小鼠zfx基因rnai片段的筛选及性控效果的观察

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1、分类号：密级：学号：单位代码：10759石河子大学硕士学位论文小鼠zfx基因RNAi片段的筛选及性控效果的观察学位申请人马世俊指导教师贾斌教授申请学位门类级别农学硕士学科、专业名称基础兽医学研究方向动物生理生化所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2013年06月TheRNAifragmentsscreeningandobservationoftheeffectsofsexualcontrolfromMuszfxgeneADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInFulfillm

2、entoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofAgricultureByMaShijun(BasicVeterinaryMedicine)DissertationSupervisor:Prof.JiaBinJune,2013本研究由以下项目资助：“兵团博士资金专项”（项目编号：2012BB016)“Doctor’sSpecialFundofXinjiangProductionandConstructionCorps”(projectnumber:2012BB016)摘要睾丸是精子生成

3、和分泌雄性激素的场所，是雄性哺乳动物最重要的生殖器官。小鼠的zfx基因位于X染色体短壁上的性别决定区（TDF）内，是锌脂蛋白家族中的一员。zfx可以作为一个较强的转录激活因子，从而引导靶基因通过核膜定位在X精子的细胞核内，可能对某些基因在X精子发生过程中具有转录激活作用，与X精子的形成发生有关。本研究根据zfx基因的特点，设计了4个shRNA片段，进行小鼠体外和体内zfx基因的RNAi实验，采用qRT-PCR分析干扰后zfx基因的mRNA表达水平，并统计了经干扰后子代小鼠的性别比例。具体研究结果如下：1.根据GenBan

4、k(NCBI)提供的完整的小鼠zfx基因mRNA序列，按照RNAi设计原则，针对该基因的编码区设计并合成4对shRNA干扰片段。以Clontech公司（USA）RNAi-Ready-pSIREN-RetroQ-ZsGreen作为载体，构建了小鼠靶向zfx基因的shRNA表达载体pqz1-paz4。经过酶切鉴定和测序证实，实验所构建的4个表达载体中含有设计合成的干扰序列，且上下游表达调控元件完整，插入序列的位置正确。说明这4个shRNA表达载体构建成功，可以用于小鼠zfx基因的干扰试验。2.将构建好的4个zfx基因shRN

5、A重组质粒表达载体进行小鼠体外RNAi的研究。选取28日龄健康的雄性昆明小鼠，在无菌条件下取睾丸组织采用两步酶消化法分离小鼠生精细胞，并用生精细胞与支持细胞共培养的体系进行体外培养。以转染试剂（HET）分别包裹构建好的4个zfx基因shRNA重组质粒表达载体，用包裹好的质粒对培养24h后的生精细胞进行转染。转染48小时后利用荧光实时定量PCR检测zfx基因mRNA的表达水平。初步筛选出4个对zfx基因干扰效果较好的shRNA重组质粒表达载体（pqz1-pqz4）。3.将筛选的4个zfx基因shRNA重组表达载体进行小鼠体

6、内RNAi试验。选取80只健康雄性昆明小鼠随机分成五组（每组16只）。第一组到第四组为实验组，分别注射重组质粒表达载体pqz1-pqz4，第五组为对照组，注射同等体积的生理盐水。间隔7天注射一次，连续注射4次。最后一次注射14天后，每组8只雄鼠1:1与雌鼠交配，另外8只采集睾丸组织，利用荧光实时定量PCR检测zfx基因mRNA的表达水平。结果表明，pqz1-pqz4干扰后zfx基因的mRNA表达水平与对照组都差异极显著(P<0.01)。而子代小鼠性别统计显示，pqz3组的雄鼠率为75.79%，与对照组相比差异显著(P＜0

7、.05)；pqz4组的雄鼠率为79.66%，与对照组相比差异极显著(P＜0.01)。pqz1和pqz2两组子代小鼠的雄鼠率与对照组没有差异。本研究通过沉默zfx基因在生精过程中的表达，限制或损坏了X精子的发育或结构，从而使子代小鼠性别比例发生偏差。但实验组与对照组子代小鼠的数量及体重等无显著I差异，表明沉默zfx基因只对X精子有影响而对小鼠胚胎的早期发育不会产生影响。我们还将实验组子一代的雄鼠与雌鼠饲养至性成熟并进行合笼交配，结果显示子二代的数量、性别比例和体重与没有进行试验小鼠的后代均没有任何差异，说明干扰zfx基因所

8、产生的精子受精后不影响后代的繁殖性能。本实验通过干扰zfx基因在X精子细胞中的表达成功实现了对小鼠受精前的性别控制，同时也为其他动物的受精前性别控制方法的研究奠定了基础。关键词：RNAi；zfx；小鼠；生精细胞；性别控制IIAbstractTestisistheplaceofgeneratingspermandsec