伤寒沙门菌质粒prst98和毒力基因spv对巨噬细胞自噬和凋亡的影响及分子机制研究

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1、苏州大学学位论文独创f

2、'生声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。论．文作者签名：么丝煮日期：2扩／2，7．肜苏州大学学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定，即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸

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4、研究中文摘要目的：中文提要中又提要通过细胞感染模型，研究伤寒沙门菌质粒pRsT98和沙门菌质粒毒力基因(Sahnonellaplasmidvirulencegene，spy)对巨噬细胞(macrophage)自噬和凋亡的影响及其分子机制。方法；一．伤寒沙门菌质粒pRsT98对巨噬细胞自噬和凋亡的影响及分子机制研究。以携带pRsT98的伤寒沙门菌(SahnonellaenlericaserovarTyphi，StyphD野生株ST8、消除pP,,sT98的突变株ST8-ApRsT98和将pRsT98经接合转移重新导入ST8．Ap

5、RsT98所获得的回补株ST8一C—pRsT98感染人巨噬细胞THP一1，以此作为感染模型，分别用自噬诱导剂雷帕霉素(Rapamycin，RAPA)和NO合酶抑制剂L一硝基耩氨酸甲酯(nitro．L—m-gininemethylester，L．NAME)进行干预。将细菌和细胞共培养30rain后吸除上清，此时定为“0点”，加入含100}tg／ml的阿米卡星(Amikacin，AMK)的培养液作用2h以去除胞外菌，然后将AMK浓度降为10耻g／ml抑制从感染细胞中释放至培养液中的细菌生长，继续培养至各检测时间点。分别在细胞感染模

6、型的0点、感染后2h和6h收集细胞或上清液。用流式细胞术(flowcytometry，FCM)检测巨噬细胞自噬蛋白微管相关蛋白1轻链3(microtubule—associatedprotein1lightchain3，LC3)一II的表达和Sub—G1凋亡峰，透射电镜(transmissionelectronmicroscope，TEM)观察细胞超微结构的变化，Westernblot法检测巨噬细胞自噬蛋白Beclin，1和抗凋亡蛋白Bcl．2的表达，比色法测定Caspase．3的活性，Griess法检测NO(nitricox

7、ide)含量，ELISA法检测TNF．。【含量，平板菌落计数法检测胞内活菌数。二．沙门菌质粒毒力基因印v对曰噬细胞自噬和凋亡的影响及分子机制研究。由于伤寒沙门菌只感染人类的严格宿主特异性，缺乏理想的动物模型，为今后进～步在动物活体内研究pRsrF98上．吁，v的功能，本部分实验使用鼠伤寒沙门菌1中文摘要伤寒沙门菌质粒pRST98和毒力基因印v对ENgt胞自噬和凋亡的影响及分子机制研究(Sahnonellaentel4icaserovarTyphimurium，Styphimm4ibltT"1)开展相应实验，以携带spy的鼠伤寒

8、沙门菌野生株UF009和敲除spv的鼠伤寒沙门菌突变株UFt10感染鼠巨噬细胞J774A．1，以此作为感染模型，并用p38抑IiliiSB203580进行干预。细菌和细胞共培养1h后吸除上清，此时定为“0点”，AMK的应用同第一部分。分别在细胞感染模型的0点、感染后2h、6h和24h收集细胞或上清液进行相关指标的检测。用FCM检测巨噬细胞自噬蛋白LC3．II的表达和Sub．G1凋亡峰，Westernblot法检测巨噬细胞自噬蛋白Beclin一1和抗凋亡蛋白Bcl．2的表达，Griess法检测NO的含量。结果：一．伤寒沙门菌质粒

9、pRsT98对巨噬细胞自噬和凋亡的影响及分子机制研究。1．FCM和Westernblot检测自噬蛋白LC3一II和Beclin—l结果显示，细胞感染模型的0点，ST8和ST8一C．pRsT98感染组细胞LC3．II(尸