实验28 脂肪酸的β一氧化

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1、实验28脂肪酸的β一氧化一、目的1．了解脂肪酸的β一氧化作用2通过测定和计算反应液内丁酸氧化生成丙酮的量，掌握测定β一氧化作用的方法及其原理。二、原理在肝脏内脂肪酸经β一氧化的作用生成乙酰辅酶A，两分子的乙酰辅酶A可缩合生成乙酰乙酸。乙酰乙酸可脱羧生成丙酮，也可还原生成β一羟丁酸。乙酰乙酸，β一羟丁酸和丙酮总称为酮体。肝脏不能利用酮体，必须经血液运至肝外组织特别是肌肉和肾脏，再转变为乙酰辅酶A而被氧化利用。酮体作为有机体代谢的中间产物，在正常的情况下，其产量甚微，患糖尿病或食用高脂肪膳食时，血中酮

2、体含量增高，尿中也能出现酮体。本实验用新鲜肝糜与丁酸保温，生成的丙酮可用碘仿反应滴定。在碱性条件下，丙酮与碘生成碘仿。反应式如下：CH3

3、CH2

4、CH2

5、COOHCH3

6、CH‖CH

7、COOHCH3

8、CHOH

9、CH2

10、COOHCH3CH3

11、C=O→

12、CH2

13、COOH脱羧CO2+H2OOCH3—C2HaOH+I2===NaOI+NaI+H2OCH3COCH3+3NaOI===CHI3+CH3COONa+2NaOH碘仿剩余的碘可用标准Na2S2O3滴定NaOI+NaI+2HCl===I2+2NaCl+H

14、2OI2+2Na2S2O3===Na2S4O6+2NaI根据滴定样品与滴定对照所消耗的硫代硫酸钠溶液体积之差，可以计算由丁酸氧化生成丙酮的量。三、材料、试剂和仪器（一）材料家兔（或鸡或大鼠）的新鲜肝脏一、试剂1．0.1%淀粉溶液（溶于饱和氯化钠溶液中）2．0.9%氯化钠溶液3．0.5M丁酸溶液：取4.5毫升正丁酸，用1N氢氧化钠溶液中和至pH=7.6,并稀释至100毫升。4．20%三氯乙酸溶液5．10%氢氧化钠溶液6．10%盐酸7．0.1碘溶液，称取 12.7克碘和约25克碘化钾溶于水中，稀释到1

15、000毫升，混匀，用标准0.1M硫代硫酸钠溶液标定。8.标准0.02M硫代硫酸钠溶液：临用时将已标定的1N硫代硫酸钠溶液衡释成0.02M。9．1/15M，PH7.6磷酸盐缓冲液：1/15M磷酸氢二钠86.8毫升与1/15M磷酸二氢钠13.2毫升混合。（二）器具1、匀浆器或研钵2、剪刀、镊子、漏斗3、50毫升锥形瓶4、碘量瓶5、试管和试管架6、移液管（5毫升，10毫升）7、微量滴定科8、恒温水浴四、操作步骤（一）肝匀浆的制备将鸡颈部放血处死，取出肝脏。用0.9%NaCl溶液洗去表面的污血后，用滤纸吸

16、去表面溶液，称取肝组织5g，置于研钵中加入少许0.9%NaCl溶液，将肝组织研磨成肝匀浆。再加入0.9%NaCl溶液，使肝匀浆总体积达10ml。（二）酮体的生成1．取锥形瓶两只，按下表编号后，分别加入各试剂。锥形瓶编号试剂（ml）AB新鲜肝匀浆—2.0预先煮沸肝匀浆2.0—PH7.6磷酸缓冲液3.03.0正丁酸溶液2.02.02.将加入试剂的两只锥形瓶于43oC恒温水浴锅中保温40min后取出。3．于上述两锥形瓶中分别加入20%三氯醋酸3mL，摇匀后，室温放置10min。4．将锥形瓶中的混合物分别

17、过滤，收集滤液于事先如上编号的试管中。（三）酮体的测定1．取碘量瓶两只，按下表编号后加入有关试剂。碘量瓶编号试剂（ml）AB无蛋白溶液5.05.00.1mol/L碘液3.03.010%NaOH3.03.0加完试剂后摇匀，放置10min。2．于各碘量瓶中滴加10%HCl，溶液3ml，使各瓶溶液中和至中性或微酸性。3．用0.02mol/LNa2S2O3滴定至碘量瓶中溶液呈浅黄色时，往瓶中滴加数滴0.1%淀粉溶液2-3滴，使瓶中溶液呈蓝色。4．用0.02mol/LNa2S2O3继续滴定至碘量瓶中溶液的蓝

18、色消褪为止。5．记下滴定时所用去的Na2S2O3溶液的毫升数，按下式计算样品中丙酮的生成量。（四）计算实验中所用肝匀浆中生成的丙酮量(mmol)=(A—B)×C×1/6肝脏生成丙硐的量（mmol·g-1）=(A-B)×C×式中：A为滴定A样品所消耗的0.02mol/LNa2S2O3溶液的毫升数；B为滴定B样品所消耗的0.02mol/LNa2S2O3溶液的毫升数；C为Na2S2O3的浓度（mol/L）。五、注意事项1、在低温下制备新鲜的肝糜，以保证酶的活性。2、加HCl溶液后即有I2析出，I2会升华

19、，所以要尽快进行滴定，滴定的速度是前快后慢，当溶液变浅黄色后，加入指示剂就要慢慢一滴一滴的滴。3、滴定时淀粉指示剂不能太早加入，只有当被滴定液变浅黄色时加入最好，否则将影响终点的观察和滴点结果。六、实验报告保留实验的有效数据，计算结果并分析讨论。七、思考题1.为什幺说做好本实验的关键是制备新鲜的肝糜？2.什幺叫酮体？为什么正常代谢时产生的酮体量很少？在什幺情况下血中酮体含量增高，而尿中也能出现酮体？3.为什么测定碘仿反应中剩余的碘可以计算出样品中丙酮的含量？4.实验中三氯乙酸起什幺