sybrgreenⅰ荧光定量rt-pcr检测j亚群禽白血病病毒方法的建立及应用

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1、摘要J亚群禽白血病((AvianLeukosisVirusSubgroupJ,ALV-J)是由J亚群禽白血病病毒引起的鸡骨髓样细胞瘤以及其它肿瘤性性疾病。1999年,我国首次由杜岩等在肉鸡的商品代中分离了ALV-J。J亚群禽白血病在我国呈现了不断发展的态势,宿主范围已从肉用型鸡向蛋鸡和地方鸡种蔓延,病鸡的生产性能降低,死亡率明显升高,给我国养禽业造成严重的经济损失。因此,建立快速、特异和敏感的ALV-J检测方法具有重要的实际意义。为建立SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测ALV-J的方法,本研究

2、以ALV-J原型毒株HPRS-103基因组中pol基因3’端和gp85基因之间的保守区域作为检测靶基因片段,构建其重组质粒作为阳性标准品,通过对模板浓度、引物浓度和退火温度的优化,建立了ALV-JSYBRGreenⅠ荧光定量PCR方法。结果显示该方法的最低3检测限度为2.36×10DNA分子/μL,较普通PCR提高100倍;可特异性扩增出545bp的ALV-J目的基因,而对其他禽源病毒无交叉反应;批内变异系数为0.17~2.43%,批间变异系数2.73~3.68%,均小于5%。表明所建立的方法较高

3、的灵敏性、很强的特异性、好的重复性和稳定性。根据所建立的荧光定量RT-PCR方法对临床样品和市售禽类疫苗进行检测。在所检测的12种不同禽类疫苗中均未检测到ALV-J,表明所检测的市售禽类弱毒苗中无ALV-J污染。在所检测的4个品种125只临床疑似病鸡中ALV-J阳性检出率为46.40%(58/125),其中岭南黄肉鸡、淮南麻黄鸡、地方鸡种和京红1号蛋鸡的阳性检出率分别为65.31%(32/49)、55.26%(21/38)、31.25%(5/16)和0%(0/22),表明不同品种的鸡对ALV-J的

4、易感性不同。选择10只27周龄阳性感染期岭南黄肉鸡,应用荧光定量RT-PCR方法检测不同脏器中ALV-J的分布及其mRNA表达水平。结果发现在心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏中均能检测到病毒基因,多重比较检验分析显示肾脏中ALV-J基因mRNA表达水平显著高于其他脏器,而肺脏、心脏、肝脏和脾脏之间无明显差异。这为进一步研究机体与病毒之间的相互作用,以及致病机理的探明奠定了基础。综上所述,本试验建立的荧光定量RT-PCR方法是一种特异、快速(6h左右)和较灵敏的检测方法,可用于快速诊断临床样品、净化鸡场

5、效果检测以及在不同脏器中病毒的表达水平的研究。关键词:J亚群禽白血病病毒,荧光定量PCR,定量检测,应用IAbstractSubgroupJAvianLeukosisreferredtochickenmyeloidcelltumorandothertumordiseasescausedbyAvianLeukosisVirussubgroupJ(ALV-J).ALV-Jwasisolatedfromcommercialbroilersforthefirsttimein1999inChina.ALV-

6、JhasspreadwidelyoverChinasince2000,anditshostrangeextendedfrommeat-typechickenstolayinghensandlocalchickenbreeds.Productionabilityofinfectedchickenswasdecreasedandthemoralitywasquicklyincreasing,whichhadbroughtgreatlossesfordomesticpoultryindustry.The

7、refore,theestablishmentofarapid,specificandsensitivemethodfordetectingALV-Jisofgreatsignificance.Inthisstudy,aSYBRGreenⅠ-basedfluorescentquantitativePCRassayfordetectingAvianLeukosisVirussubgroupJ(ALV-J)wasdevelopedandapplied.Theconservativeregionbetw

8、eenpolandgp85geneoftheHPRS-103strainofALV-JwasamplifiedbyconventionalPCRandwasclonedintopMD18-TvectorservedaspositivestandardtoestablishfluorescentquantitativePCRstandardcurve.AndthenthedetectingmethodofALV-JSYBRGreenIfluorescentquantitativePC

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