大鼠骨髓间充质干细胞体外培养技术研究

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1、中图分类号UDCR276．761O博士学位论文学校代码10533密级公开大鼠骨髓间充质干细胞体外培养技术研究Researchofinvitrocultivationtechnologyofratbonemarrowmesenchymalstemcells作者姓名：李葳学科专业：临床医学研究方向：耳鼻咽喉头颈外科学学院(系、所)：湘雅二医院指导教师：谢鼎华教授论文答辩日期生雌邸日答辩委员会主席中南大学二。一三年五月原创性声明JlllllllllllllllIlllllllllllllllllllfY2421695本人声明，所呈交的学

2、位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均己在论文中作了明确的说明。作者签名：越日期：坐年—驷鲨日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存

3、学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。储虢越新签未堕吼盟年厶当、．＼矿汐本课题由国家973计划资助课题编号：2012CB967904II摘要大鼠骨髓间充质干细胞体外培养技术研究第一章SD大鼠骨髓间充质干细胞体外培养及纯化目的：对SD大鼠BMSCs的体外分离、培养、扩增条件进行优化；建立本实验室快速稳定获得BMSCs的规范化实验技术流程。方法：分别采用密度梯度离心法和贴壁法分离BMSCs；以梯度密度1．0x106、5．0x105、1．0x105、5．0

4、x104、1．0x104个／ml接种骨髓细胞，记录细胞集落形成时间及首次传代时间。MTT法检测BMSCs在不同血清浓度5％、10％、15％、20％、25％、30％培养24、48、72小时后的OD值。结果：采用密度梯度离心法分离骨髓细胞；以接种密度为1．0x105个／ml接种骨髓细胞；以血清浓度25％的培养基培养骨髓细胞可以有效缩短原代培养的时间，纯化BMSCs，获得最佳增殖活性。结论：经反复验证建立了优化的稳定获得BMSCs的简单、快速的规范实验室技术流程，为后续试验细胞来源提供了技术基础。第二章SD大鼠骨髓间充质干细胞的鉴定目的

5、：对所获得扩增第三代细胞表面抗原表达进行鉴定，对所获得细胞多向分化能力进行观察，以明确所获得细胞为具有多向分化能力的BMSCs，能作为后续实验的种子细胞。方法：采用细胞免疫荧光法检测所扩增细胞表面抗原CD45、CD34、CD90、CD44的表达情况。以成骨及成脂诱导液分别诱导所获细胞向成骨及脂肪细胞分化，并以茜素红及油红O染色法鉴定诱导分化后特征性胞外基质钙结节及胞内脂滴的形成。结果：细胞免疫荧光显示：表面抗原CD44、CD90呈阳性表达；CD34、CD45呈阴性表达。成脂诱导液诱导BMSC分化14天后，油红O染色可见胞内脂滴出现

6、而成骨诱导25天后，茜素红染色可见胞外橙红钙结节。结论：优化培养体系所扩增的细胞为BMSCs，并且具有多向分化潜能。IV第三章SD大鼠骨髓间充质千细胞多胚层标志分子表达分析目的：分析未分化状态BMSCs特异性神经元、毛细胞及典型的内胚层、中胚层、原始胚层标志的转录水平表达情况，对未分化BMSCs是否具有向神经元及毛细胞分化倾向及跨胚层分化能力进行讨论，并为后续实验中将扩增细胞诱导分化为神经元及毛细胞后的鉴定工作提供参考依据。方法：RT-PCR检测Ceruloplasmin、SM22、Protamine2、Aldolase、MAP2

7、、Amyloidprecursorprotein、NMDAGlutamatebindingsubunit、Syntaxin，Neurofilament—M、Tau、NeuroD、Calretinin，Bm3．a、Myosin7A、Mathl、Espin基因在原代细胞中转录水平表达情况。结果：未分化原代细胞神经元特异性标志分子Amyloidprecursorprotein、NMDAGlutamatebindingsubunit；毛细胞特异性标志分子Myosin7A；内胚层特异性标志分子Ceruloplasmin、中胚层特异性标志分子

8、SM22基因在转录水平有表达。结论：1．在所获得的原代细胞有跨胚层分化的潜能。2．原代细胞群中有部分细胞具有更明显的向神经元及毛细胞转分化的倾向，可能在后续实验中该部分细胞更容易诱导向神经元及毛细胞分化。V3．实验结果能为后续实验诱导BMSCs向神