沙门菌质粒毒力基因spvb方抗体的制备及其对nf-κb通路的影响

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1、SOOCHOWUNIVERSITY论文题目沙门菌质粒毒力基因⑶V石抗体的制备及其对NF-KB通路的影响研究生姓名燕婧指导教师姓名黄瑞专业名称病原生物学研究方向感染与免疫论文提交日期2015年4月苏州大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本吉明的法律责任。论文作者签名：日

2、期：孤苏州大学学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定r亂学位论文著作权归属苏州大学A本学位论文电子文档的内容和纸S论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献S息情报中心、中国科学技术信息研究所（含万方数据电子出版.社x中国学术期利（光盘版）电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查_和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。本学位论文属在年月解密后适用本规定U非涉密论文论文作者签名sh钱—_—日•导师签各j

3、A日期：.JilLLL沙门菌质粒毒力基因spvB抗体的制备及其对NF-κB通路的影响中文摘要中文摘要目的：沙门菌质粒毒力基因spvB编码产物具有ADP核糖基转移酶作用，与细菌毒力关系密切，目前该基因的功能还有很多未知。本研究第一部分通过对沙门菌质粒毒力基因spvB进行生物信息学分析、克隆表达并制备相应抗体，为后续深入研究该基因的功能提供工具和手段。第二部分通过建立沙门菌感染的巨噬细胞模型，研究spvB对NF-κB信号通路相关蛋白IκBα和p65等表达的影响；利用与真核表达载体连接的重组质粒pEGFP-N1-SpvB瞬时转染HeLa细胞，进一步

4、分析spvB对NF-κB通路的影响，探讨该基因对宿主菌毒力影响的分子机制。方法：一.沙门菌质粒毒力基因spvB的原核表达及其抗体的制备1.通过生物信息学软件分析spvB基因及其编码的蛋白，选取抗原性较高、易表达的氨基酸序列作为克隆序列。2.根据spvB基因序列设计引物，以携带spvB基因的野生型鼠伤寒沙门菌（SalmonellaentericaserovarTyphimurium，S.typhimurium，STM）为模板，PCR扩增获得目的片段后与原核表达载体pET-28a连接，将质粒pET28a-SpvB转化至大肠埃希菌BL21（DE3）

5、后，IPTG诱导表达并纯化。用SpvB蛋白免疫健康小鼠，制备抗SpvB多克隆抗体，Westernblot检测抗体特异性。二．沙门菌质粒毒力基因spvB对NF-κB信号通路的影响1.以携带spvB基因的鼠伤寒沙门菌野生株STM-WT、消除spvB基因的突变株STM-ΔspvB及回补株STM-c-ΔspvB分别与小鼠腹腔巨噬细胞J774A.1共培养，建立细胞感染模型。Westernblot检测NF-κB通路相关蛋白IκBα和p65等的表达；荧光显微镜下观察p65的核转运；Westernblot检测Caspase-3的活化；比色法测定Caspase

6、-3的活性；免疫共沉淀法检测IκBα的泛素化水平。2.利用pRL-TK（内参质粒）、pNFκB-luc（报告基因质粒）、pEGFP-N1及pEGFP-N1-SpvB瞬时转染HeLa细胞，加入TNF-α刺激后，通过双荧光素酶报告基因检测系统检测spvB对NF-κB通路的影响；利用pEGFP-SpvB真核表达载体瞬I中文摘要沙门菌质粒毒力基因spvB抗体的制备及其对NF-κB通路的影响时转染HeLa细胞，TNF-α刺激后，Westernblot检测spvB基因对IκBα、p65等蛋白表达的影响。结果：一.沙门菌质粒毒力基因spvB抗体的制备1.成

7、功构建pET28a-SpvB原核表达重组质粒，经IPTG诱导结果显示，重组蛋白表达且主要存在于包涵体中。2.将纯化的SpvB蛋白免疫小鼠，制备多克隆抗体，经Westernblot验证该抗体能特异结合SpvB蛋白。二．沙门菌质粒毒力基因spvB对NF-κB通路的影响1.Westernblot检测NF-κB通路相关蛋白IκBα和p65的表达，结果显示细菌与细胞共培养30min后，STM-ΔspvB感染组细胞IκBα的表达量显著低于STM-WT感染组（P<0.01），与STM-c-ΔspvB感染组相比两组间无显著性差异（P>0.05）；感染4h后，

8、STM-ΔspvB感染组IκBα的表达量显著低于STM-WT和STM-c-ΔspvB感染组（P<0.01）；感染4h和8h后，STM-ΔspvB感染组Phospho