靶向猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白nsp12的shrna抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒在marcl45细胞中复制

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n叮HIBITIONOFPoRCINEREPRODUCTIVEANDRESPIRAToRYSYNDROM【EⅥRUSREPLICATIONBYSHORTHAIRPINTARGETTINGNON．STRUCTI厂RAI。PROTEIN12INM【ARC．145CELLSByHuaTingSupervisor：Prof．XiangMaoAThesisSubmittedtoNanjingAgriculturalUniversityInpartialFullfillmentofTheRequirementforTheMasterDegreeofVeterinaryMedicineCompletedinMarch，2012CommencementinJune，2012 IMIIIIll111111IllIIIIIIIIIIIIIIIIIbIIIY2360318原创性声明一一本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者(需亲笔)签名：钦路砌>年拍J／日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权南京农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。保密口，在——年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密√(请在以上方框内打“√")学位论文作者(需亲笔)签名导师(需亲笔)签名：W1)年多月J／日Wl涛6月l／Et暗，落伊：，、磁W0 目录目录摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．IABSTRACT⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯I英文缩写词表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯III文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1第一章猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．1猪繁殖与呼吸综合征的发现⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11．2猪繁殖与呼吸综合征病毒的形态学特征⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11．3猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子生物学特征⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．21．4猪繁殖与呼吸综合征病毒的流行病学⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．41．5猪繁殖与呼吸综合征病毒的临诊症状和病理变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．41．6猪繁殖与呼吸综合征病毒的致病机制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．51．7猪繁殖与呼吸综合征病毒的诊断方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．51．7．1病毒分离⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一61．7．2血清学诊断⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．61．7．3分子生物学诊断⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．7参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一lO第二章RNA干扰的研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一132．1RNA干扰的发现及发展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯132．2RNA干扰的机理研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯142．2．1起始阶段：⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯142．2．2效应阶段⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯152．3RNA干扰的设计方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯162．4RNA干扰的应用研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯162．4．1RNAi在基因调节功能中的应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．172．4．2RNAi在病毒感染的预防及治疗中的应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一172．4．3RNAi在肿瘤治疗中的应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．172．5RNA干扰的问题与进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯18参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．19第三章PRRSVNSPl2shRNA抑制PRRSV在Marcl45细胞中复制的研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯21 靶向猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白NSPl2的shRNA抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marel45细胞中复制3．1实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯223．1．1菌株、载体、病毒及细胞⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯223．1．2主要试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯223．1．3仪器和设备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯223．2试验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．223．2．1设计shRNA⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。223．2．2重组载体的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯233．2．3细胞培养⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯263．2．4Marc．145细胞的共转染⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯273．2．5Marc．145细胞的转染⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯273．2．6Marc．145细胞感染PRRSV⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一283．2．7流式细胞术⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯283．2．8实时荧光定量-PCR⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一293．2．9Westernblot分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯303．3试验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯313．3．1重组载体的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯313-3．2shRNA抑制PRRSVnspl2蛋白的表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．323．3．3shRNA抑制PRRSV在Marc．145细胞上的细胞病变⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．333．3．4shRNA减少PRRSV在Marc．145细胞上的感染率⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯343．3．5shRNA可抑制PRRSV亚基因组基因转录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯353．3．6shRNA可抑制PRRSV亚基因组基因翻译⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯373．4讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。38参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．39全文总结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯40附翥之⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．4l致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一454 摘要靶向猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白NSPl2的shRNA抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marcl45细胞中复制5乙叩lJ摘要猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)，属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属，为单股正链RNA病毒，基因组全长约15kb，含有9个开放性阅读框。开放性阅读框la(ORFla)和开放性阅读框lb(ORFlb)占整个基因组的80％。ORFla上游编码一个单个的聚合蛋白la(ppla)，该聚合蛋白被预测可被切割成8个非结构蛋白，即NSPl．8。ORFlb下游编码一个聚合蛋白，其与ppla共同参与核糖体移码的机制。ORFlab的基因产物与聚合蛋白lab(pplab)有关。ORFlb编码的聚合蛋白可被水解蛋白酶裂解，形成NSP9—12的多肽。剩余的开放性阅读框(2a,2b和3．7)编码病毒的结构性糖蛋白2a、3、4、5(GP2a，GP3，GP4，GP5)，非糖基化的2b／E，膜蛋白和核蛋白。RNA干扰(RNAi)是小干扰RNA分子引起的自然发生的基因抑制的细胞机制，其中这些siRNA与靶基因的某些区域具有同源性。RNAi的应用可通过两种类型的分子调节：一种是化学合成的双链小干扰RNA(siRNA)，另外一种是连接载体的小发夹RNA(shRNA)。为了达到shRNA有效构建的高效能和可持续的效应，通常利用低拷贝数的shRNA，减少脱靶效应，并且其可诱导哺乳动物细胞产生长效性的RNA沉默，而小干扰RNA在转染的动物细胞中的效应相比较而言，比较短暂。最近几年，RNA干扰作为一种实验室工具从而被广泛应用，主要用于病毒和细胞基因功能的研究，从而达到识别基因调节病毒感染和复制的目的，并且可作为一种新的治疗病毒感染的可行性的方法。在本研究中，我们分别设计了两条靶向PRRSVNSPl2基因的shRNA，以期通过RNA干扰来研究NSPl2基因的功能。实验结果显示，两条shRNA均可有效地抑制PRRSV在Marc．145细胞中的复制。另外，我们证明靶向NSPl2的shRNA可抑制PRRSV亚基因组的复制与翻译。关键词：RNA干扰；PRRSV；NSPl2；shRNA 摘要INHIBITIONOFPORCINEREPRoDUCTIVEANDRESPIRATORYSYNDROM[EⅥRUSREPLICATIONBYSHORTHAIRPIN’眦GETTINGNON．STRUCTI】．RAI．PROTEIN12INⅣ队RC．145CELLSABSTRACTPorcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)whichissingle-strandedpositive-senseRNAvirusisamemberofthefamilyArteriviridaeintheorderNidovirales．The～15kbPRRSVgenomecontainsnineoverlappingopenreadingframes(ORFs)．ORFlaandlbcompriseabout80％ofthegenome．TheupstreamORF1aencodesasinglepolyproteinla(ppla)，whichispredictedtobecleavedtoformninenon。structuralproteins：NSPlthrough8．ThedownstreamORFlbisexpressedasafusionproteinwithpplabyamechanisminvolvingribosomalframeshiR．TheORFlabgeneproductisreferredtoaspolyproteinlab(pplab)．ProteolyticcleavageofthepolyproteingeneratesthepolypeptidesNsp9through12．TheremainingORFs(2a，2band3—7)codeforviralstructuralglycoproteinGP2a,GP2b，GP3，GP4,GP5，unglycosylated2b／Eandmembrane(M)proteinsandanucleocapsidproteinm)．RNAinterference(RNAi)isanaturallyoccurringcellularmechanismofgenesuppressionwhichisinducedsmallinterferingRNA(siRNA)moleculeshomologoustosomeregaonofthetargetgene．TheapplicationsofRNAicanbemediatedthroughtwotypesofmolecules；thechemicallysynthesizeddouble-strandedsmallinterferingRNA(siRNA)andvectorbasedshorthairpinRNA(shRNA)．OptimizedshRNAconstructsalloWforhighpotencyandsustainableeffectsusinglowcopynumbersresultinginlessoff-targeteffects，anditinduceslonglastingRNAsilencinginmammaliancells，whiletheeffectofshortinterferingRNA(siRNA)isgenerallytransientintransfectedanimalcells．Intherecentyears，RNAihasbecomewidelyusedasanexperimentaltooltostudyviralandcdlulargenefunction，toidentifygenesthatregulatevirusinfectionandreplication．anditrepresentsanewfeasibleapproachtodevelopeffectivetreatmentsforviralinfections．Inthisstudy，wedesignedtwoshRNAtargetingdifferentregionsofNSP12geneto 靶向猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白NSPl2的shRNA抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marcl45细胞中复制studythefunctionofNSP12gone．TheresultsshowedthatbothoftheshRNAwerevalidatedtoinhibitPRRSVreplicationinMarc-145cells．Additionally,wedemonstratedthatshRNAtargettingNSP12caninhibitPRRSVsubgenomereplication．KEYWORDS：RNAinterference；PRRSV；NSP12；shRNA 英文缩写词表ADE峨PbpBsADMSODNA心11PdsRNAELISAFCSGPIPMA18HMarcOI心洲PCRPEGPHPRRSVAntibodyDependentEnhanceAdenosineTfiphosphatebasepairbovineserumalbumindimethylsulfoxidedeoxyribonucleicaciddeooxynucleosidetriphosphatedoublestrandedRNAEnzyme—LinkedImmunoSorbentAssayfetalcalfserumglycoproteinImmunoperoxidasemonolaycrassayInsituhybridizationmonkeycellopenreadingframeprocinealveolusmaerophagepolymerasechainreactionpolyethyleneglycolhydrogenionconcentrationPorcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus抗体依赖性增强作用三磷酸腺甙碱基对牛血清白蛋白二甲基亚砜脱氧核糖核酸脱氧核苷三磷酸双链RNA酶联免疫吸附试验胎牛血清糖蛋白免疫过氧化物酶细胞单层试验原位杂交技术猴胚胎肾上皮细胞开放性阅读框猪肺泡巨噬细胞聚合酶链式反应聚乙二醇氢离子浓度指数猪繁殖与呼吸综合征病毒PTGSposttranscriptionalgenesilencing转录后基因沉默rpmrevolutionsperminute转每分钟RNARibonucleicAcid核糖核酸核糖核酸RNAiRNAinterference．核糖核酸干扰SDSsodiumdodecylsulfate十二烷基磺酸钠siRNAsmallinterferingRNA小片段干扰核糖核酸IFAImmunofluorescenceantibody免疫荧光抗体 靶向猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白NSPl2的shRNA抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marcl45细胞中复制 文献综述第一章猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究进展文献综述第一章猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究进展1．1猪繁殖与呼吸综合征的发现猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)，又称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的一种高传染性的疾病。该病首次发生于1987年的美国中西部，临床症状主要表现为怀孕母猪早产，流产，产木乃伊胎、弱胎、死胎等繁殖性障碍症状，成年猪为呼吸道症状，新生仔猪成活率下降等，随后在短短的几年内，该病迅速蔓延至世界各地，给养猪业造成了巨大的经济损失。1992年，欧盟首次提出建议，将该病正式命名为猪繁殖与呼吸综合征。1996年，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所第一次从国内疑似猪繁殖与呼吸综合征的病例猪中分离得到猪繁殖与呼吸综合征病毒[1】，并且进一步证明该病是由美洲型的PRRSV感染所致。近几年，此病在国内呈现高发的趋势，并且我国流行的主要为美洲型毒株[2，3]。1．2猪繁殖与呼吸综合征病毒的形态学特征猪繁殖与呼吸综合征病毒粒子大部分呈球形，直径大约在45～65nm之间，核衣壳呈20面立体对称，直径25～35nm，外面为脂质囊膜，其厚度为12"--15nm，表面有细小纤突，长12～15nm。核衣壳内为单股正链线状基因组RNA，大小为15kb，沉降系数为48S左右，具有感染性。病毒粒子内没有酶等非结构蛋白，而是具有4种结构蛋白，它们分别是：核衣壳蛋白，简称核心蛋白N；非糖基化的囊膜蛋白M；2种糖基化的囊膜蛋白[4，5]。 靶向猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白NSPl2的shRNA抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marcl45细胞中复制图1．1PRRSV的病毒模式图Figl一1Schematicrepresentationoftheporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus1．3猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子生物学特征猪繁殖与呼吸综合征病毒为单股正链RNA病毒，有囊膜，表面有细小的纤突。其基因组全长为，15Kb，含有9个开放性阅读框(ORFs)，病毒基因组的阅读框并不是界限明确的，而是每个阅读框都和相邻的阅读框有部分重叠。5’端ORFl上游是非编码区，欧洲型大约由189．190个核苷酸组成，而欧洲型则由221．223个核苷酸组成，虽然欧洲型和美洲型的非编码区差异非常大，同源性仅为50％，但是其核酸序列高度保守。ORFl是所有的阅读框中最大的一个，其基因片段长约12Kb，包括ORFla和ORFlb，占据基因组的80％。ORFla含有一段高度保守的。编码起始区的核心序列，为5-I7AACCAUG3’。ORFla编码区包括一些疏水区、一个丝氨酸蛋白酶区和富含半胱氨酸区，其中ORFla的编码产物为一个聚合多肽，并且可被其自身编码的蛋白产物切割成8个非结构蛋白(NSP1-8)[6】。在紧接ORFla起始密码子的前导序列中含有2个发夹结构，具有4个结构域：聚合酶基元序列，富含半胱氨酸和组氨酸的锌指区，蜗牛酶基元列，功能不明的保守区域[7】；而ORFlb则存在4个结构域：富含半胱氨酸和组氨酸的锌指区，聚合酶元序列，蜗牛酶基元序列以及功能不明的保守区域。ORFla和ORFlb具有重叠的部位，包括16个核苷酸，包括庚核苷酸结构(UUUAAAC)和拟节结构。这两种结构是聚合酶翻译过程中的核糖体移码所必须的，缺一不可。同时，ORFlb的翻译则是由核糖体的移码来实现的。ORFlb不具备编码具有水解功能的蛋白酶的能力，但是它可由ORFla编码的水解蛋白酶裂解，产生4个成熟的非结构蛋白(NSP9--一12)[8】。其中，NSP9为病毒复制酶，保守性序列比较高，有一个SDD，核心氨基酸三联体和4个保守性的存在于单股正链RNA 文献综述第一章猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究进展病毒中的基序；NSPl0具有解旋酶活性，它的活性主要受多聚核苷酸的调节，其对温度和pn值均相当敏感；而NSPl2的变异性则比较大，仅仅存在于冠状病毒、动脉炎病毒中，而在其他正链RNA病毒中并没有发现NSPl2的存在。3’端有7个开放性阅读框(ORF2a，2b．7)，而ORF2一ORF7是猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组的结构基因，主要作用是编码病毒的结构功能性蛋白。其中，GP2是糖蛋白，由ORF2编码，其肽链内含有二硫键，合成后装配在病毒粒子中，是PRRSV的结构蛋白。另外，通过体内表达发现，GP2也可出现在内质网上，这一现象说明GP2可能是在内质网上组装后，才被运输到高尔基体的。GP3的分子质量大约为45Ku，含有265个氨基酸，7个N．糖基化位点，+为病毒的结构蛋白由，其由ORF3编码。GP4的分子质量为19．20Ku，由ORF4编码。GP5，为糖基化的囊膜蛋白，分子质量为22．4Ku，有4个糖基化位点，由ORF5编码，存在特定的亲水区糖基化位点。尽管美洲型和欧洲型毒株基因组在序列上存在很大的差异，但其GP5蛋白的亲水性却极其相似。GP5蛋白还含有一段很大的内部疏水区，可能起锚定膜的作用。GP5总共含有6个抗原决定簇，其中一个是血清型特异性线性中和抗原决定簇，可在体外中和病毒感染，从而诱导机体产生中和抗体。此外，GP5对T淋巴细胞增殖反应具有一定的刺激作用，仅次于M蛋白，这一现象表明GP5在诱导PRRSV特异性细胞免疫中也发挥到了重要的作用。最近有研究证实，GP5还可以刺激细胞凋亡。另外，GP5的特异性单克隆抗体，在PRRSV的传代细胞系感染中也具有中和作用[9-1。膜基质蛋白，又称M蛋白，分子质量为19Ku，含有一个糖基化位点，为非糖基化蛋白，是由ORF6编码的。膜基质蛋白一般聚集于粗面内质网上，而且M蛋白的N端存在3个跨膜区，均为疏水性的。M蛋白可于GP5蛋白形成异源性二聚体，从而在GP5蛋白的成熟极其病毒侵染过程中发挥作用[10]。有研究证实，M蛋白是北美毒株结构性功能蛋白中高度保守的非糖基化的蛋白，但是其具体存在的区域仍不是特别清楚，有可能存在于病毒囊膜内，也可能存在于一个较大的外部区。另外，M蛋白在免疫原性感染10d后，可检测到抗体应答，因此其还可应用于抗体应答时的检测。此外，M蛋白还可诱导产生中和抗体，其与GP3、GP4、GP5诱导产生的抗体具有一样的作用；核衣壳蛋白，又称N蛋白，分子质量为15Ku，其与M蛋白类似，存在一个糖基化位点，也为非糖基化蛋白，是由ORF7编码的。N蛋白保守性很好，在病毒粒子中含量很高，并且免疫原性极也很强。N蛋白不仅可以与相同的N蛋白通过二硫键形成同源二聚体，而且其也可以与膜基质蛋白、GP5蛋白形成异源性的二聚体。另外，N蛋白至少含有5个抗原决定簇，其中既存在对所有毒株都保守的共同决定簇，也存在对欧洲型具有特异性的决定簇。有研究证实，实验动物感染猪繁殖与呼吸综合征病毒后，首先产生抗N蛋白的抗体，并且此抗体持续时间长，但是美中不足的是，它并无中和病毒的能力。因此，N蛋白 5靶向猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白NSPl2的酬心『A抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒在Maml45细胞中复制一般作为诊断猪繁殖与呼吸综合征病毒的的靶抗原。PRRSVgenometranslationnsp：la弗234678a|3～3’pplab(3854／3960a耐9彳D彳ff2图1-2PRRSV的基因组结构㈣1．4猪繁殖与呼吸综合征病毒的流行病学自1996年中国农业科学院哈尔滨兽医研究所第一次从国内疑似猪繁殖与呼吸综合征的病例猪中分离得到猪繁殖与呼吸综合征病毒以来，据调查显示，PRRS在我国各地的流行趋势与范围越来越宽泛。另外，‘PRRSV在猪群中的持续性感染和免疫抑制性也已得到证实。经检测发现，国内省、市、自治区PRRSV的抗体阳性率均达到50％左右。PRRSV具有高度的传染性，通过口、鼻、眼、阴道等接种10个或更少的病毒粒子接种猪，就可引发该病。另外，PRRSV具有持续感染的特性，还可造成免疫抑制，对我国的养猪业造成了重大的经济损失。各年龄段的猪均是易感群体，感染途径很多，其中包括口、鼻、眼、阴道等。猪群一旦感染上了PRRSV，便很难根除，大多数的感染猪群一般长期带毒，因此导致猪群的免疫力下降。一旦其他病原侵入，很容易引起猪群大面积大范围的暴发该病。1．5猪繁殖与呼吸综合征病毒的临诊症状和病理变化根据病的严重程度和病程的不同，猪繁殖与呼吸综合征临诊表现不尽相同。母猪表现为发热、厌食、食欲减少、精神沉郁等。妊娠后期发生流产，早产，产死胎、木乃伊胎等，常造成母猪不育或产奶量下降，少数猪耳部发紫，皮下会出现青色或紫色的血斑，病症后期表现为不同程度的呼吸道症状。2．28日龄的仔猪感染后死4 文献综述第一章猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究进展亡率高达80％。大部分感染仔猪均有呼吸道症状，具体表现为呼吸困难、打喷嚏、嗜睡，还有少部分猪会有神经性症状，比如后肢麻痹、共济失调等，有的仔猪还会表现为耳部以及躯体末端皮肤发钳。公猪感染后表现为呼吸急促、咳嗽、喷嚏、食欲不振、精神沉郁、性欲减退以及精液质量下降等。育成猪则会发生结膜炎和腹泻，严重者会出现肺炎等症状。猪繁殖与呼吸综合征的病理变化主要表现为：在感染病毒48h后，经剖检发现，病变主要发生在肺部，肺水肿，呈间质性肺炎性变化。肺叶常存在“胰样变”和“肝样变"。皮下脂肪、肌肉、腹膜以及肾周围脂肪等部位发生水肿，呈胶冻样。全身淋巴结不同程度的肿大。组织学变化主要发生在单核巨噬细胞系统，鼻甲部黏膜上皮细胞变性与支气管上皮细胞变性。肺泡壁发生肥大与增生，膈有巨噬细胞和淋巴细胞浸润。动脉周围淋巴鞘的淋巴细胞减少，细胞核破裂和空泡化。流产胎儿及死胎会出现心肌炎、动脉炎和脑炎等[12】。1．6猪繁殖与呼吸综合征病毒的致病机制PRRSV一般在机体内的单核细胞和巨噬细胞内感染和增殖。猪繁殖与呼吸综合征病毒感染细胞后，首先在黏膜表面的巨噬细胞内增殖，再分散到全身各组织的单核细胞与巨噬细胞内。PRRSV进入肺泡，首先与肺泡巨噬细胞的受体结合，然后再通过胞饮作用进入细胞，在肺泡巨噬细胞及内皮细胞中进行复制和翻译，从而造成大量的巨噬细胞凋亡。有研究证实，PRRSV感染实验猪2h后，肺泡巨噬细胞的吞噬作用显著增强。不可思议的是，感染7d后，肺泡巨噬细胞的吞噬作用反而明显下降，因此导致细胞外的病毒不能被消灭，从而使机体的防御机制遭到破坏，容易引起并发感染，使感染病毒的猪的免疫力下降，引发免疫抑制。单独感染PRRSV所引起的临床病理变化一般表现为间质性肺炎，但实际临床上PRRSV引起的病理变化往往比想象中更为严重【13]，这说明一般的猪场中存在PRRSV与其他病原(猪圆环病毒2型、附红细胞体、大肠杆菌等)的混合感染[14．15】。1．7猪繁殖与呼吸综合征病毒的诊断方法根据母猪妊娠后期发生流产、新生仔猪高死亡率、高传染率等临诊症状和间质性肺炎等可初步做出判断。但是，首先，某些病毒性(2型圆环病毒等)和细菌性(猪链球菌、猪放线杆菌、多杀性巴氏杆菌、猪副嗜血杆菌等)的继发性感染，并且它们又极易与PRRS发生混合感染；其次，PRRSV与其它的猪繁殖性障碍的疾病(猪瘟、猪细小病毒病、日本乙型脑炎、伪狂犬等)的临床症状比较类似，并且PRRSV在不同的猪场 靶向猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白NSPl2的shRNA抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marel45细胞中复制间引起的临床症状差异非常大，这两点均加重了临床诊断工作的难度，因此必须要进行实验室检测才能进一步确诊。1．7．1病毒分离此法是诊断本病最为简便可行及准确的方法。一般利用猪肺泡巨噬细胞和Marc-145细胞进行病毒的分离培养。PRRS急性发病时，容易出现病毒血症，因此急性期采样时，分离病毒的成功率比较高。一般情况下，采集肺脏、血清、淋巴结、扁桃体以及脾脏等用于病毒的分离[16]。在感染初期，肺脏、血清都适于病毒分离鉴定，但经过一段时间后，血清的PRRSV的分离率将明显低于肺脏组织的[17】，此时一般取肺脏组织作病毒分离。此外，唾液、精液、空腔与鼻腔的刮脱物等[18，19]也可用于病毒分离。另外必须要注意的是，因为公猪可通过精液传播PRRSV，所以一定要加强对公猪PRRSV的检测，但由于精液属于间歇性排毒，而且，有时公猪PRRSV精液带毒时间比病毒血症的时间短，因此只收集公猪的精液进行病毒分离鉴定极有可能会漏检，还应同时收集公猪的血清样本以进行病毒分离鉴定和检测血清抗体。1．7．2血清学诊断由于抗原检测主要用于对分离物进行定性鉴定或研究PRRSV在体内的动态分布规律，而病毒抗原主要分布于肺、扁桃体、胸腺、脾等组织。因此猪感染PRRSV后血清抗体可长时间持续存在，且抗原检测时病料组织的处理步骤又较为繁琐，因此，血清学试验检测抗体更适宜于PRRS的疾病监测和诊断。1．7．2．1免疫胶体金技术(Immunecolloidalgoldtechnique)免疫胶体金技术(Immunecolloidalgoldtechnique)是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术，是1986年Fritz等在免疫金银法基础上建立起来的。该检测技术具有快速、准确、操作简便、敏感性高，特异性强，易于判断等优点，被应用于大量的PRRSV抗原标本的检测。1．7．2．2荧光抗体试验(IFA)IFA是美国、加拿大、日本等国广为应用的血清学诊断方法，具有较好的特异性和敏感性，利用相应毒株感染PAM、Marcl45单层细胞作为诊断抗原，应用异硫氰酸荧光素标记，直接检测细胞中的抗原。但是荧光抗体实验结果判断带有一定的主观性，且不适用于大规模临床样品的检测。1．7．2．3免疫过氧化物酶细胞单层试验OPMA) 文献综述第一章猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究进展IPMA是欧洲国家广为应用的血清学诊断方法，在美洲和亚洲国家也较为常用。该方法敏感性和特异性与IFA相当，抗原制备也与IFA法相同，最早可于第5d'-'-'6d检测出血清抗体。TakashimaH等【20】对抗原的制备方法进行了改良。1．7．2．4酶联免疫吸附试验(ELISA)常用间接酶联免疫需附试验，其具有特异性强和敏感性高的特点，此法方便易行，操作过程及结果判断标准化，适宜于大规模检测血清样品。与IPMA和IFA相比，虽然血清中PRRSV的ELISA抗体出现时间与它们大致相同，但是ELISA抗体的持续时间却明显长于它们。ELISA存在两种抗原：从细胞培养物中纯化的全病毒抗原和重组的PRRSV核衣壳蛋白。但是，ELISA试验本身存在一个之名弱点，就是它很难根除较强烈的背景反应。1．7．2．5血清中和试验(SN)血清中和试验的特异性很好，且血清中和抗体的持续时间要明显低于IPMA抗体和IFA抗体的持续时间。另外，该方法需进行细胞培养，实验条件要求比较高，而且猪感染PRRSV后，中和抗体出现的时间较晚。因为其敏感性差，所以该方法一般不用于急性感染和早期诊断。1．7．3分子生物学诊断PRRSV的ORF5和ORF6是病毒亚基因组中比较保守的序列，分子生物学的诊断一般依赖于这两种基因。1．7．3．1RT-PCR技术目前RT-PCR是分子生物诊断方法中应用最广泛的一种方法。现在已建立多种RT-PCR法检测PRRSV基因的方法，并己广泛应用于PRRSV的检测及临床诊断，并在方法上得到了不断改进和提高[21．23]。通过特异性的引物还可区分美洲型与欧洲型毒株。(1)常规RT．PCRSuarez等建立了检测PRRSV的常规RT-PCR法，这种方法一般应用于病毒感染24h后，检测血液、精液以及组织样品中的病毒核酸。而利用血清学方法检测抗体时，一般感染后9d左右才能被检出，时间比较长，此外，对于持续性感染的病原体，常规RT-PCR方法的结果能更准确地反映其带毒状态。综上所述，常规RT-PCR比血清学诊断，作用时间短，反应更灵敏，但是其本身易出现假阳性污染的干扰。(2)多重PCR多重PCR(multiplexPCR)又称多重引物PCR或复合PCR，是一种特殊的PCR技 靶向猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白NSPl2的shRNA抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marel45细胞中复制术，在同一PCR反应体系里加上两对或两对以上的引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。它可以简单、快速的同时检测出两种或两种以上的病毒DNA。GilbertSA等【24】，根据PRRSVORFlb的序列设计引物进行多重PCR，用来鉴别不同基因型的毒株。(3)RT．PCR微孔比色法利用靶序列，设计出用生物素标记的PCR引物，然后进行RT-PCR扩增，得到目的片段，然后将目的片段加入到包被有PRRSV基因的微量反应板中，反应后，加到磷酸酶标记的亲和素中，最后加入底物显色，测定OD值[25]。(4)RT—nestedPCRKonoY等[26】根据美洲型和欧洲型PRRSV基因组的保守序列设计了一对通用引物，用以扩增美洲型和欧洲型的相应片段，再分别合成一对美洲型和欧洲型PRRSV的特异性引物，对上述PCR产物进行扩增，从而达到了检测和分型的目的。RT-nestedPCR可用于检测各种临床样品，其敏感性比常规RT-PCR高100--1000倍。(5)RT—PCR-I江LP组织病料或分离物经RT-PCR之后，用几种限制性内切酶进行RFLP(restrictionfragmentlengthpolymorphim)分析，可鉴别不同基因型毒株之间的差异，不仅可以鉴别疫苗毒株与野毒株感染，还可区分混合感染的不同毒株[27]。(6)荧光定量RT．PCR实时荧光定量PCR是将PCR与荧光检测方法相结合，具有强特异性、高敏感性、重复性好、结果直观易懂等优点，而且与常规RT-PCR相比，其可以避免假阳性污染的干扰。宋志军等[28】研究表明，与常规RT-PCR相比，荧光定量RT-PCR的灵敏度至少要高100倍。荧光定量PCR方法也存在一些缺点：荧光定量PCR的探针造价比较昂贵，而且探针对序列的变化也非常敏感。正因为如此，探针的设计和筛选是荧光定量RT-PCR检测的关键。因为成本高，此方法不宜适用于对PRRS大规模的临床诊断，但是其高敏感性和强特异性，可将其应用于PRRSV致病机理和疫苗效价的检测等方面的研究。1．7．3．2原位杂交技术(IsH)原位杂交技术是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。应用于PRRSV检测的原位杂交的cDNA探针主要是针对PRRSVORF7设计的[29]。ISH的检出的持续时间长，而且敏感性均高于免疫胶体金技术和免疫组化法[30】。 文献综述第一章猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究进展另外，根据美洲型和欧洲型PRRSV的基因组序列设计合成不同的探针可区分出不同基因型PRRSV的感染，而将两种探针混合后进行ISH，则两种基因型的感染均可检出[31】。 靶向猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白NSPl2的shRNA抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒在Maml45细胞中复制参考文献【1】郭宝清，陈章水，刘文兴，等从疑似流产胎儿分离PRRSV的研究[J]中国畜禽传染病，1996，87，(2)：l-4．[2]谷红，杨汉春，郭鑫，等猪繁殖与呼吸综合征病毒株糖蛋白基因的克隆与分析[J]中国兽医学报，2002，22(3)：209-213．【3]伍义行，黄利权，王芳猪生殖—呼吸道综合征(PRRS)的诊断与防制【J】中国动物检疫，2002，(7)：42-47．【4】SuiJH，Doster氓OsorioFA．Apoptosisinducedinvivoduringacuteinfectionbyprocine，reproductiveandrespiratorysyndromevirus[J]。VetPathol，1998，35(6)：506·514．【5】DelputtePL，VanderhcijdenN,NauwynckHJ，eta1．Involvementofthematrixproterninattachmentofprocinereproductiveandrespiratorysyndromevirustoaheparinlikereceptoronprocinealveolarmacrophages[J]．JVirol，2002，76(9)：4321-4320．【6】MengXJ,Paulps，HalburPG,eta1．PhylogeneticanalysisoftheputativeM(ORF6)andN(ORF7)genesofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)implicationsfortheexistenceoftwogcnotypesofPRRSVintheUSAandEurope[J]．ArchVirol，1995(140)：745—755．【7】刘光清，蔡雪辉，仇华吉，等。猪繁殖与呼吸综合征的研究进展【J】冲国预防兽医学报，2001，23：72-76．【8】8MengelingWL，lagerKM，VorwaldAC．ClinicalconsequencesofexposingpregnangiltstostrainsofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusisolatedfromfieldcasesofatypicalPRRS[J]．AmJVetRes，1998，59：1540—1544．【9】蔡家利，姜平，蔡宝祥。应用RT-PCR检测流产胎儿组织中猪繁殖与呼吸综合征病毒[J】．中国病毒学，2000(3)：272．276．【10】VerhcijeMH，WeltingTIM，JansenHT'eta1．ChimericarterivirusesgeneratedbyswappingoftheMproteinectodomainruleoutaroleoftuisdomaininviraltarg-eting[J]．Virology,2002，303：364-373【1l】Nedialkova，D．D．，Gorbalenya，A．E．，Snijder,E．J．，2010．ArterivirusNsplmodulatestheaccumulationofminus-strandtemplatestocontroltherelativeabundanceofviralmRNAs．PLoSPathog．6(2)，e1000772．【12】陈溥言主编。兽医传染病学(第五版)【M]．中国农业出版社，2006．【13】宁玉宜，郑杰，张纯萍，等．我国南方高热病的研究I一大肠杆菌的分离、鉴定和致病性测定IJJ．中国兽药杂志，2006，40(12)：1-4．10 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靶向猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白NSPl2的shRNA抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marcl45细胞中复制reproductiveandrespiratorysyndromeviminsemen，serum,peripheralbloodmononuclearcells，andtissuesfromeYorkshire，Hampshire，andLandraceboarsp]．JVetDiagnInvest，2001，13：133-142．[28】MengelingWL，LagerKM，WesleyRD，eta1．Diagnosticimplicationsofconcurrentinoculationvirtls[J]．AmJVetRes，1999，60：119．122．【29】CheonDS，ChaeC．RestrictionfragmentlengthpolymorphismanalysisofopenreadingFrame5geneofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusisolatesinKorea[J】．ArchVh'oli，2000，145(7)：1481—1488．[30】YangL，Yoonkj，LiY,eta1．Antigenicandgeneticvariationsof15kunucleocapsidproteinofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusisolates[J]．ArchVirol，1999，144(3)：525．526．【31】OJLopezl，FAOsorio．RoleofneutralizingantibodiesinPRRSVprotectiveimmunity[J]．VetInlrfluanfImmunopathol，2004，102：155．163．12 文献综述第二章RNA干扰的研究进展第二章RNA干扰的研究进展RNA干扰(RNAinterference，RNAi)技术是一种高效的和特异性的调节基因表达技术。RNA干扰是由内源性或外源性的双链RNA(dsRNA)Ej[起的序列特异性的转录后基因沉默(posttranscriptionalgenesilencing，PTGS)机制[1】。此技术因其快速、简洁、特异性强等的优点，而应用于基因功能研究和抗肿瘤、抗病毒治疗研究等多个领域，成为功能基因组领域和医学领域的又～新的宠儿，并且很多研究及医疗机构正积极准备在未来的几年内将其应用于临床实践。2．1RNA干扰的发现及发展RNA干扰现象最早被发现于植物中，后来发现这种现象普遍存在于几乎所有的真核生物细胞中，类似于一种古老的以及高度保守的免疫机制。1990年，Napoli教授与其同事在研究矮牵牛花查尔酮基因时发现，通过在体外扩增控制矮牵牛花花色的基因查尔酮基因片段，连上花椰菜花叶病毒的35S强启动子，再连接到农杆菌的ToDNA载体，得到重组载体，在矮牵牛花中过度表达，以期达到加深花色的目的。结果却显示矮牵牛花子代花颜色并未加深，经进一步的研究发现，内源性的查尔酮基因被沉默。Napoli教授把这一现象称之为内源性基因共抑制现象(eosuppression[2]。1992年，RamamorN等将合成的胡萝卜素基因导入粗糙脉孢菌中，经观察发现，其中大约有30％的被转化的粗糙脉孢菌细胞中，自身合成的胡萝卜素基因被沉默，他们称这一现象为基因静．d=(quelling)[3]。1995年，Guo等[4](康奈尔大学)在研究线虫的基因功能时，利用反义RNA技术特异性地阻断秀丽新小杆线虫中的par-1基因的表达，期望可以得到与对照组注射正义RNA相反的结果，但是结果却发现：正义链与反义链导入出现了类似的现象。Guo教授，据此推测正义RNA可能同反义RNA一样能有效抑制互补序列基因的表达，并提出了RNAi现象的概念，但当时并未取得十分令人信服的解释。1998年，Fire和Mello等继续研究Guo教授的秀丽新小杆线虫发育过程中的关键基因par-1的课题。Fire和Mello在研究过程中，发现正义RNA和反义RNA的抑制作用并不是单独正义链的作用，而是正义链中污染了反义链后形成的双链RNA所致【5】。他们随后又研究了秀丽新小杆线虫另一基因-1111c．22基因，进一步证实了这一想法，发现双链RNA能够特异地抑制nc．22基因的表达，他们称这一基因沉默现象为 靶向猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白NSPl2的shRNA抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marcl45细胞中复制RNA干扰删)，即双链RNA在mRNA水平上沉默互补序列基因的表达。并且，双链RNA所引起的基因沉默效应要比单单应用反义RNA或正义RNA强十几倍。1999．2000年间，发现植物、真菌、大肠杆菌、线虫、昆虫、蛙类、鸟类、大鼠、小鼠、猴、人类的几乎所有的真核生物细胞中均存在发现RNAi现象[6】。2001年，RNAi技术被引用于哺乳动物细胞基因功能调节的研究中[7]，并且取得了非常成功的研究性进展。最近几年来，RNAi的研究取得了突飞猛进的发展，被{Science))杂志评为2001年的十大科学成就之一。2002年，RNAi研究取得了突出性的进展，有研究者发现它在基因表达调控中发挥了重要的作用，被((Science))杂志评为2002年的十大科学成就之首。自2002年5月以来，RNAi技术被大量应用于实践的报道层出不穷，其中主要包括被应用于抑制艾滋病病毒、丙型肝炎病毒和癌细胞的研究报道。随着研究的不断探索与深入，RNAi的机理正在被人们一步步的阐述和证明。另外，人们越来越重视RNAi在功能基因组学研究领域中的作用。在科技高速发展的今天，RNAi被发现在基因调控、基因功能的研究、发育生物学以及肿瘤和病毒的基因治疗等方面均发挥了重要作用。2．2砌悄干扰的机理研究RNAi的具体机制和过程尚不十分清晰，其中被大家广为接受的说法是它由dsRNA诱导的多步骤、多因素参与的过程，其中需要ATP的参与。dsRNA在Dicer酶的裂解作用下，形成19·27bp大小的siRNA，导致同源性的mRNA的精确降解，从而使目的基因失去表达的能力。其中，RNA干扰过程至少包括两个阶段：起始阶段和效应阶段。2．2．1起始阶段：dsRNA既有内源性的也有外源性的，其通过细胞膜进入细胞内，在胞质内的Dicer酶(是一种ATP依赖性核酸内切酶，属于RNA酶III家族中的一种序列特异性的核酸内切酶，广泛存在于蠕虫、真菌、植物及哺乳动物体内，结构上比较保守，包括1个螺旋酶结构域，1个PAZ结构域，2个RNAseIII结构域，1个双链RNA结合位点，可以在U处降解dsRNA)的作用下，被分解为小的双链RNA分子，大小为19bp'-一27bp，这种小的双链的RNA分子被称之为小干扰RNA(smallinterferenceRNA，siRNA)，SiRNA继而启动了细胞内的RNAi反应。14 文献综述第二章RNA干扰的研究进展2．2．2效应阶段由Dicer酶裂解产生的siRNA首先与Dicer酶结合，再与Agonaute等一些酶蛋白家族的成员结合，形成RNA介导的沉寂复合物(RNAinducedsilenceingcomplex，RlSC)。Dicer酶在ATP的作用下，发挥其解旋酶的作用，将双链siRNA解旋成单链siRNA，因此携带了单链siRNA的RISC就变成了具有活性的RISC。这种具有活性的RNA介导的沉寂复合物又被称为Slicer。此外，Slicer与目的mRNA结合后，siRNA的反义链可特异性地与细胞中具有同源性序列的mRNA自动进行配对，而Dicer酶发挥其内切酶的活性，对目的mRNA分子间与siRNA互补的区域进行酶切，只不过酶切部位大约与siRNA距离大约lO个碱基[8]。经酶切后的mRNA由于没有5’端帽结构和3’端Poly(A)尾巴的保护，它将很快被其它的核酸酶所切割降解。综上所述，siRNA在效应阶段，不仅发挥了诱导具有活性的RISC切割同源性的单链mRNA的作用，而且其也可以作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶作用下合成更多新的非目的性的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer酶酶切，产生大量的新的siRNA，从而使RNAi的作用逐级放大，最终将靶mRNA完全降解。故RNAi一旦启动，就可将其对应的目的mRNA全部降解，最终达到缺失突变的效应【9】。$-m萄t麓烈A寮蠢双链RIqA其豫双遵鼢lA一矮警链心弧|ll掣借∥—去叩—'-r—h—r下—榷双麓RNAj立E口墨旺E卫芷双曩l蝴lD豫盯双链fil想lA1．__IL一特异性簧自结合，蝴瞪IA解链活化晌蝴蠛A蛋白复食体，RISC图2-1RNAi作用机制U伽Fi92．1themechanismofRNAi[10】 靶向猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白NSPl2的shRNA抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marcl45细胞中复制2．3RNA干扰的设计方法关于如何设计siRNA以及siRNA设计对RNAi功能的影响，至今还没有非常可靠的规律。虽然我们可以通过对mRNA的实验分析准确的找到一段基因的全部siRNA的最佳作用位置，但这个过程十分耗时且昂贵，不推荐常规实验使用。一般做法是每个目标序列设计2．3对siRNAs，实验时选择比较有效的siRNA。1．有效的siRNA：一般21．23nt，带有对称的UU3’垂悬的双链。从转录本(mRNA)的AUG起始密码开始，寻找‘‘从”二连序列，并记下其3’端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。GC含量在30％～50％左右。2．在设计siRNA时不要针对5’和3’端的非编码区(UTRs)，因为这些区域含有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA，从而影响siRNA的效果。3．将潜在的序列和相应的基因组数据库(人，或者小鼠，大鼠等等)进行比较，排除那些和其他编码序列／EST同源的序列。4．选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。5．避免含有连续的4个或4个以上相同的碱基。6．鉴定列出的靶序列至少要有3或4个碱基，不能与基因组中任何其他相似大小序列相同。7．劈开可能形成的二级结构区域。8．设阴性对照。一个完整的siRNA实验应该有负对照，作为阴性对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查结果以保证它和其他基因没有同源性。如果计划合成siRNA，那么可以直接提供以AA打头的21个碱基序列，厂家会合成一对互补的序列。注意的是通常合成的siRNA是以3'dTdT结尾，如果要UU结尾的话通常要特别说明。有结果显示，UU结尾和dT(1T结尾的siRNA在效果上没有区别。因为这个突出端无需和靶序列互补。2．4IⅢA干扰的应用研究RNAi技术在科学研究中具有许多传统方法无可替代的的特点和优势：一：RNAi具有非常高的特异性，只能引起与dsRNA同源性序列的目的mRNA降解。二：RNAi技术中siRNA序列的选择空间比较大，21"-23个核苷酸中只要改变其中一个核苷酸， 文献综述第二章RNA干扰的研究进展就可导致siRNA序列对靶向mRNA不起任何的作用。综上所述，RNAi可用来抑制单个核苷酸突变基因的调控表达。另外，RNAi技术方法相对简单，对实验室条件要求不高，因此，我们可迅速了解掌握这门技术并将其应用于临床实践，对我们以后的研究发展提供了一定的便利。2．4．1RNAi在基因调节功能中的应用在植物、真菌、大肠杆菌、线虫、昆虫、蛙类、鸟类和哺乳动物等真核生物体中均发现了小干扰RNA，有的siRNA可以通过RNAi机制破坏靶基因转录，对基因表达水平进行调控，有的则通过结合3’非翻译区(UTR)和靶mRNA抑制mRNA翻译。同时内源性的的siRNA，也可通过使染色质浓缩已达到调节基因表达的目的【1l】。RNAi技术不仅可以通过选择不同的靶位点，还可以同时作用于具有高度保守序列的同一基因家族的若干个成员，从而简单快捷地抑制基因的表达调控，另外，RNAi技术也是研究家族基因功能的理想工具。2．4．2RNAi在病毒感染的预防及治疗中的应用抗病毒治疗研究的主要原理：一是抑制病原体在机体内的的复制及翻译，二是抑制某些与病毒感染相关的内源性基因的表达。研究者发现大多数RNA病毒感染机体后，引起的RNAi可促使病毒基因组降解。RNAi可以应用于多种病毒的基因治疗，从而成抗病毒感染的强大有利的武器。到现在为止，大多数的研究主要是通过体外直接合成特异性的siRNA，降解病毒基因组的RNA或mRNA，或者通过RNAi抑制参与病毒复制和翻译过程中的宿主细胞的某些基因的表达，从而发挥抗病毒作用。RNAi技术与很多传统方法相比，具有很多优点，高特异性、高效率、操作简单方便等，这就为感染病毒的预防治疗开辟了一条新的途径。现在，一般利用两种siRNA，来治疗HIV-1、脊髓灰质炎病毒、丙型肝炎病毒(HCV)、呼吸道合胞病毒、人乳头瘤病毒、流感病毒【12】传染性等疾病，一是针对病毒基因主要编码区的保守性序列的特异性的siRNA，二是与病毒感染有关的宿主细胞内源性基因的特异性的siRNA。最近的研究成果证实，RNAi能够阻断病毒在机体内的多个感染阶段的复制与翻译，这其中也包括病毒的感染早期，将在病毒感染复制过程中高度相关的基因作为靶基因，设计出特异性的siRNA，其可与靶基因发生特异性的结合，从而阻断病毒多个阶段的感染。这些研究成果都显示了RNAi在作为防治与治疗病毒感染方面的潜力。2．4．3RNAi在肿瘤治疗中的应用 靶向猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白NSPl2的shRNA抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marcl45细胞中复制正常情况下，机体的细胞增殖与凋亡存在一个动态平衡的状态，而肿瘤的发生则是这种平衡被打破了的结果，因此治疗肿瘤的关键是找到与其发生和转移的靶基因，而RNAi技术则可以高效特异性的在细胞水平上敲除靶基因，或者可以特异性的抑制肿瘤靶基因极其相关基因及突变基因的过度表达，从而使这些基因保持在静寂或者休眠状态，以达到治疗肿瘤的效果。肿瘤发生的根本原因是癌基因的被激活，这些癌基因可以作为靶基因，用以设计相其对应的特异性的siRNA。利用基因家族中多个基因具有相同的同源性很高的保守序列这一特性，针对这一区段序列设计相应的siRNA，通过体外合成或构建在体内表达siRNA的载体的方法，转染入细胞中，可以特异性的沉默这些基因的转录产物。Vardridge等以人表皮生长因子受体(hEGFR)为靶点，应用RNAi技术干扰其表达从而抑制颅内肿瘤的生长；Brummelkamp等用逆转录病毒载体将siRNA导入肿瘤细胞中，特异性抑制了癌基因K-RAS(V12)的表达[13】；WildaM等用siRNA抑制白血病BCR／ABL融合基因表达，特异性的抑制了白血病的恶化[14]；Salvi等用RNAi技术沉默了肝癌细胞中u．PA的表达，结果使其对应的靶基因所在的肝癌细胞的侵袭、转移和增殖能力显著下降[15】。虽然RNAi技术在治疗肿瘤方面的潜力巨大，但是仍然有一些问题阻碍了RNAi治疗应用的迅速发展，比如寡聚核酸合成的价格比较昂贵，构建可以在细胞内稳定表达的载体以及细胞转化率低等。随着研究的深入，这些均有待于解决，但对于肿瘤疾病的治疗，它无疑是一条康庄大道。2．5RNA干扰的问题与进展RNAi技术发展快速，在预防及治疗病毒感染和治疗肿瘤方面发挥了重要的作用，但是RNAi技术本身也存在很多问题：(1)RNAi的特异性是相对的。在设计siRNA和表达siRNA的载体时，针对靶基因的不同位点，化学人工合成的siRNA具有不同的RNA干扰效率，因此筛选有效位点，以确保治疗效果。(2)siRNA被转染入细胞的时候，可能与宿主细胞内原有的微小RNA形成竞争，从而导致干扰效率降低。(3)siRNA的转染率也有待提高。在IⅢAi与生物体的相互作用方面，一些基因或组织可能有抵抗RNAi能力，如线虫的神经系统。RNAi在技术方面还有不成熟因素，如寡聚核酸合成困难，易被降解，不稳定，细胞摄取效率低以及构建能在细胞内稳定表达的载体的生物安全问题等。但是随着研究的深入，此技术将日渐成熟并运用于更多更广的领域。 文献综述第二章RNA干扰的研究进展参考文献[1】FireA．RNA2triggeredgenesilencing【J】．ReviewTrendGenet，1999，15(9)：358-363．【2】2CarolynNapoli，RichardJorgensen，etalIntroductionofaChimericChalconeSynthaseGeneintoPetuniaResultsinReversibleCo—SuppressionofHomologousGenesintrailsThePlantCell1990V01．2，279·289[3】RomanoN，MacinoGQuelling：Transientinactivationofgeneexpressioninneurosporacragsabytransformationwithhomoogoussequences[J]．MolMirobiol，1992，6：334323353【4】GuoS,KemphuesKJ．par21，agenerequiredforestablishingpolarityinCelegansembryos，encodesaputativeSer／ThrkinasethatIsasymmetricallydistributed【J】．Cdl，1995，‘4)：6110620．[5】FircA，XuS，MontgomeryMKeta1．Potentandspecificgeneticinterferencebydouble2strandedRNAinCaenorhabditiselegans[J]．Nature，1998，391(6669)：806-811．[6]ElbashirSM，LendeckelW’TnsehlT．RNAinterferenceismediatedby212and222nueleotideRNAs[J]．GenesDev,2001，15：1882200．【7】LassusERodriguezJ，LazebnikYConfirmingspecificityofRNAiinmammaliancells[J]．SciSTKE，2002，(147)：13．【8】GregoryJ．Hannon，RNAinterference【J】．Nature，2002,418：244-251．【9】黄海．RNA干扰技术的进展及应用【J】．国外医学泌尿系统分册，2003年增刊．【10】李建霞，苗向阳，任惠英，丁兆忠，于忠娜．RNA干扰技术及其应用[J】．中国农学通报，2006．22(12)：5-8．[1l】付文金，巢时斌，彭剑雄．RNA干扰．国外生物学杂志【J】．2002，24(5)：2792281．【12】GeQMemanusMT,NguyenT’eta1．RNAinterferenceofinfluenzaviruspmductlonbydirectlytargetingmRNAfordegradalionandindirectlyinhibitingallvirusintranscription[J】．ProcNatlAeadSclUSA2003，100(5)：2718—2737．【13】PardrigeWM．Intravenous，nonviralRNAigentherapyofbraincancer[J】．ExpertOpinBiolTher,2004，4(7)：l103．(3)：243—-247．[14】WildaM，FuchsU，WossmannWeta1．KillingofleukemiccellswithaBCR／ABLfusiongenebyRNAinterference(RNAi)．Oncogene，2002，21(37)：5716-5724．【15】SalviA，AriciB，DePetroGeta1．SmallinterferingRNAurokinasesiliencinginhibitsainvasionandmigrationofhumanhepatocellularcarcinomacells[J]．MolCancer111er，2004，3(6)：67119 第三章PRRSVNSPl2shRNA抑制PRRSV在Marcl45细胞中复制的研究NSPl2shRNA抑制PRRSV在Marcl45细胞中复制的研究摘要：本试验利用PRRSV病毒基因组，根据已发表的PRRSV的NSPl2基因序列设计引物，经PCR方法扩增出PRRSV的NSP2的全长基因，与pEGFP-N1质粒相连，构建重组表达质粒。将shRNA与pEGFP-N1-NSPl2共转染，利用Westernbolt蛋白印迹法测定其对NSPl2蛋白表达的影响。接毒48h后，利用流式细胞术检测其对PRRSV在Marcl45细胞感染率的影响，实时荧光定量PCR检测其对病毒亚基因组基因转录的影响，Westernbolt蛋白印迹法检测其对病毒亚基因组基因翻译的影响。关键词：RNA干扰；PRRSV；NSPl2；shRNA猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是20世纪80年代末发现的一种疾病，其症状主要表现为怀孕母猪流产、早产、产木乃伊胎、死胎等繁殖性障碍症状，成年猪呼吸道症状，仔猪成活率下降等。猪繁殖与呼吸综合征病毒为不分节段聚腺苷酸化有囊膜的单股正链RNA病毒，其基因组全长为15Kb，含有9个开放阅读框架(ORFs)[1]，ORFl长约12Kb，包括ORFla和ORFlb，占据基因组的80％。其中ORFla的编码产物为一个聚合多肽，可被自身编码的蛋白酶切割成8个非结构蛋白似SP1-8)[2]。ORFlb由ORFIa编码的水解蛋白酶裂解，产生4个成熟的非结构蛋(NSP9．12)[3】，而ORF2．ORF7是病毒基因组的结构基因，主要编码病毒的功能性蛋白。RNA干扰是一种序列特异性的转录后基因沉默机制[4】，是由dsRNA诱导的多步骤、多因素参与的过程，其中需要ATP的参与，dsRNA在Dicer酶的作用下，可形成siRNA，导致同源mRNA的精确降解，从而使目的基因失去表达。RNAi的应用可通过两种类型的分子调节：一种是化学合成的双链小干扰RNA(siRNA)，另外一种是连接载体的小发夹RNA(shRNA)。shRNA与siRNA相比较而言，在细胞中的效应更加长效。在本文中，我们分别设计了两组针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的非结构蛋白(NSPl2)基因RNA不同区域的shRNA，用来研究NSPl2基因的功能。两组shRNA均可有效地抑制PRRSV在Marc．145细胞中的复制。另外，我们证明NSPl2可抑制PRRS．V亚基因组的复制。2l 靶向猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白NSPl2的shRNA抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marel45细胞中复制3．1实验材料3．1．1菌株、载体、病毒及细胞DH5a菌株，pEGFP．N1载体，Marc．145细胞，PRRSV均为为本实验室保存。3．1．2主要试剂FBS(优级胎牛血清)·购自北京鼎国公司；青霉素钠为山东鲁抗医药股份有限公司；硫酸链霉素购自华北制药厂；TransFastTM转染试剂购自美国麦迪逊Promega公司；DNAMarker，蛋白Marker均购自上海捷瑞公司。3．1．3仪器和设备水平电泳系统为BioRad公司产品；HW0301．VBA型C02培养箱为Thermoscien-title公司产品；超净工作台BCM．1000A购自苏州安泰空气技术有限公司；ZDX．35BI型自动电热压力蒸汽高压锅为上海申安医疗器械厂产品；6孔、24孔、96孔细胞培养板购自上海锐谷生物科技有限公司。3．2试验方法3．2．1设计shRNA1．利用网站http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／pubmed／blast到PI汛SVⅥ之．2332株的NSPl2基因序列如下：CCAACTTGAAGGTCGCTArTTCACCTGGTATCAGCTTGCCAGCTATGCCTCGTACATCCGTGTTCCTGTCAACTCTACGGTGTACTTGGACCCCTGCATGGGCCCCGCCCT丌GCAACAGGAGAGTCGTCGGGTCCACCCACTGGGGGGCTGACCTCGCGGTTACCCCTTATGArl'ACGGCGCTAAAATCATCCTGTCTAGCGC(、TACCATGGTGAAATGCCCCCCGGATACAAArTCTGGCGTGCGCGGAGTTCTCGTTGGATGACCCAGTL久GGTACAAACACACTrGGGGGTTTGAACGGATACAGCGTATCTGTATGAGTTCACCGGAAACGGTGAGGACTGGGAGG椰ACAATGATGCGl_ITCGTGCGCGCCAGGAAGGGAAAATTTACAAGGCCACTGCCACCAGCTTGAAGTTTCAr，mCCCCCGGGCCCTGTCATTGAACCAACTTTAGGCCTGAAT 第三章PRRSVNSPl2shRNA抑制PRRSV在Marel45细胞中复制的研究2．利用以下几个网站设计siRNA：www．promega．com／siRNADesigner：GACCCAGUCAAGUAUAAACAU256．276GAACCAACUUUAGGCCUGAAU439-459GGAUACAGCGUAUCUGUAUGA294．314www．ambion．com／techlib／misc／siRNA．tools．html：AAGTATAAAC√6I=】隗CCTGGGGG265AATCGGATACAGCGTATCTGT290AACCAACTrrAGGCCTGAATT440AⅪCGGA：r．ACAGCGT久rI了rGT29242．867．163．79／-34．60NAO纾’n虻qiagen．com／siRNA：252．GGATGACCCAGTCAAGTA姒A294．GGATACAGCGTATCTGTATGA333．GGACTGGGAGGAnACAATGA342．GGA兀ACAATGATGCGTITCG综合各个网站对设计出的siRNA序列的打分情况以及各网站设计的siRNA的重复率，最终选定序列凡盯CGGATACAGCGm叮CTGT以及AACCAAC珊GGCCTG氏Kno3．将设计好的干扰序列送到上海吉玛公司合成，并连接到载体pGPU6／GFP／Neo，将siRNA序列打乱后作为ScramblesiRNA。3．2．2重组载体的构建3．2．2．1NSPl2目的片段的扩增(1)应用随机引物，提取PRRSV感染的Marcl45细胞总RNA为模板进行反转录，将反转录得到的cDNA作为模板。(2)引物设计pEGFP-NSP12f：CTACTCGAGGGTCGCTA丌TCACCTpEGFP-NSPl2r：CGCGGATCCTCAATTCAGGCCTAAAG(3)聚合酶链式反应(PCR)PCR反应程序如下：10xPCRbuffer5．0IxL 靶向猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白NSPl2的shRNA抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marel45细胞中复制正向引物(20lamol／L)1．0lxL反向引物(20pmol／L)1．0lxL2xMixture2．5“L基因组模板1．0此ddH20补充至50¨LPCR反应条件为：94℃5min，94℃45S、56℃45S、72℃40S共进行30个循环，72℃10min。(4)PCR产物的回收按DNA小量凝胶回收试剂盒使用说明回收PCR产物，并对回收产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。具体操作过程如下：1)割下含目的条带的琼脂糖胶块，尽可能去掉不含DNA的琼脂糖胶。2)放入1．5mLeppcndorf管中。称量所割下胶块的重量，按照每100mg胶块加入300肛L溶胶液的比例加入溶胶液(如胶块重量不足100mg，可以用灭菌双蒸水补充至100mg)，置于50。C水浴10min，每隔2min颠倒混匀一次，以使胶块完全溶化。3)将溶化后的混合液移入吸附柱，12000rpm离心30S。4)倒掉收集管中液体，再将吸附柱放入收集管。在吸附柱中加入500“L洗涤液，12000rpm离心30S。5)在吸附柱中再加入500此洗涤液，12000rpm离心30s，倒掉收集管中液体，再将吸附柱放入收集管。6)12000rpm离心lmin。7)最后将吸附柱放入一个干净的1．5IxLeppendorf管中，在吸附膜中央加入30“L洗脱液，置于37"C水浴2vain，12000rpm离心1min，将收集有洗脱物的1．5mLeppendorf管置于一20。C保存备用。(5)回收PCR产物的酶切处理将回收的PCR产物进行XholI，BamhI双酶切，酶切体系(50．0lxL)如下：XholI1．0“LBamHI1．0lxLPCR产物20．0lxL10xBuffer5．0“LddH2023．0“L37。C水浴作用l～2h，酶切产物利用PCR回收试剂盒回收目的片段，置于．20。C保存备用。3．2．2．2pEGFP．N1载体的准备24 第三章PRRSVNSPl2shRNA抑制PRRSV在Marel45细胞中复制的研究(1)载体的质粒提取挑取含有pEGFP—N1质粒的DH5a单菌落于5“的LB(加5ⅢKan)培养基中放在摇床中过夜培养，次日取出后参照质粒小量提取试剂盒说明书提取质粒，具体步骤如下：1)．收集菌液1．5ml，12000rpm离心1min，弃上清。2)．加入250mSolutionI，重悬菌体。3)．加入250ttlSolutionlI，上下轻柔颠倒混匀，室温静置2"--3min。4)．加入350mSolutionIII，上下颠倒混匀，12000rpm离心10min。5)．将上清小心移入吸附柱，6000rpm离心1min，弃液体。6)．重复步骤e。7)．用700lxl洗涤液洗柱，12000rpm离心60S，弃液体。8)．重复步骤7)。9)．空离，12000rpm2min，在超净台中风干。10)用预热的ElutionBuffer50m进行洗脱，12000rpm离心1min，收集洗脱液，取3山进行1．0％琼脂糖凝胶电泳检测。其余．20"C保存备用。(2)质粒载体的酶切将小量提取的pEGFP．N1质粒进行XholI、BamhI双酶切，酶切体系(50．0ttL)如下：XholI1．0“LBamhI1．0斗LpEGFP—N120．0lxL10xBuffer5．0“LddH2023．0“L37。C水浴作用2---3h，酶切产物利用DNA小量凝胶回收试剂盒回收载体，置于．20"C保存备用。3．2．2．3pEGFP．NSPl2基因片段与表达载体的连接将回收的pEGFP-NSPl2基因片段和载体pEGFP—N1进行连接反应，反应体系(10．0此)如下：pEGFP-N1载体1．0lxLNSPl2片段2．0lxL10xLigaseBuffer1．0plT4DNALigaseO．5斗LddH205．5“L25 靶向猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白NSPl2的shIⅢA抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marcl45细胞中复制4"C连接过夜。3．2．2．4转化到大肠杆菌DH5a(1)感受态细菌DH5a的制备：挑DH5a单茵落于LB培养液中培养过夜，吸100m菌液于5mlLB培养液中300rpm培养至成云雾状，吸lml菌液于无菌eppendorf管中冰浴15min，4"C，5600rpm离心5min后去尽上清，加入500m预冷的O．1MCaCl2轻轻混匀后冰浴30min，4。C，5000rpm离心5min后去尽上清，加100gl预冷的O．1MCaCl2轻轻混匀后置于4。C冰箱中备用。(2)转化将109l连接产物加入1001xl冰浴的感受态DH5a茵液中，继续冰浴30min，于42"C水浴中热休克90s，再迅速置于冰浴中5min，然后全部转入300glLB培养液中，于恒温摇床中37。C，200rpm摇1—4h，吸取300lxl菌液均匀涂布于LB固体培养基(含卡那霉素)，37。C培养过夜。3．2．2．5重组质粒的鉴定(1)质粒提取及酶切鉴定从每个平板挑随机挑取生长良好的单菌落各4个于5mlLB培养基(含Kan)的试管中，37"C过夜培养，次日提取质粒。将提取的质粒用XholI、BamhI双酶切进行鉴定：XholIO．5pLBamhl0．5gL重组质粒10．0lxL10xBuffer2．0gLddH207．01．tL37℃水浴作用2--一3h，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。(2)重组质粒测序鉴定将酶切鉴定为阳性的重组质粒pEGFP-N1．NSPl2送上海华大公司进行测序鉴定。3．2．3细胞培养3．2．3．1Marc．145细胞的准备Marc．145细胞的活性状态关系着整个细胞转染过程和病毒感染的成败，为了保证Marc-145细胞具有良好的状态，在前2周复苏Marc．145细胞。从液氮罐中取出冻存的Marc一145细胞，迅速置于37。C水浴中解冻，待完全融化后，加到细胞培养瓶中， 第三章PRRSVNSPl2shRNA抑制PRRSV在Marcl45细胞中复制的研究补加10mL含10％胎牛血清的DMEM培养基，置37。C、5％C02培养箱中培养，第二天换液，连续培养两周，Marc．145细胞的活性即可恢复稳定。3．2．3．2Marc-145细胞的传代1．弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤三次。2．用吸管加入适当体积的胰酶，消化1～5分钟(37"C，5％C02)。在倒置显微镜下观察，发现细胞之间有空隙，细胞变圆为止。3．加入适当体积的的含10％胎牛血清的DMEM营养液，多次吹打细胞，使细胞完全分散开，成为细胞悬液。4．细胞计数后，按104个细胞／孔加入96孔板中(或105个细胞I孑LDII入到24孔板或106个细胞／孔加入到6孔板)。5．将合适体积DMEM培养液加入96孔板(24孔板或6孔板)，混匀细胞。6．将96孔板(24孔板或6孔板)转入c02培养箱中培养。3．2．4Marc．145细胞的共转染1将生长状态良好的Marc一145细胞消化计数后稀释至lxl06／ml，加入6孔板，2mL／孔。放入37℃，5％C02培养箱中培养24h。2．待细胞长至60．80％左右时，用PBS洗细胞3次，进行转染。3．选择合适的混合比例(1：3／DNA质量：脂质体体积)来转染细胞。4．在四个印管中加入相同的适当体积的的无血清培养基，一个加入2ug的pEGFP-N1-NSPl2，一个加入2ug的pEGFP-N1．NSPl2和2ug的shNC，一个加入2ug的pEGFP-N1-NSPl2和2ug的shRNAl，一个JJN,入2ug的pEGFP-N1-NSPl2和2ug的shRNA2，另外，分别在4个eppendo艚中加入同体积的TransFastTM转染试剂，室温静置15min。5．将混合液加入6孔板中，孵育ld,时。6．用PBS洗涤3遍。7．加入含10％胎牛血清的DMEM营养液，将细胞放回培养箱中，培养48dx时。3．2．5Marc．145细胞的转染1．将生长状态良好的Marc．145细胞消化计数后稀释至lxl06／ml，加入6孔板，2mL／孔。放入37℃，5％C02培养箱中培养24h。2．待细胞长至60．80％左右时，用PBS洗细胞3次，进行转染。3。选择合适的混合比例(1：3／DNA质量：脂质体体积)来转染细胞。4．在三个eppendo艚中加入相同的适当体积的的无血清培养基，一个加入4ug的 靶向猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白NSPl2的shRNA抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marcl45细胞中复制shNC，一个加入4ug的shRNAl，一个加入4ug的shRNA2，另外，分别在3个eppendorf管中加入同体积的TransFasffM转染试剂，室温静置15min．5．将混合液加入6孔板中，孵育ld,时。6．用PBS洗涤3遍。7．加入含10％胎牛血清的DMEM营养液，将细胞放回培养箱中，培养24／J,时。3．2．6Marc．145细胞感染PRRSV1．将转染24h后的Marc．145细胞消化计数后稀释至1x106／ml，加入6孔板，2ml／孔。放入37。C，5％C02培养箱中培养24h。2．弃掉6孔板中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤三次。3．加入MOI为1的PRRSV病毒液，放入37℃，5％C02培养箱中孵育l一2h。4．弃掉6孔板中的病毒液，用lml的PBS溶液洗涤三次。放入37"C，5％C02培养箱中培养2．3天。5．利用倒置显微镜观察细胞病变效应。3．2．7流式细胞术1．将转染24h后的Marc．145细胞消化计数后稀释至l×106／ml，加入6孔板。放入37。C，5％C02培养箱中培养24h。2．接毒48h后，弃掉上清，用PBS清洗3遍。3．胰酶消化，收集到一干净的印pendor躇qb2x105个细胞。2500rpm，5min，PBS洗一次。4．每个eppendo稽中加入lmL的3％马血清，4"C，避光孵育1h，可降低非特异性的结合。5．PBS洗三次。6．0．875mlPBS重悬，加入0．125ml预冷(4℃)的2％福尔马林(PBS稀释)，4℃，孵育1h。2500rmp，5rain。7．加入1m1的0．2％PBST，37℃，孵育30min。2500rpm，5min。8．加入200ul的l：200稀释的N蛋白的单克隆抗体，在室温染色30min。用PBS洗涤5遍。9．力口入200ul的1：100稀释的FITC结合AffiniPure标记的羊抗鼠IgG(H+L)，在室温下孵育30min。10．用PBS洗涤5遍，然后用500ul的PBS进行重悬。 第三章PRRSVNSPl2shRNA抑制PRRSV在Marel45细胞中复制的研究11．避光条件下，利用FACS分析数据，并用细胞计数软件进行流式细胞计数。3．2．8实时荧光定量．PCR实时荧光定量PCR用来检测PI汛SV的ORF5和ORF7的mRNA的表达。另外，13-aetin作为内参【51。1．将转染24h后的Marc．145细胞消化计数后稀释至lxl05／ml，JJIA．24孔板。放入37。C，5％C02培养箱中培养24h。2．感染MOI为l的PRRSV48h后，将细胞反复冻融三次。3．取500ul细胞悬液，加入800ulTrizol，轻轻混匀，静置10min。4．加入200ul氯仿，充分剧烈混合均匀，静置5min。5．4"C，12000rpm，15min。离心后，样品分层，上层水相中含RNA，下层有机相中含蛋白和DNA。6．取上清，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀。一20。C静置30min，在管底出现胶状沉淀。7．4。C，12000rpm，15min，弃掉上清。8．加入lml的75％乙醇(用DEPC水稀释)，轻轻混匀。9．4"C，8000rpm，5min，弃掉上清。10．将RNA样品晾干，加入20ulDEPC水。11．将提取的RNA进行反转录，反转录体系为：RNA2ul无Rnase水3ul2xMix5ul12．反转录PCR的程序为：37℃，15min；87℃，10s13．实时荧光定量PCR的反应体系为(25ul体系)：上游引物0．4ul下游引物0．4ul探针0．4ulRox0．4ulMix12．5uleDNA2．0ulJJNddH20至25ul14．实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃，15s；95℃，15S、60。C，1min40 靶向猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白NSPl2的shRNA抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marcl45细胞中复制个循环；72℃，30s。15．利用ABIPRISM7300序列监测系统完成实时荧光定量PCR，然后利用ABIPRISM7300SDS软件分析数据。表1：实时荧光定量PCR中应用到的引物于探针。墅!塑翌竺塑坚竺竺箜：型i：20RF5ForwardTGTGGTGTATCGTGCCGll℃ReverseCCCATAGGAAACAAT(玎GAGTCAACProbe(FAM)CGCCAAC(挖CAGCAACAACAACAGC(EclipsOORF7ForwardTTGTGTCTGTCGTCGATCCAGReverseAAACTCCACAGTGTAAClvr——℃CTCProbe(FAM)CGCl’GGAAC盯GTGCCCTGTCA(EclipsO15-ActinForwardTGACTGACTACCTCATGAAGATCCReverseTCTCCTTAATGTCACGCACGATTProbe(FAM)CGGCTACAGCTTCACCACCACGGC(Eclips曲●●■■■■■■■■■■■■■●■■■■■■■■■■●■●■●●■■■■■■■■■■■●■●■■■■■■■●■■■■■■■■■■■●●■■■■●■■■■■■■■■■●■■■■■■■■●■■●■■■■■■■■■■■■■■●●■●■■●■■■■■■■■■■■■●■■■■■■■■■■■■■■■■■■一t■■●■■■●■■■●■■●■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■●一3．2．9Westernblot分析1．将转染24h后的Marc．145细胞消化计数后稀释至lxl06／ml，加入6孔板。放入37。C，5％C02培养箱中培养24h。2．接毒48h后，弃掉上清，用PBS清洗3遍。3．用细胞刮将细胞刮下来，收集到一干净的eppendorf管中，2500rpm，5min。4．弃掉上清，加入150ul的裂解缓冲液，至于冰上，作用10min．5．4℃，12000rpm，10min，收集上清蛋白。6．上同体积的蛋白样于12％SDS．PAGE蛋白胶孔中，跑胶。7．剪1张PVDF膜和8张滤纸，与凝胶大小一致。置转移缓冲液中平衡10min。8．在夹板正极面上依次放入4张滤纸、PVDF膜、凝胶、4张滤纸，各层均排尽气泡，精准对齐。9．将靠上方的电极(阴极)放于夹层物上，连接电源，15V转印15min。然后断开电源，从上到下拆卸转移装置，逐一掀去各层。把凝胶转移至盛有染色液的托盘中，进行染色，以便检查蛋白质转移是否完全。lO．将PVDF膜放入盛有约10mL5％脱脂乳的PBST封闭液的平皿中，放在平缓摇动的摇床上于室温孵育2h。弃去封闭液，PBST漂洗3次，每次10分钟。11．将PVDF膜分别放入1：1000稀释的抗GFP单克隆抗体、抗N蛋白单克隆抗体、抗 第三章PRRSVNSPl2shRNA抑制PRRSV在Marcl45细胞中复制的研究GP5蛋白单克隆抗体和1：400稀释的抗p．actin抗体中，平放在平缓摇动的摇床平台上于室温孵育2h，弃去一抗封闭液，PBST漂洗3次，每次lO分钟。12．将洗涤好的PVDF膜转．A,l：5000稀释的辣根过氧化物酶结合的羊抗gIgG抗体中，平放在平缓摇动的摇床平台上于室温孵育1．5h。弃去二抗封闭液，PBST漂洗3次，每次10分钟。l3．在一个清洁eppcndorf管qa按照DAB显色试剂盒配制显色液2mL(现配现用)，然后逐滴加到洗好的PVDF膜上，一旦条带显色较清楚即用蒸溜水漂洗硝酸纤维素滤膜以终止反应，取出后拍照。3．3试验结果3．3．1重组载体的构建3．3．1．1目的基因PCR扩增应用随机引物，提取PRRSV感染的Marcl45细胞总RNA为模板进行反转录，将反转录得到的cDNA作为模板，用pEGFP-NSPl2f和pEGFP-NSPl2r作为引物再进行PCR扩增，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到大小约为462bp的DNA条带，与预期大小一致。(如图3．1A)A12图3．1．APRRSV的NSPl2的PCR产物Figure3-1-APRRSV-NSPl2PCRproductsI．PRRSV的NSPl2的全长基因PCR产物2．MarkerDL5000∞∞∞∞∞：囊Ⅺ始Ⅺ姗姗姗艄姗渤瑚瑚m 靶向猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白NSPl2的shRNA抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒在M棚rcl4S细胞中复制1．PRRSV-NSPl2PCRproducts2．MarkerDLS0003．3．1．2重组表达质粒的构建与鉴定将琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒回收得到的PCR产物用XhoI和BamHI进行双酶切后，与同样酶切处理后的pEGFP-N1载体连接后转入E．coliDH5a宿主菌，选取单克隆，抽取质粒，质粒用XhoI和BamHI进行双酶切后进行1％琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图3．1B所示，泳道2是重组质粒pEGFP-N1-NSPl2酶切出的两条条带，其中462bp的条带与NSPl2基因大小相符。将该质粒送华大基因公司测序确定插入片段是否正确。测序结果和序列比对结果表明PRRSV的nspl2基因正确插入pEGFP-N1载体。B125∞O3湖2瀚15∞lO∞7505∞250l∞图3-1-BpEGFP-N1-NSPl2酶切鉴定Figure3-1-BpEGFP-N1-NSPl2锄zylnedigestion1．MarkerDLS0002．PEGFP-n!．NSPl2的Xhol和BamM双酶切产物1．MarkerDL50002．PEGFP-NI-NSPl2XhoIandBamhIb-jrlzymedigestionproducts3．3．2shRNA抑制PRRSVnspl2蛋白的表达将shRNAl、shRNA2、shNC质粒分别与pEGFP-N1-NSPl2质粒共转染Marc．145细胞，转染48h后，收集细胞，用裂解液裂解后westernblot分析NSPl2蛋白的表达。Westernblot结果如图3．2所示：泳道1为shRNAl和pEGFP-N1-NSPl2共同转染组，泳道2为shNC和pEGFP-N1-NSPl2共同转染组，泳道3为pEGFP-N1-NSPl2单独转染组，泳道4为shRNA2和pEGFP．N1-NSPl2共同转染组。从图中可以看出，shNC和pEGFP-N1．NSPl2共同转染组与pEGFP．N1-NSPl2单独转染组NSPl2蛋白的表达量相32 第三章PRRSVNSPl2shRNA抑制PRRSV在Marcl45细胞中复制的研究似，shRNAl和pEGFP-N1-NSPl2共同转染组与shRNA2和pEGFP-N1-NSPl2共同转染组nspl2蛋白的表达量都明显低于pEGFP-N1-NSPl2单独转染组；而p-actin蛋白表达量相似。此结果表明，shRNAl和shRNA2在Marcl45细胞中可以明显抑制PRRSVNSPl2蛋白的表达。NSPl2234图3-2shRNA抑制PRRSVNSPl2蛋白的表达Figure3-2InhibitionofshRNAontheexpressionofNSPl2proteins1．共转染shRNAI和pEGFP-Nl-NsPl2的Marcl45细胞2．共转染Shl、lc和pEGFP-N1-NSPl2的Marel45细胞3．转染pEGFP．N1．NSPl2的Marcl45细胞4．共转染shRNA2和pEGFP．NI-NSPl2的Marcl45细胞1．Marcl45cellscotmnsfectedwithshRNAIandpEGFP-NI-NSPl22．Marel45cellscommsfcctcdwithshNCandpEGFP-NI-NSPl23．Marcl45cellstransfectedwithpEGFP-NI-NSPl24．Marel45cellscotransfectedwithshRNA2andpEGFP-NI-NSP23．3．3shRNA抑制PRRSV在Marc．145细胞上的细胞病变将shRNAl、shRNA2、shNC质粒分别转染Marc-145细胞，转染后24h感染PRRSV，病毒感染后48h，将感染细胞置于倒置显微镜下观察，取没有感染的细胞作为对照(图3．3)。从图中可以看出，感染后48h，转染shNC质粒后感染PRRSV的Marc-145细胞出现严重病变，大部分细胞开始变圆，有些甚至出现聚集、崩解等现象；转染shRNAl或shRNA2的Mare-145细胞病变较轻微，只出现个别细胞变圆的现象。此现象说明shRNAl和shRNA2可以抑带I]PRRSV在Marc-145细胞上产生的病变反应。 ACBD图3-3shRNA对PRRSV感染Marc．145细胞的细胞病变效应的影响Figue3—3TheinfluenceofshRNAfortheCPEofPRRSVinfectMare．145八未感染PRRSV的Marcl45细胞B．转染ShNC的Marcl45细胞C．转染ShRNAl的Marcl45细胞D．转染shRNA2的Marcl45细胞八Marel45cellswithoutPRRSVB．Marcl45cellstransfeetedwithshNCC．Marcl45cellstransfectedwithshRNAID．Marcl45cellstransfectedwithshRNA23．3．4shRNA减少PRRSV在Marc．145细胞上的感染率将shRNAl、shRNA2、shNC质粒分别转染Marc-145细胞，转染后24h感染PRRSV34 第三章PRRSVNSPl2shRNA抑制PRRSV在Marel45细胞中复制的研究(取既没有转染质粒也没有感染病毒的细胞作为空白对照)，病毒感染后48h，收集细胞进行流式细胞术分析。结果如图所示：shNC、shRNAl、shRNA2质粒转染组的PRRSV感染率分别为56．4％、13．8％、11．8％。此结果表明靶向NsPl2的shRNA可以显著降低PRRSV的感染率。ABC芒：0—■e0萋。iIO．3％．I-。llir啊瓤rII¨■一～TlIHllr⋯l—FHlI睚二～rFlTc-}{13．8％l扩舻笔：0O_C：o0DF疆BHF盯．c。H图3_4s址斟A对PⅪ州在Marcl45细胞上感染率的抑制作用Figue3-4InhibitionofPRRSVyieldOilMarel45cellsbyshRNA八空白对照B．转染shNC的Marel45细胞C．转染shRNAI的Marel45细胞D．转染shRNA2的Marel45细胞A．blankcontrolB．Marel45cellstnmsfeetedwithshNCC．Marel45cellstransfeetedwithshRNAlD．Marel45cellstransfeetedwithshRNA23．3．5shRNA可抑制PRRSV亚基因组基因转录将shRNAl、shRNA2、shNC质粒分别转染Marc-145细胞，转染后24h感染PRRSV，病毒感染后48h，提取病毒RNA，进行荧光定量PCR，测定各实验组PRRSV 靶向猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白NSPl2的shRNA抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marel45细胞中复制亚基因组基因GP5和N的mRNA水平。结果如图所示：shNC质粒转染组与只感染PRRSV的对照组相比，GP5和N的mRNA水平相当；与shRNAl、shRNA2质粒转染组相比GP5和N的mRNA水平有极显著差异。ABVNCshRNAlshRNA2VNCshRNAlshRNA2图3．5shRNAs对PRRSV亚基因组基因转录的抑制作用Figue3-5InhibitionofPRRSVsubgenometranscriptionsbyshRNAA．shRNAs对PRRSVORF7基因转录的抑制作用B．shRNAs对PRRSVORF5基因转录的抑制作用A．InhibitionofPRRSVORF7transcriptionsbyshRNAB．InhibitionofPRRSVORF5transcriptionsbyshI矾A36加∞踯∞加ol^o小v—a^鱼《Z笛昌Q^善_叠Q篙加∞舳∞柏加O^摹=簟≯aI《Z鬣宣QAI-BIQ宙 第三章PRRSVNSPl2shRNA抑制PRRSV在Marcl45细胞中复制的研究3．3．6shRNA可抑制PRRSV亚基因组基因翻译将shRNAl、shRNA2、shNC质粒分别转染Marc-145细胞，转染后24h感染PRRSV，病毒感染后48h收集Marc-145细胞，裂解后分别用针对N蛋白的单抗和针对GP5的单抗进行westernblot分析。结果如图所示：无论是用N蛋白单抗还是GP5蛋白单抗检测shNC质粒转染组都出现一条清晰的条带，而shRNAl、shRNA2质粒转染组未出现任何条带；各实验组p-actin蛋白表达量相似。此结果表明shRNAl和shRNA2可以显著抑制PRRSV亚基因组基因的翻译。A123N蛋白13-actin围GP5蛋白p-actin23图3-6．shRNAs对PRRSV亚基因组蛋白翻译的抑制作用Figue3—6InhibitionofPRRSVsubgenometranslationbyshRNA八shRNAs对PRRSVN蛋白合成的抑制作用。1．转染shNC的Marcl45细胞2．转染shRNAI的Marel45细胞3．转染shRNA2的Marcl45细胞A．InhibitionoftranslationofPRRSVNprotein．1．Marcl45cellstransfectedwithshNC2．Marcl45cellstran娟ectedwithshRNAl3．Marcl45cellstransfeetedwithshRNA2B．shRNAs对PRRSVGP5蛋白合成的抑制作用。1．转染shRNAI的Marcl45细胞2．转染shRNA2的Marcl45细胞3．转染shNC的Marcl45细胞B．InhibitionoftranslationofPRRSVGP5protein．1．Marcl45cellstransfectedwithshRNAl；2．Marcl45cellstransfectedwithshRNA23．Marcl45cellstransfectedwithshNC37 靶向猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白NSPl2的shRNA抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marcl45细胞中复制3．4讨论猪繁殖与呼吸综合症(PRRS)，俗称蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)所引起的一种传染性疾病。该病在全世界养猪地区广泛流行，给养猪业带来了巨大的经济损失。当前的PRRS防控策略并不成功，与PRRS有关的损失还将继续发生。由于siRNA能够抑制病毒基因的复制、阻止病毒粒子的装配及影响病毒与宿主之间的相互作用，RNAi用于抗病毒研究的唯一前提是已知病毒基因组序列，且siRNA能快速、高效、特异地降解同源mRNA而不产生任何副作用，从而成为抗病毒感染的有效手段。本实验通过细胞病变观察和病毒表达量的变化，证实筛选得到的两个shRNA靶点均能显著抑制PRRSV的复制，另外，通过实时荧光定量PCR与Westernbolt蛋白印迹法，证实NSPl2可抑制PRRSV的复制。目前，关于NSPl2蛋白的RNAi研究国内外的报道很少，本研究证实了应用RNAi技术抑制PI淑SV复制的可行性，为特异性shRNA载体的构建奠定基础，进而为抗病转基因猪的生成提供分子生物学基础。 第三章PRRSVNSPl2shRNA抑制PRRSV在Marcl45细胞中复制的研究参考文献[1]Stadcjek，T．，Stankevicius，A．，Storgaard,T．，Oleksiewicz，M．B．，Belak，S．，Drew,T．W．，Pejsak，Z．，2002．IdentificationofradicallydifferentvariantsofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusinEasternEurope：towardsac,omn'lonancestorforEuropeanandAmericanvil"BSffs．J．Gen．Vk01．83，1861-1873．【2】MengXJ,Paulps,HalburPGcta1．PhylogeneticanalysisoftheputativeM(ORF6)andN(ORF7)genesofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)imlicationsfortheexistenceoftwogenotypesofPRRSVintheUSAandEurope[J]．ArchVtrol，1995(140)：745-755．【3】3MengelingWL,hgerKM，VorwaldAC．ClinicalconsequencesofexposingpregnangiItstostrainsofporcinereproductiveandrespirator7syndromevirusisolatedfromfieldcasesofatypicalPRRS阴．AmJVetRes，1998，59：1540—1544．【4】FireA．RNA2triggeredgenesilencing[J】．ReviewTrendGenet，1999，15(9)：358-363。【5】GuangmingLi，PingJiang，YufengLi，XianweiWang，JuanHuang，vijunDu，BasitZeshan，2009．Effectivesuppressionofreplicationofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusbyadenovirus·mediatedsmallinterferingRNAstargetingORFlb，5and7genes．JournalofVirologicalMethods157．4m46．39 全文总结1．设计两对siRNA极其阴性对照，将其连接到pGPU6／GFP／Neo载体上，得到㈣A1、shRNA2和shNC。2．利用随机引物，提取PRRSV感染的Marcl45细胞总RNA为模板进行反转录，将反转录得到的cDNA作为模板，用PEGFP-NSPl2f和PEGFP．NSPl2r作为引物进行PCR扩增，得到NSPl2的全长基因，将其连接到pEGFP-N1载体上，得到重组质粒。3．将st删A1、shRNA2、shNC质粒分别转染Marc-145细胞，转染后24h感染PRRSV，病毒感染后48h，利用westernblot，流式细胞术和实时荧光定量PCR等进行分析，发现shRNA不仅抑制PRRSV在Marc．145细胞上的细胞病变以及感染率，还可抑制PRRSV亚基因组基因转录以及翻译。 附录附录1．SDS—PAGE中主要试剂的配制(1)5xSDS-PAGE电泳缓冲液：Tris15．19甘氨酸949SDS59加dH20至1000ml(2)2xSDS-PAGE上样缓冲液：Tris·HCl(pH6．8)100mmol／L25mLSDS4％(w／v)49溴酚蓝0．001％(w／v)lmg甘油20％20mL2-ME2mL加入dH20至100mL并混匀，等量分装成lmL于．20。C贮存备用。(3)30％丙烯酰胺单体贮液：丙烯酰胺309双甲叉丙烯酰胺0．89加dH20至100mL，完全溶解后过滤，棕色瓶4"C保存备用。(4)1．0mol／LTris·HCI(pH6．8)："Iris12．IgdH2040mLHCl调pH为6．8，加dH20至100mL，4"C保存备用。(5)1．5mol／LTris·HCI(pH8．8)：Tris18．159dH2040mLHCl调pH为8．8，加dH20至100mL，4。C保存备用。(6)10％SDS-SDS109加dH20至100mL，50～60。C温水温浴溶解，而后存于室温备用。(7)10％过硫酸铵：过硫酸铵O．59加dH20至5mL，冻存于．20。C备用。(8)"Iris．甘氨酸SDS．PAGE凝胶的配方分离胶(15％) 靶向猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白NSPl2的shRNA抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marel45细胞中复制ddH202．4mL30％丙烯酰胺溶液5．0mL1．5MTris(pH8．8)2．5mLlO％SDS0．1mL10％过硫酸铵O．05mLTEMEDO．020mL分离胶(12％)ddH203．4mL30％丙烯酰胺溶液4．0mL1．5MTris(pH6．8)2．5mLlO％SDS0．1mL10％过硫酸铵0．05mLTEMED0．005mL浓缩胶ddH202．85mL30％丙烯酰胺溶液O．85mL1．5MTris(pH6．8)1．25mL1O％SDS0．05mL10％过硫酸铵0．025mLTEMED0．01mL2．细胞培养中所用溶液的配制(1)DMEM基础培养液DMEM培养基粉一袋(109)NaHC031．89ddH201OOOml过滤分装4℃保存(2)8％DMEM培养液DMEM基础培养液91ml胎牛血清8ml双抗lml(3)冻存液DMEM培养液6ml胎牛血清3mlDMSo1m142 附录(4)双抗青霉素100万单位链霉素100万单位双蒸水100mL混匀分装，．20℃贮存。3．Westemblot分析中主要溶液的配制：(1)转移缓冲液：甘氨酸2．99Tris碱5．89SDS0．379甲醇200mldH20至总量为1000ml。(2)TBS缓冲液：NaCl500mmol／LTris-HCI(pH7．5)20mmol／L(3)TBST缓冲液：TBS缓冲液加0．59／LTween．20(4)封闭液：5％脱脂乳的TBS缓冲液4．其他常用试剂的配制(1)LB培养基的配制(1L)：胰化蛋白胨10．Og酵母提取物5．OgNaCl10．09加dH20至1L摇匀后用121℃高压蒸汽灭菌20min后室温放置备用(2)PBS缓冲液KH2P040．279NaEHP04·12H203．589KCIO．29NaCl89]J1]dH20至1000ml43 致谢致谢衷心感谢我的导师茅翔教授，正是在他的悉心指导与关怀下，我有幸打开了动物分子病毒学研究的大门。本文就是在导师的谆谆教导下完成的。导师宽厚仁爱的性格，严谨的治学态度，博大精深的学识，活跃的科学思维，精诚敬业的作风一直深深的感染着我，激励着我，使我终身受益，另外还得到了传染病教研组姜平教授等老师的教诲，让我受益匪浅，在此，向各位老师致以衷心的感谢!感谢本组黄丽、李晨、孙明霞，Hassen等全体博士以及于亚玲，胡小春，李鹏鹏，王蕊，尼博，王月，葛玲玲，郇长超等全体硕士生在课题进行过程中给予的帮助，大家团结协作，一致向上的精神，使我终身难忘!同时感谢已经毕业的师兄师姐的帮助和关心，在这几年共同的学习与生活中我们结下了深厚的友谊，谢谢你们!感谢我至亲至爱的父母、亲人，是你们养育了我；是你们让我时刻感受到生活的幸福与快乐；是你们浓浓的亲情伴我走过一程又一程，你们永远是我前进的动力!最后衷心地感谢所有关心、帮助和支持过我的朋友们!花婷