人源抗her2单链抗体-轻链恒定区-鱼精蛋白截短体融合蛋白的基因构建、表达及活性鉴定

人源抗her2单链抗体-轻链恒定区-鱼精蛋白截短体融合蛋白的基因构建、表达及活性鉴定

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时间:2018-05-07

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1、人源抗HER2单链抗体/轻链恒定区/鱼精蛋白截短体融合蛋白的基因构建、表达及活性鉴定【关键词】HER2;,单链抗体;,鱼精蛋白  ConstructionandexpressionofhumanantiHER2ScFv/Ck/tPfusionproteininE.coliandidentificationofitsactivity  【Abstract】AIM:ToconstructafusionproteingeneofhumanantiHER2ScFv/lightchainconstantregion/tr

2、uncatedprotamine(ScFv/Ck/tP)andanalyzethebindingactivityoftheexpressedprotein.METHODS:TersplifytheScFvandtheCkgene.Aftertheyinusofit,thenthefusionproteingeneScFv/Ck/tPedbycellularELISA,andtheDNAbindingabilityedbygelshiftassay.RESULTS:Restrictionendonucleased

3、igestionandDNAsequencingprovedthatScFv/Ck/tPedthatithadspecificantigenbindingactivity;gelshiftassayassuredthatithadDNAbindingability.CONCLUSION:TheScFv/Ck/tPfusionproteinexpressedinE.colicouldspeciallybindine  【摘要】目的:构建人抗HER2单链抗体(ScFv)/人轻链恒定区(Ck)/鱼精蛋白截短体(tP)

4、融合蛋白基因,在大肠杆菌中表达、纯化并分析该融合蛋白的活性.方法:设计引物扩增人抗HER2单链抗体e23sFv基因和轻链恒定区编码序列(Ck),连接成ScFv/Ck片段,人工合成tP序列,连接于ScFv/Ck末端,构建成ScFv/Ck/tP融合基因,将其克隆入原核表达载体pET32a后,在大肠杆菌BL21(DE3)LysS中诱导表达,表达产物经SDSPAGE和Ve23sFvPEIIGrBa[6],pb3HFab15,pUC19,pET32a;大肠杆菌DH5α,BL21(DE3)LysS和HER2阳性的人胃癌细胞

5、系SGC7901(第四军医大学生物化学与分子生物学教研室);限制性内切酶、连接酶(日本TaKaRa公司);IPTG(美国Promega公司);质粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒(合肥优晶生物技术有限公司);HiTrapNiNTA螯合层析介质(美国Invitrogen公司);6HismAb(德国Qiagen公司);HRP-羊抗鼠IgG(武汉博士德生物有限公司);ECL化学发光试剂盒,BCA蛋白定量试剂盒(美国Pierce公司);RPMI1640培养基(美国Gibco公司);标准胎牛血清(中国医学科学院生物工程研究所

6、).  1.2方法  1.2.1引物和tP编码序列寡核苷酸的设计与合成  设计扩增ScFv基因的引物S5:5′tttgaattcgacgtccagctgacccagtct3′,S3:5′tttctcgagggagacggtgaccgtggtccc3′,在两端引物中分别引入EcoRI和XhoI酶切位点(下划线部分).扩增Ck序列的引物Ck5:5′tttctcgagactgtggctgcaccatctgt3′,Ck3:5′ttttctagactaacactctcccctgttga3′,在两端引物中分别引入XhoI和

7、XbaI酶切位点(下划线部分).tP编码序列寡核苷酸合成tP1:5′ctagacgcagccagagccggagcagatattaccgccagagacaaagaagtcgcagacgaaggaggcggagcgc3′,tP2:5′tgcgtcggtctcggcctcgtctataatggcggtctctgtttcttcagcgtctgcttcctccgcctcgcgccgg3′,寡核苷酸链的两端带有XbaI和NotI酶切位点的粘端序列(下划线部分),能够直接与经XbaI和NotI酶切的载体连接.引物和寡核苷酸

8、由北京奥科生物技术有限公司合成.  1.2.2ScFv/Ck/tP融合基因重组表达载体的构建及鉴定  分别以pCMVe23sFvPEIIGrBa和pb3HFab15质粒为模板,S5,S3和Ck5,Ck3为引物PCR扩增ScFv和Ck片段,产物经相应的酶切后,一起克隆入pUC19质粒,并进行序列测定,测序正确后的质粒命名为pUC19ScFv/Ck.将合成的两条tP编码序列寡核苷酸链缓慢退

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