CY037941；CY037949；GQl61109；CY010579；GQl61153．Chinaanditssurroundingal'ca$$GQ229281；AB434285；GQ422382；AB434293；AB434309；EU798918；EU004447；AB434325；EU798919；EU502892；EU004455；GQ229329；FJ536816；FJ415615；AB514933；GQ229305．2009paHiIIINl：FJ969516．由表4．2可知，LBl44株PB2基因与欧洲地区H1NISIV的NA基因核酸同源性普遍很高，而与北美地区H1N1SIV关系较远。说明LBl44株PB2基因与欧洲地区H1N1SIV的关系密切，而且这些欧洲地区的H1N1SIV为类禽H1N1SIV，推测LBl44株PB2基因来源于欧洲地区类禽H1N1SIV。4．2．2PB2基因系统发育进化分析由所构建的PB2基因系统发育进化树可知(详见图3．2)，LBl44株PB2基因位于欧亚禽源谱系分支上。与最近中国【691首次分离到的欧洲类禽型猪流感亲缘关系最近。而与甲型H1N1流感代表株和GN3株同属禽源谱系。 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析第三节NP基因分析4．3．1忡基因序列分析LBl44株NP基因由1497个核苷酸组成，共编码498个氨基酸。与A／swine／Fujian／58／2009株氨基酸序列相比，仅在第309、401、452位存在差异。∞1“4JP(emI帕卵帖meXc曲H嘬O．肿晰J-5¨80炉proM捌呻I．BlC4一NPten'cre神∞m●X∞暑}f嘬O。pmSwFJ-58-08-NP．proInjoclyLIBl44-NP{e删mW,omeXcds)-PRO．pro8wFJ-'3S-．08-NPpro‘删呻IDPFRLLosS倒FSLlRPNENPVHKSoLIW4ACI-P3AAFEDLRV$SFIRGTKVVPRCoLST3103203303403∞⋯．．．．．N．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．⋯瑚．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．3∞RGVa^S沲N辩ET睢SITLELR8KY她IRTRSGGNTⅫ，OR^S^GaSVOPTFSVaf对qLPF3703803∞400410420．，．．．．．，．．．．．．．．．．．，S．．．．毒20⋯．．．．．．。．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．艟O量基!!I!坠^FTGNTEGRTsDMRTEIRMMESAKPEDVSFQGRG=vFELSDEKATNPtVPSFD430440450460470480．M．．S．．．N．．．E．．．G．．S．．．Y．．．F．．．F．．G．．．D．．．t．帆．．．．E．．．E．．．Y．．．D．．—N—-490LBl44-HP(entlre∞nOm●X翻毒}f喂O舯．．．．．．．．．．．．．．．9wFJ-58-08-NPpro．．．．．．．．．．．．．．．加∞脯∞IDecor■km们!Hide【∞0ms啪¨-皤m舳theC∞删B靠a嘶．．，．．．．．．．．．．，．．．．．．．．．．．．．．480R⋯．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．柏O图4-2LB144株与A／swine／Fujian／58／2009株氨基酸序列比对船9埘Fig．4-2comparisonofaminoacidsequenceofpartiealPB2oftheLBl44virus同源性分析与1990"2009年间北美、欧洲和中国周边地区H1N1SIV和2009年甲型H1N1流感病毒代表株的NP基因核苷酸同源性如下图所示：表4-3LBl44株NP基因核酸同源性分析Table．4—3NeucleotidehomologiesofNPofLBl44virusI％北美地区欧洲地区中国及周边地区2009pdmHINlILBl44．NP82．4""88．083．2～97．282．1～98．783．0NorthAmerica：CY035073；CY028783；AF397199；CY022480；Lll164；AF222768；AF222776；AY619958；DQ280201；DQ280217；DQ280249；FJ638299；GQ484360；FJ61899．TheEuropeanRegion：Z26856；CY038000；CY038008；CY038016；CY038024；CY037915；CY037923；CY037930；CY037937；CY037945；CY037953；CY037961；AJ307069；AM920730；GQl61113；CY010575；CY010583；GQl61157；FJ798781；FN429082．Chinaanditssurroundingal'L隐S：U49091；GQ229278；AB434289；GQ229286；GQ229358；GQ229294；69 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析GQ229262；GQ422386；AB434297；AB434313；EU798838；EU004443；AB434321；EU502887；FJ789833；EU004451；GQ229326；FJ536813；FJ415617；AB514939；FJ536825；FJ536795；FJ536764；GQ229302．2009pdmH1NI：FJ969512．由表4．3可知，LBl44株NP基因与欧洲地区和中国及周边地区H1N1SIV的NA基因核酸同源性较高，而与北美地区HINlSIV关系相对较远。说明LBl44株NP基因与欧洲地区H1N1SIV的关系密切，推测LBl44株PB2基因来源于欧洲地区类禽H1N1SⅣ。4．3．2帅基因系统发育进化分析由所构建的NP基因系统发育进化树可知(详见第三节中GN3株NP基因分析处)，LBl44株NP基因位于禽源谱系分支上，与最近中国分离的欧洲型类禽SIV关系最近。第四节NA基因分析LBl44株NA基因由1410个核苷酸组成，共编码469个氨基酸。4．4．1卧基因序列分析糖基化位点在糖基化位点分析网站上分析LBl44株NA基因的推导氨基酸序列可知，其潜在的糖基化位点共有7个，分别位于50．52aa(-NQT-)、58-60aa(一NNT-)、63--65aa(-NQT-)、68—70aa(-NIS-)、88-90aa(-NSS一)、146—148aa(-NGT=)、235-237aa(-NGS一)。lO加∞柏5060弼∞90100MXPNQK】：T工6S工C工2IG：ASLlLQ工GN工1S1w工SHSIQ匏NQNQPEICN0工V工TYENNTWVNO!：诮：SN蕊FvAEQ埘ASVK强gNSSLCPVSG再A工Y1005xD葛s7R工G5lcGDl，rv工矗三圣r15c5H疆cRTFrz|T讲撬L工簋D髓5NGT工Ic豫sPYR?工．MscP工GE亨PsPY肆sRr￡鄂，A-5As枷DGTs-L!工GzsGP埘200GAVAVI|K疆G1ITDTIK516RK冀1I。RTcEsEcAc嬲Gsc刖n，M如_GpsNGI粥Y墨yF曼IER6K可哪v￡五l阻P妇HYEEc5cyPEsG￡Ita疰釜吾晶I矗G蹦300RPWVSFNQNLEYOMGYICSGZ嘞蜊陌鼎D毫TGSCG卵?S冀GA酬W取；FS腿Y铡GVH工GRtXSTSSRMG朗眦冒DPD铘鱼翻扭KFSV置QD工了Gl狲S400‘疆SGSl呵QH髓LtG五Da雌．pcn盹zl工RGRP鄹啪I■TSG5SIS托GV笃SD押G耳S■PD眦I-P职Z珏X．4"／0图4．3LBl44株NA氨基酸序列Fig．4—3Aminoacidsequ饥ceofLBl44virus70 20lO年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析耐药位点分析从NA基因的推导氨基酸序列可知，如图图4．3所示，LBl44株第274位氨基酸残基为Y(Tyr)，第294位为D(Asp),而第119位为E(Glu)，第292位为C(Cys)。同源性分析与1990"--2009年间北美、欧洲和中国周边地区HINlSIV和2009年甲型H1N1流感病毒代表株的NA基因核苷酸同源性如下图所示：表4-4LBl44株NA基因核酸同源性分析Table．44NeucleotidehomologiesofNAofLBI44virus％北美地区欧洲地区中国及周边地区．2009pdmH1N1LBl44-NA78．3～84．589．8～95．677．4～98．490．8NorthAmerica：CY035072；CY022479；DQ280259；EUl39837；EUl39839；AY619960；DQ280202；CY040572；CY040544；DQ280251；EU409956；FJ638308；EU409961；FJ611900；GU984385．TheEuropeanRegioII：CY038001；CY038017；CY038025；CY037916；AM920729；CY037938；AJ410880；CY037946；CY037954；FJ805963；CY037962；AM777826；GQl61121；CY010574；GQl61158；CY010582；AM777830；AM777829；FJ798780；FN429081；FN429079；D31947．ChmaanditssurroundingflFeSS：GQ229282；AB434290；GQ229266；GQ229290；GQ229298；GQ422387；AB434298；EU004442；AB434314；FJ688267；EU798819；FJ789827；EU004450；EU296606；FJ536812；GQ229330；FJ415611；AB514941；FJ536780；FJ536794；FJ536783；FJ536763；GQ229306；GQ452273．2009pdinH1NI：FJ969517．由表4_4可知，LBl44株NA基因与欧洲地区H1N1SIV的NA基因核酸同源性普遍很高，而与北美地区H1N1SIV关系较远。说明LBl44株NA基因与欧洲地区H1N1SIV的关系密切，推测LBl44株NA基因来源于欧洲地区类禽H1N1SIV。4．4．2M基因系统发育进化树分析由所构建的NA基因系统发育进化树可知(详见图3．11)，LBl44株NP基因位于禽源谱系分支上，同样与最近中国分离的欧洲型类禽SIV关系最近。71 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析第五节M基因分析LBl44株M基因由1027个核苷酸组成，共编码2个阅读框。M1有252个氨基酸，M2有97个氨基酸。4．5．1M基因序列分析耐药位点分析根据推导的氨基酸序列可知，LBl44株Ml第41位氨基酸为A(AIa)，M2第31位氨基酸为S(Ser)。表明LBl44株对作用于M2离子通道的金刚烷胺类药物依然敏感。i0203040SoMSLLTEVETYVLSIVPSGPLKAEIAQRLEDVFAGKNTDLE—A—LMEWLKTRP图4-4LBl44株M1基因部分氨基酸序列Fig．4-4ParticalaminoacidsequenceofMlgeneofLBl44virus1020304050MSLLTEVETPIRNGWECKCNDSSDPLIAAAS7工GILHLILWILDRLFFKCIYRRFKYGLKRGPSTEGVPESMREEYRQKQQSAVDVDDGHFVNIVLE．同源性分析图4-5LBl44株M2基因氨基酸序列Fig．4-5AminoacidsequenceofM2geneofLB144virus与1990"-'2009年间北美、欧洲和中国周边地区H1N1SIV和2009年甲型H1N1流感病毒代表株的M基因核苷酸同源性如下图所示：表4-5LBl44株M基因核酸同源性分析Table．4·5NeucleotidehomologiesofMofLBl44virusl％北美地区欧洲地区中国及周边地区2009pdmHINILBl44．M85．6～89．994．4～98．386．8～99．195．2NorthAmerica：CY035071；CY028781；CY027156；CY022478；AFl88004；AY619959C；DQ280204；DQ280220；DQ280252；GQ484361；FJ611901；EU604695；GU984386．72 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析TheEuropeanRegion：Z26861；GQ404616；EU478799；GQ404620；CY037917；DQl86975；CY037939；CY037947；FJ805964；DQl86976；EU478811；CY009893；CY010573；EU478817；EU478821；CY010581；EU478830；EU478836；EU478846；FJ798779；FN429083．Chinaanditssurroundingareas-GQ229279；U49115；AB434291；GQ229359；GQ229295；GQ422388；AB434299；EU004440；AB434307；AB434323；FJ789829；EU004449；GQ229327；FJ53681I；FJ415612；AB514942；FJ536771；FJ536768；FJ536779；GQ229303．2009pdmHINI：FJ969513．由表4—5可知，LBl44株M基因与欧洲地区H1N1SIV的M基因核酸同源性普遍最高，而与北美地区H1N1SIV关系最远。说明LBl44株M基因与欧洲地区HINlSIV的关系最密切。另外，LBl44株与2009年甲型H1N1流感病毒代表株M基因同源性很高，达95．2％，而2009年甲型H1N1流感病毒代表株M基因来源于欧洲地区类禽H1N1SIV，故推测LBl44株M基因来源于欧洲地区类禽H1N1SIV4．5．2M基因系统发育进化分析由所构建的M基因系统发育进化树可知(详见图3．15)，M基因明显分为3支：人源谱系支、猪源谱系支和禽源谱系支，前两个分支亲缘关系比较近。LBl44株M基因位于禽源谱系分支上，与A／Sw／Beijing／26／2008株以及中国首次分离的欧洲型类禽SIV株(A／Sw／Zhejiang／1／2007)的亲缘关系最近。于此同时，远离甲型H1N1流感代表株以及本实验分离的GN3株所在猪源谱系支。第六节NS基因分析NS基因由890个核苷酸组成，编码2个开放阅读框。NSl和NS2／NEP分别编码230、121个氨基酸。 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析4．6．1NS基因序列分析lO2030柏506。70∞如SN!VSSFQVDC亨：|暂HIRK象FADWZLGDAPP：3R二．RRDOKSLRG袁SST：IS=JZIEOA?lL瓦GKOIVKR了乙E￡EYD￡SLKMT工】啪AscYzlT菇IIEE!sR傩办虹麓P茇Q蹦AGsLc工础蠼DQA工如I旺IT五l【ANFs可工FNRLETLzzIz-RAFTEEG丘工VG￡工sPI|Ps毛PG嚣?D￡IYV'KNAIGVLIKGFEWNGNTVRVSEALQRSAWRSINEDRRPPFPPK()KREMARTTGPKg．图4．6LBl44株NSI基因氨基酸序列Fig．4．6AminoacidsequenceofNSlgeneofLBl44virus102030405060708016023lMDSNTVSSFQDILMRMSKMQLGSSSKDLNGMVTQFESLKLYRDPLGEALMRTGDLHSLQSRNGRWREQLGQKFEEXRWLIEEVRHRLKITENSFEQITFM0国,LQLLLEVEQEIRTFSFQLI-图4-7LBl44株NS2基因氨基酸序列Fig．4·7AminoacidsequenceofNS2geneofLB144vires70122毒力因子分析LBl44株NSl基因第92位残基为D(Asp)，在C末端具有PDZ配体(PL)功能域，其基序为GPKV，如图4-6所示。同源性分析与1990"--2009年间北美、欧洲和中国周边地区HINlSIV和2009年甲型H1N1流感病毒代表株的NS基因核苷酸同源性如下图所示：表4石LBl44株NS基因核酸同源性分析Table．4_6NeucleotidehomologiesofNSofLBI44virus％北美地区欧洲地区中国及周边地区2009pdmHINlILBl44-NS80．5～85．491．6～98．382．2～98．481．3NorthAmerica：CY035074；CY022481；AY619979；AY619978；DQ280200；DQ280240；GQ910946；GQ910923；GQ484362；GQ910941；GQ910947．TheEuropeanRegion：CY038003；Z26865；CY038011；CY038027；CY037918；CY037933；AM920732；CY037940；CY037948；AJ344029；AJ344027；CY037964；AJ519462；GU236513；GQl61115；GQl61159；CY010584；FJ798782；FN429084．Chinaanditssurroundingal'e组s-GQ229275；U49490；AB434292；GQ229283；GQ229259；GQ229291；GQ422389；AB434300；AB434316；EU798858；EU004441；AB434324；FJ789837；EU004448；GQ229323；74 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析FJ536814；FJ415613；AB514943；FJ536806；FJ536796；FJ536774；GQ229299．2009pdmHINI：FJ969514．由表4-6可知，LBl44株NS基因与欧洲地区H1N1SIV的NS基因核酸同源性最高，而与北美地区H1N1SIV关系较远。说明LBl44株NS基因与欧洲地区H1N1SIV的关系最为密切，推测LBl44株NS基因来源于欧洲地区类禽H1N1SIV。4．6．2NS基因系统发育进化分析由所构建的NS基因系统发育进化树可知(详见图3．17)，LBl44株NS基因位于禽源谱系分支中，同样与A／Sw／Fujiard58／2008株以及中国首次分离的欧洲型类禽SIV株(A／Sw／Zhejiang／1／2007)的亲缘关系最近。于此同时，远离甲型H1N1流感代表株以及本实验分离的GN3株所在猪源谱系支。第七节讨论4．7．1PB2基因Subbarao等人【1161的研究表明大多数AIV具有627E，而人流感病毒则为627K，LBl44株PB2氨基酸序列第627位为E(GIu)，带有明显的禽源基因分子标签【织1161，PB2系统发育分析也表明LBl44PB2来源于欧洲禽源谱系。另外，根据627E我们推测LBl“为低致病性毒株[1481。另外，第701位为N(Asn)提示LBl44株可能会比在这个位点为D的同亚型毒株毒力要强【1171。4．7．2M基因上一节已经提到NA氨基序列中第119(E-*V)、274(H一Ⅵ、292(R—K)、294(N--．S)位对神经氨酸酶类药物的耐药性其关键作用，LBl44株在第274位为Y，表明其已对奥75 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析司他韦产生耐药性，而其它位点并没有发生耐药性改变。由于LBl44株M2的第31位氨基酸残基为S，所以LBl44株对抑制M2离子通道类药物依然敏感。4．7．3NS基因Obenauer等【1461大规模分析禽流感毒株以及Jackson等【121J在小鼠模型的研究中发现，NSl为X．S／T-X．V型的流感病毒中，NSlPL基序为R-S．E．V型的毒株致病性比较低，E．S．E．v型的毒株致病性比较高。Obenauer等【146】的数据中也显示SW的PL基序主要为RSKV和GPEV，含有这些基序的毒株表现出低致病性；而GPKV也仅在SW中出现，约63．O％的SW的PL基序的一3位为E／fi，约35．6％为R／K。LBl44株具有PL基序(GPKV)，提示LBl44株致病性较低。4．7．4病毒溯源推测LBl44株PB2、NP、NA、M和NS基因的系统发育进化分析以及NCBI—BLAST的结果都证实了LBl44株为欧洲型类禽N1亚型SW，为广西首次报道的类禽型Nl亚型SW。由于没有扩增出其HA基因，暂时无法得知HA亚型，从现有的资料推测LBl44株有很大可能性为欧洲型类禽H1N1SW，最早应该是在2007年传入我区。目前，类禽N1SW在香港【149】、广西、浙江、北京、福建、山东、广东等地【69】出现。值得注意的是，在广西已有H9N2禽流感及猪流感1150】的出现，并且现在有欧洲类禽猪流感N1亚型毒株的介入，如此多亚型流感共存的现象在中国已有的报道中并不多见。76 第五章LGXl株和LGX3株全基因遗传进化分析从谢ne／Gl】锄龇GXl／2006(H3N2)和从讹粥眦舭∞／2005(H3N2)为实验室保存毒株，简称LGXl株和LGX3株，分离地为柳州，采样时间分别为2006年12月和2005年10月。第一节全基因序列测定及NCBI—BLAST分析测序序列经拼接编辑后，在NCBI—BLAST比对验证，结果如下：表5-12株H3N2分离株各基因片段的NCBI—BLAST结果Fig．5．1ResultsofNCBI—BLASTof8segementof2SwH3N2isolatesGenBank毒株基因基因来源同源性最高的毒株同隙住汪册亏A／swindGuaagxi／LGXl／2006(mN2)PB2HumanA，swi∞炯幽gd∞卯4尼∞599％EU620741(LGxl)PBlH山咖PAHunumHAHumanNPHmI啪NAHummMHumanAhn,hndShnndm奶／2005A／swtndS删t2005^恼^d舱愉啪gd咖啦5脚03A／swindShandong／3／2005A／swine／Shandong／3／2005删尬船u锄酬l￡拍舛EUll6037I及Jl16∞9EUl1604lEUl16042FJl57992EU6556盼l!LJ62a74lEUll6037EUll6039FJ970919EUll604lEUll6042FJl57钾2NSHumanA／s㈣gdong／ZS／200399％FJ970923由上图可知，LGXl株和LGX3株与同期广东、山东等分离株关系最为密切，除LGXl株的NS基因外，各基因片段与这些毒株同源性都在99％以1-'-。嗍姒嗍一蕃|嗍一一一一一一～il=lliiU引副川LLr■■■tr}I聊队舯姒M№ 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析第二节LGXl株和LGX3株全基因序列核酸同源性分析与1990,--,2009年间北美、欧洲和中国周边地区H1N1SIV和2009年甲型H1N1流感病毒代表株的全基因序列核苷酸同源性如下图所示：表5．2LGXl株和LGX3株全基因序列核酸同源性分析Table．5-2NeucleotidehomologousanalysisofgenomesofLGXlandLGX3isolatesNorthAmerica：fPB2)：AF251402；AF251410；EF551050；DQ469963；DQ469971；DQ469979；EU826550；CY045564；FJ410137；CY041844；CY045556．@B1)：AF251397；AF251405；EF551051；DQ469972；DQ469980；EU826549；EU692891；EU692894；CY045565；CY041845；CY045557．0PA)：AF251401；AF251409；EF551052；DQ469965；EU826548；CY035444；CY035425；CY045566；FJ410139；CY041846；CY045550；CY045558．(I认)：CY009308；U07146；AF251395；AF251403；AF251419；AF251427；GU289666；EU422987；EU422988；EF551053；DQ469970；DQ469978；DQ469986；DQ469994；EU826543；FJ519973；FJ519977；CY045567；CY041847；CY045559．@P)：AF251399；AF251407；AF251415；AF251431；EF551054；DQ469967；DQ469975；DQ469983；EU826545；FJ410141；CY045568；CY041848；CY045560；CY045552．78 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析aA)：AF251396；AF251404；AF251412；EF551055；DQ469968；DQ469976；DQ469984；EU826544；FJ519962；FJ519960；FJ519964；FJ519965；CY045569；CY045561．(】旧：AF251398；AF251406；AF251414；AF251430；EF551056；EU826546；FJ410143；CY045570；CY045578；CY041850；CY045562；CY045554．@s)：AF251400；AFl53263；AF251408；AFl53260；AFl53261；AF251416；AF251432；EF551057；DQ469966；DQ469974；EU826547；GQ910924；GQ910958；FJ410144；CY045579；CY041851；CY045563；CY045555．TheEuropeanRegion：口B2)：AJ311459；CY009379；CY009387；GQl61126；EU924268；CY010571．口B1)：DQ836168；DQ836173；AJ311460；DQ836170；CY009378；CY009386；CY020507；GQl61127；GQl61168；EU924269；CY010570；FJ798776．畔)：CY009377；CY009385；CY020506；GQl61135；GQl61169；EU924270；CY010569；FJ798775．衄～)：EF409247；AM920723；EF409248；AM920733；EF409249；AJ293932；EF409250；EU045362；EU045365；CY009372；AM920742；CY009380；CY020501；GQl61170；EU924271；EU045371；CY010564；GQl61147；GQl61149；GQl61151；EU982295；FJ798772；EU982296．aP)：AM920725；AF385293；AM920735；AJ293942；AJ307071；CY009375；AM920744；CY009383；CY020504；GQl61130；GQl61171；EU924272；CY010567；AM746619；FJ798771．心A)：AJ412700；AJ311455；EF409254；EF409255；AM920724；EF409256；AJ293936；EF409257；AJ293937；AJ412703；EF409258；CY009374；CY009382；CY020503；AM920743；C硷161100；EU924273；CY010566；GQl61150；AM746617；GQl61148；GQl61152．0v1)：EU478800；DQl86981；EU478801；AM920726；DQl86982；AM920734；DQl86983；EU478803；AJ293938；DQl86984；EU478805；EU478806；CY009373；AM920745；CY009381；CY020502；EU478808；EU478814；EU478807；EU478810；EU478820；EU478828；EU478826；EU478839；CY010565；EU478831；EU478833；EU478834；EU478847；EU478838；AM746618．@s)：AJ293939；AM920727；AM920736；CY009376；AM920746；CY020505；CY009384；GQl61132；GQl61173；EU924274；CY010568；AM746620；FJ798774．Chinaanditssurroundingareas：口B2)：AF眨25514；FJ830852；GQ422428；AB434341；H970926；AB434365；FJ561057；AB434349；EU798929；FJl57988；AB434357；EU798931；EF455569；EU273802；EUl16038；EU798932；EU273805；EU655695；EU798936．79 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析(PBl)：AF225518；FJ830853；GQ422420；AB434342；FJ970925；AB434350；AB434366；EU798909；FJl57989；AB434358；EU798911；EU273798；EUll6037；EU798912；EU273801；EU655694；EU798916；GU215024；GU215032．(PA)：AF225525；AF225522；FJ830854；GQ422419；AB434343；AB434367；AB434351；EU798889；AB434359；FJl57990；EF455567；EU273794；EUll6039；EU798891；EU798892；EU273797；EU655693；EU798896．㈣：FJ830855；AY363520；DQ021911；AY857957；EF217406；DQ021910；AY363525；GQ422436；AY377927；AB434344；FJ970919；EU296609；AY852273；AY852277；FJl57986；EU798789；EU301209；FJ561060；AB434368；AB434352；FJ688268；EU798791；EU296617；EU296613；EF455562；EU273774；EUll6040；EU798792；EU273777；EU655692；GU215026；EU798795；GU215034．讲P)：AF225537；M63771；AF225534；FJ830856；GQ422402；AB434345；FJ970922；AB434369；AB434353；FJ561061；EU798849；FJl57991；AB434361；EU798851；EF455565；EU273786；EUll6041；EU273789；EU655691；EU798855；GU215027；GU215035．OiA)：AF225538；D86470；AF'225541；FJ830857；EF217407；GQ422399；AB434346；FJ970921；FJl57987；AB434370；EU798829；AB434354；EU296612；EU273782；EU798831；EF455564；FJ688269；EUl16042；EU296614；EU296620；EU273785；EU798832；EU655690；EU798836；GU215028；GU215036．0vt)：AF225529；AF400771；FJ830858；GQ422390；AB434347；FJl57992；AB434371；AB434379；AB434355；AB434363；EU273778；EUI16043；EU273780；EU655696．(Ns)：AF225530；AF225533；AF400774；FJ830859；AY363590；v；AY363591；AY363583；AY363582；AY363594；AY363585；AY363584；AY363595；AY363596；GQ422408；AY363587；AY363588；AY363597；AY363598；AY363589；AB434348；FJ970923；AB434372；AIM34356；EU798869；FJl57993；AB434364；EF455566；EU273790；EUll6044；EU798872；EU273792；EU273793；EU655689；EU798875；GU215022；GU215030；GU215038．2009pdmH1NI：口m)：FJ969516；口B1)：GQ377049；0)A)：FJ969515；州P)：FJ969512；0V1)：FJ969513；州s)：FJ969514．由表5．2可知，LGXl和LGX3株与1990""2009年间北美地区和中国及周边地区H3N2SIV毒株的关系比较密切。其中，PBl、HA、NA基因与北美地区毒株保持高度的同源性。且LGXl和LGX3株与中国、日本、韩国毒株的PBl和NA基因保持同样的高度同源性(具体数据未列出)。说明PBl和NA基因在H3N2SIV中具有选择性优势。如 垫!!生￡堕奎堂堡圭笙苎一广西猪流感病毒分离及全基因序列分析——————————————————————————————————————二-二=∑二=二二二：：：：=：=：：：=：：：：：!型第三节LGXl株和LGX3株全基因序列系统发育进化分析构建LGXI株和LGX3株各基因片段系统发育进化树，参考株来源于中国各时期分离株、北美二重配株及三重配株、欧洲各时期分离株。结果如下所示：=I-FJl57988(A／swine／Guang_／1Q004(1-13N2)蝉FJ970926(／Vswine／Guangdong／ZSQ003(H3N2)吲●LGXI-PB2叫{·LGx3PB2图5-IPB2基因系统发育进化树Fig．5-1PhylogeneticanalysisofPB2geneofLGXlandLGX3i∞l砷鹃8l 卜一O．005图5-2PBl基因系统发育进化树Fig．5-2PhylogeneticanalysisofPBlgeneofLGXlandLGX3isolatesHumanAvian h—————{O．ol图5-3PA基因系统发育进化树Fig．5-3PhyiogenetieanalysisofPAgeneofLGXlandLGX3isolatesSwineHuman 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析h———一0．ol图5_4HA基因系统发育进化树Fig．5-4PhylogcncticanalysisofHAgeneofLGXlandLGX3isolates -●LGX3剞P吲Eu”6041(A愿wine／Shandong／3／2005(H3№)|_●LGXl-NP-——————————{咄HumanAvian图5-5NP基因系统发育进化树Fig．5．5PhylogeneticanalysisofNPgeneofLGXlandLGX3isolates HO．005图5-6NA基因系统发育进化树Fig．5-6Phy|ogeneticanalysisofNAgeneofLGXlandLGX3isolatese 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析}—-———_0．∞5HumanSwineAvian图5．7M基因系统发育进化树Fig．5-7PhylogeneticanalysisofMgeneofLGXIandLGX3isolates }————————一Om图5．8NS基因系统发育进化树Fig．5．8Phylogenetic狮alysisofNSgeneofLGXIandLGX3isolates 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析由所构建的进化树可知，LGXl和LGX3株8个片段都来源于人流感病毒。而在各个进化树中，大多分为3个分支：人源谱系、猪源谱系和禽源谱系。而表面抗原基因又可以分为多个亚支。HA基因系统发育进化树分为5个分支【”11：最早期人源谱系、早期人源谱系、近期人源谱系、欧洲猪源谱系和禽源谱系。NA基因系统发育进化树分为4个分支【1511：最早期人源谱系、早期人源谱系、近期人源谱系、欧洲猪源谱系。与HA基因分析结果略有不同，主要原因是缺乏禽源H3N2SIV的NA基因序列信息【1511。从表面抗原基因的系统发育进化分析来看，LGXl株和LGX3株都位于近期人源谱系分支上，属于近期SIV。两株分离株的其它6个基因均位于所构建的进化树的人源谱系分支上。第四节讨论在NCBI的流感病毒数据库中可获得的序列来看，中国最早的H3N2SIV基序信息是1969年在台湾地区获得的A／swine／Taiwan／1969(H3N2)的M基因，另外，据于海【152l的研究显示，中国目前的H3N2SIV分为类人SIV、“人．猪”二源重配SIV、三源重配SIV，其中以类人SIV流行最普遍，本研究中的LGXl株和LGX3株也为类人SIV，这个分析结果与2003年"2004年祁贤1651分离到的16株SIV、2006年于海【1521获得的4株SIV一致。这个结果显示近年来，中国广西、广东、江苏、安徽、河北、黑龙江等地流行的H3N2SIV主要为类人SIV，特别是两广地区，分离到的H3N2SIV几乎是类人SIV。在基因分子进化上，这些分离株的获得说明至少H3N2SIV在广西地区已经形成稳定的谱系。1990"--2009年间北美地区和中国及周边地区的H3N2SIV的毒株具有比较密切的关系，主要原因是这些毒株要么是北美重配型H3N2siv(具有人源谱系HA、NA和PBl基因)，要么是类人H3N2SIV。但从整体来说，这些类人H3N2SIV明显与欧洲和1998年后北美的重配型H3N2SIV不同。但对抗原性分析仍需要下一步m试验进行确定。DeJong等【153】在对欧洲地区H3N2SIV的抗原与基因进化分析的研究结果表明，从1973年起H3N2SIV与人流感病毒逐渐分开，形成“猪PCh谱系"，可能与在1973年左右禽源H3N2的介入有关，而类似A／PortChalmers／1／73的人流感病毒毒株则被认为是“猪PCh谱系’’最可能的祖先。1998年之前，在美国猪群中H3N2SIV只是低水平流行，没有形成稳定的谱系洲。●，_llIllllll 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析大部分H3N2SIV都是类人毒株，1998年8月～12月，美国四个州的猪群发生H3N2SIV暴发，后续研究的分析结果表明这些原发性致病株是重配型H3N2SⅣⅢJ，为二源重配株与三源重配株。后来，三源重配H3N2SIV又成为北美地区猪群中的优势毒株之一。北美三重配H3N2SIV及其它亚型重配株都有一个共同的基因组合特征，就是它们都具有类似的内部基因，又被称为三重配内部基因(Triplereassortantinternalgene，TRIG)盒，包括禽谱系PB2和PA基因，古典猪谱系NP、M和NS基因，人谱系PBl基因。说明TRIG盒在猪体中获得了选择性优势，形成稳定的组合，并与其它亚型重配时，主要发生抗原转变而引起猪群新的流行病暴发1401。由此看见，猪既可作为流感病毒的“混合器’’【55‘58卅，使各个基因片段发生重排形成新毒株；又可作为“储存器”[154-155】，保存曾在人群中流行的毒株，由于猪的生产周期不长，流感病毒在猪体内受到的免疫压力远比在人群中要小，所以这些H3N2毒株传入猪群中并得以保存下来，并形成稳定的谱系。因此，通过基因重排，在猪群中也不断发现新的毒株，这些发生不同重配的H3N2SIV就是最好的例子。而甲型H1N1流感病毒的PBl基因就是来源于H3N2人流感病毒，并于1998年左右定植于猪群中的。因此，猪作为“储存器”和“混合器”的作用在人类和动物公共卫生意义上具有极为重要的意义。因此，加强对SIV的监测以及包括病毒分离、基因片段溯源分析等在内的基础研究工作显得迫切需要。 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析第一节全文讨论第六章全文讨论与结论目前中国猪群中主要存在着9种SIV，分别为类人H3N2、二源重配及三源重配H3N2[1511、古典H1N1【62-1561、欧洲类禽H1N1[69]、类禽H1N116扪、二源重配及三源重配H1N2191奶-1571、类禽H9N2[15舡15弘1鲫SIV。同时仍散在出现其它亚型，如类人H1N1[1611、H5N1[1621、H3N1[1631、H3N8[164]及H4亚型【165l的SIV。据我们目前的了解，国内暂时未发现有类似北美地区重配型H1N1SIV出现(表面抗原基因为H1N1流感病毒，内部基因为TRIG盒)。截止至本文完成之际，广西猪群中分离到的毒株有类人H3N2、三源重配H1N2、类禽H9N2、H5N1以及欧洲类禽N1亚型SIV。包括本研究分离到GN3株(三源重配H1N2srv3和LBl44株(欧洲类禽N1亚型SⅣ)。中国南方，特别是华南地区，被认为是世界流感暴发和流行的中心陋1661。而广西位处华南地区，由于广西较为特殊的地理环境，既有山地、平原和较为丰富的河流，又处于温暖的亚热带地区，猪与家禽家庭饲养体系在广西仍相当普遍，因此作为流感病毒“混合器”和“储存器”的猪，无论是对人类公共卫生还是动物公共卫生都意义重大。许传田等【1571的研究表明，中国猪群中的H1N2SW分为两种类型，一类以Sw／GX／13／06株和Sw／Gongdong／I／06株为代表，推测这些毒株来源于北美地区Sw／lndiania／P12439／00的类似株；另一类以Sw／Tianjin／I／04株和Sw／Zhejiang／I／04株为代表，它们可能来自流行于北美地区的古典H1N1SIV和H3N2人流感病毒的重配株。其实，Sw／GX／13／06株和Sw／Gongdong／I／06株为三重配株，HA、NA分别来源于古典H1N1SIV、H3N2人流感病毒，并具有‘'TRIG盒”基因组合；而Sw／Tianjin／I／04株和Sw／Zhejiang／I／04株为二重配株，NA来源于1995---1997年期间的H3N2人流感病毒，其余基因片段均来源于固定H1N1SIVt911。本研究所分离的GN3株与Sw／GX／13／06株一样，同属“人一猪．禽”三源重配H1N2SIV。同时，我们的研究结果表明，在最近这段时期9l 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析内广西南宁、北海f95】两个地市已出现这种三源重配H1N2亚型SIV，这是否说明三源重配H1N2亚型SIV已经定植在广西猪群中形成稳定的谱系?这有待于我们下一步制备抗原并对广西区内主要猪场的血清学调查分析。本研究首次报道了广西猪群中存在欧洲类禽型N1亚型SIV。欧洲类禽N1亚型SIV主要在欧洲类禽H1N1SIV中出现，根据我们构建的PB2、NP、M和NS基因系统发育进化树来看，这些基因片段都与近期中国分离到的欧洲类禽H1N1SIVt691关系非常密切，推测LBl44株具有最大可能性为欧洲类禽H1N1SIV。但我们对LBl44株的确切来源仍不是很清楚。在1969年，Kundin等【731首次发现H3N2亚型“香港流感，’病毒由人传入台湾猪群中。此后，这种类人SIV不断在欧洲及亚洲猪群中流行【74】，但这种类人SIV仅零星引起猪的临床症状。H3N2SIV在广西的血清学及病原流行情况已经有了比较多的调查，从2001"--'2007年间，李海燕、祁贤、于海、冯建远、蒙雪琼等陋5研_78·8嗍1抛-83舶7】的研究表明，广西区H3N2SIV分离株均为类人H3N2SIV，2005"-'2007年H3亚型的阳性率为25．7％,--,49．1％。类似地，本研究的H3N2SIV也为类人SIV，这提示在2001"-'2009年间类人H3N2SIV已在广西猪群建立了稳定的谱系，同时H3亚型SIV也成为广西猪群中优势流行毒株之一。对于广西三重配HIN2亚型和欧洲类禽型N1亚型SIV的确切来源并不十分清楚，三重配H1N2GN3株与Sw／GX／13／06株与北美地区的三重配H1N2流行株的亲缘关系密切，而LBl44株则为欧洲类禽N1亚型毒株，这可能是由于广西大规模养殖场猪群引种地多元化模式有关，同时本研究的结果也为广西猪群引种地域多元化引起本地区多种SIV共存提供依据。由于猪呼吸道上皮细胞同时存在流感病毒两种受体：唾液酸a．2，3半乳糖苷(SAa一2，3．Gal)和唾液酸a．2，6半乳糖苷(SAa．2，6．G2L1)，所以猪能被人、禽等多种流感病毒感染，并且成为“禽—猪一入”流感病毒种间传播链中重要的中间宿主，是禽、猪、人等不同流感病毒基因重组或重配的“混合器，，【9刀和流感病毒新流行毒株产生的cc孵育器”，SIV既可以直接感染人类又可以在人群中传播p8舡100l。目前，广西猪群中至少存在着5种SIV，如此多亚型流感病毒共存的现象在中国已有的报道中并不多见。最近在瑞典【16硼分离到新型H1N2SIV，不同于以前的欧洲H1N2SIV毒株，这种现象提示了下一个阶段在广西猪群中是否会引发这些毒株重配?并且，这些重配会不会形成可感染人甚至在人际间流行的新毒株?2009年的甲型H1N1流感是本世纪第一次流感大流行，虽然到目92 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析前为止此次大流感的致死率并不高，但其为新重配株，包含人．猪．禽的基因，WHO不断提升预警级别直至6级，给全球的流感监控、防治体系提出巨大挑战。研究表明13】，此次流行的病毒亲缘性最相近的SIV已经在9．2～17．2年前出现，而缺乏对猪流感病毒的监测是这次大流行暴发之初人们对这些毒株相关背景一无所知的重要因素，Smith等例并提出应该对SW进行系统地监测。家猪与家禽家庭饲养体系易造成流感病毒在猪、禽和人之间传播，给病毒的共循环和基因的重配提供了理想的场所和机会。这对公共卫生安全及养殖业都造成潜在的严重威胁，建立和完善人与各种动物的流感立体监测网络体系已迫在眉睫。第二节全文结论2．1在广西南宁、来宾分离到两株SW，分别为A／swine／Guangxi／NNGN3／2009饵1N2)(简称GN3株)和A／swine／Guangxi／LBl44／2009(H?N1)(LBl44株)。2．2对GN3株8片段全基因进行系统发育进化、HA受体位点和裂解位点、PB2和NSl毒力因子、PBl-F2片段分析显示，GN3株为“人一猪．禽”三源重配SW，具有与SAa-2，6．Gal受体结合的能力，并且属于低致病性毒株；另外，分别与Sw／GX／13／06和Sw／Hainan／I／05保持较高的亲缘性，并与香港分离株Sw／HK／NS623／02关系最密切。2．3对GN3株NA、M基因耐药性位点的分析显示其对神经氨酸酶抑制类、M2离子通道作用类抗病毒药物均敏感。2．4对LBl44株PB2、NP、NA、M和NS基因进行系统发育进化、PB2和NSl毒力因子分析显示，LBl44株是欧洲类禽N1亚型SW，为广西首次报道的欧洲类禽Nl亚型SW，LBl44株属于低致病性毒株。2．5对LBl44株NA、M基因耐药性位点的分析显示其对抑制神经氨酸酶类的奥司他 2010年广西大学硕士论文广西猪流感病毒分离及全基因序列分析韦(达菲俐)已产生耐药性，但对M2离子通道作用类抗病毒药物仍敏感。2．6LGXl和LGX3株8片段全基因进行系统发育进化分析显示，它们都为近期类人H3N2SⅣ。 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