抗肺癌单链抗体融合绿色荧光蛋白的构建、表达及活性研究

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1、浙江大学硕士学位论文抗肺癌单链抗体融合绿色荧光蛋白的构建、表达及活性研究姓名：于红申请学位级别：硕士专业：生物物理学指导教师：龚兴国20040601浙江大学硕{一学位论文抗肺癌单链抗体融合绿色荧光蛋白的构建、表达及活性研究摘要抗肺癌单链抗体(LC一1single．chainFv，LC—lScFv)是由抗肺癌杂交瘤细胞株(LC一1)分泌的单克隆抗体经过基因改造得到的，是具有与抗原结合能力的最小抗体片段。由于分子量小，所以与传统的单克隆相比具有组织穿透能力强、免疫原性低的优点。本文首次将完整的抗肺癌单链抗体与绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)结合

2、进行融合表达。理论上如果蛋白表达，应同时具有抗体活性及光激发绿色荧光双重功能。这为肿瘤的检测、药物筛选、细胞因子受体的分布以及功能等方面的研究开辟了广阔的应用前景。本实验从高分泌量和活力较高的抗肺癌杂交瘤单克隆细胞株抽提总RNA，反转录成cDNA。设计引物从cDNA中PCR克隆出单链抗体的重链和轻链基因，克隆至-IJT载体并测序。经重叠延1d0PCR法将重链和轻链基因构建为单链抗体形式。修饰后的单链抗体与pET一22b(+)质粒连接，构建成pET22·scfv，转化大肠杆菌BL21。在温度30。C，诱导5h，IPTG的浓度为0．5mmol／L时诱导菌体，单链抗体的表达量占全菌蛋

3、白的40％。表达的蛋白尚未分泌到胞间质，而是几乎全部以包涵体形式存在。将包涵体抽提后通过蛋白复性技术使之复性，用Ni-NTA树脂纯化出目标蛋白，SDS—PAGE电泳分析其纯度达到90％以上。竞争ELISA实验表明产物具有与天然抗体相近的活力。SeFv通过基因工程方法的大量制备，克服了单克隆抗体腹水制备的有限性，降低了生产成本低。同时设计引物，以带有突变型绿色荧光蛋白基因的质粒pEGFP为模板PCR，得多Jgfp，酶切后连接于pET--22b(+)质粒，构建成pET22·gfp，再将ScFv基因插入到pET22一gfp中gfp的5’端，构成grp—sefv。转化大肠杆菌BL21，

4、诱导表达后，SDS—PAGE观察到一条与预期蛋白分子量相近的表达条带。将菌体置于荧光显微镜下，485nm激发显示强烈的绿色荧光，进一步ELISA实验也证实该融合蛋白具有了抗体活性。关键词：单链抗体：绿色荧光蛋白：原核表达浙江大学钡+学位论文AbstraetAmonoclonalantibodyissecretedfromLC一1，whichsinglechainFvfragment(SeFv)namedLC-1ScFvwasconstructedbasedonrecombinantphagedisplayedtechniques．ScFvisthesmallestsegment

5、beingabletointeractwithantigenBecauseofsmallmolecularweightandlackofFc，whichcomparesconventionalantigenwithstrongforceofpenetrationandimmtmogenecity．UptotimetheexpressionoffusionproteinonGFPandScFvhasnotreported．Onthetheory,thisfusionproteinshouldbewitllgreenfluorescentandantibodyactivity．th

6、eexpressionofproteinfusionshasbeenusedfortumormonitoring，high—throughputscreeningdrugsorresearchingthefunctionoftheacceptorofcertaincellfactor．ThetotalRNA'wassolatedfromhighsecretoryvolumeandactivityantibodyLC-1monocolonycells，whichwastransferredeDNA．Thevariableregionsofheavychainandlightcha

7、inwereclonedthroughPCRaccordingtoScFvgene，respectively．ScFv’genewasformedaftertheSOEligationofVHandmodifiedVL．TheScFvgeneamplifiedbyPCRisclonedintopET-22b(+)plasmidbetweentheNcoI／SalI．andintroducedintoE．coliBL21theconstructedplasmidgaveahighlevelof