沙门菌毒力基因spvb抑制细胞自噬的分子机制及对斑马鱼感染模型的影响

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1、$、n武SOOCHOWUNIVERSITY硕士学位论文论文题目沙门菌毒力基因细胞自噬的分子机制及对斑马鱼感染模型的影响研究生姓名王指导教师姓名吴淑燕专业名称病原生物学研究方向抗赫论文提交日期2015年4月苏州大学学位论文独创性声明本人郑重声明：两提交的学位论文是本人在导释的指导下，狨立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研宄成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方

2、式标明。本人承担本声明的法律责任。论文作者签名：日期：地u苏州大学学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定，即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献信息情报中心、中国科学技术信息研究所（含万方数据电子出版社)、中国学术期刊（光盘版）电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库

3、进行检索。涉密论文口本学位论文属在年__月解密后适用本规定。非涉密论文^论文作者签名：日期：感U导师签名:曰期:ZtTlT-队沙门菌毒力基因spvB抑制细胞自噬的分子机制及对斑马鱼感染模型的影响中文提要中文提要目的：沙门菌（Salmonella）是寄生在人和动物肠道内可引起多种疾病的肠道致病菌，主要经水和食物传播。沙门菌质粒毒力基因（Salmonellaplasmidvirulencegene,spv）与细菌毒力密切相关，其毒力表型主要由三个区域介导，包括调节基因spvR、效应基因spvB和spvC。文

4、献报道spvB的编码产物具有ADP核糖基转移酶活性，可诱导细胞骨架解聚。本课题组前期研究发现spvB可抑制宿主细胞自噬体的形成，但相关的分子机制尚不清楚。本研究第一部分以人宫颈癌上皮细胞HeLa（humanepithelialcellline）为感染模型，通过自噬通量和自噬体形成过程与细胞骨架的相互作用为研究点，探究spvB影响自噬体形成的分子机制。第二部分建立斑马鱼感染模型，深入研究在动物体内spvB基因对沙门菌感染后肠道上皮细胞自噬及感染结局的影响，揭示沙门菌毒力基因的致病机制，为治疗和控制肠道感染

5、性疾病提供新思路。方法：一.沙门菌毒力基因spvB抑制细胞自噬的分子机制本课题第一部分选用鼠伤寒沙门菌（SalmonellaentericaserovarTyphimurium，S.typhimurium，STM）野生株STM-WT（携带沙门菌毒力基因spvB）、突变株STM-ΔspvB（消除spvB基因）和回补株STM-c-ΔspvB（利用重组载体将spvB导入ΔspvB）分别感染HeLa细胞，建立体外细胞感染模型，进行下面实验：1.透射电子显微镜观察细胞的超微结构收集感染后1h和2h的细胞，制作超薄

6、切片，用透射电子显微镜（transmissionelectronmicroscope，TEM）观察三株菌感染HeLa后细胞的超微结构，比较感染不同时间点细胞内自噬体的形成及细菌的侵袭情况。2.共聚焦激光显微镜观察LC3点状聚集用mRFP-GFP-LC3质粒转染HeLa细胞，细菌与细胞共作用1h后，在共聚焦激光显微镜（confocallaserscanningmicroscope，CLSM）下观察细菌感染后细胞内LC3的点状聚集；利用自噬激活剂雷帕霉素（rapamycin，RAPA）和自噬抑制剂巴弗洛霉素

7、A1（BafilomycinA1，Baf）预处理，比较不同感染组之间黄色LC3的点状凝集颗粒的数目，以及药物干预前后LC3点状凝集颗粒的变化。I中文提要沙门菌毒力基因spvB抑制细胞自噬的分子机制及对斑马鱼感染模型的影响3.共聚焦激光显微镜观察细胞骨架、蛋白与细菌的共定位将细胞铺入含小圆玻片的24孔板中，于细胞培养箱中培养至对数生长期，分别转染EGFP-Beclin-1、EGFP-Atg14和pGFP-ZFYVE1质粒，与细菌共作用1h后，用鬼笔环肽（phalloidin）染色细胞骨架，呈现红色，利用沙

8、门菌特异性抗体与荧光二抗结合后对细菌进行着色，将细菌标记为蓝色，借助共聚焦激光显微镜观察细胞骨架、蛋白与细菌三者的共定位。4.荧光显微镜下观察p62与感染细菌共定位收集感染后1h的细胞，抗体孵育后，荧光显微镜下观察各感染组中细菌与p62蛋白共定位情况，计算共定位的细菌占侵入细胞内细菌总数的百分比。5.Westernblot法检测自噬相关蛋白和p70S6K磷酸化的水平收集感染后1h和2h的细胞，采用蛋白免疫印迹（Westernblot，WB）