应用gfp标记基因研究rnai载体的抑制效果论文

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1、应用GFP标记基因研究RNAi载体的抑制效果论文谢书阳王萍玉岳真李有杰张公【摘要】目的用绿色荧光蛋白（GFP）反映RNA干扰（RNAi）载体的转染率，以研究RNAi载体的抑制效果。方法将GFP基因和RNAi片段（特异性针对Bcl2基因）连接至pC1载体上，构建共表达载体GFP/RNAi及其对照载体，转染293细胞，用荧光显微镜、流式细胞仪检测细胞的GFP转染率，并用TRPCR分析RNAi抑制Bcl2mRNA表达的效果。结果在293细胞中，GFP的转染率可达85%以上，此时观察到RNAi有效的抑制了Bcl2mRNA的表达。结论在RNAi实验时.freelentspe

2、cifictoBcl2geneatedfromGFPbyusingfluorescencemicroscopyasRNAexpressiondetectionofGFPpositivecells,andtheBcl2mRNAexpressionarkergene(suchasGFP)maybeusedtoreflecttransfectionrateinRNAiexperiment,becausethetransfectionrateisimportantfortheinhibitiveeffectofRNAi.ThesuppressionofBcl2express

3、ioniscrucialtoinhibitproliferationoftumorcells.【Keyega公司，RNA提取试剂盒购自UGENE公司，NheI、SalI等酶、逆转录酶购自TaKaRa公司，293细胞株购自中科院上海细胞生物研究所，DMEM培养基、胎牛血清购自GIBCO公司，GFP表达载体（Invitrogen）。测序及引物合成由山东吉正科技有限公司完成。1.2方法1.2.1RNAi元件的设计和实验所用载体：依赖RNA聚合酶Ⅲ的H1启动子通过PCR从人基因组DNA中扩增获得［3］。Bcl2干扰片段的设计参考Tiscornia等报道［4］进行。正向片段序列

4、为：5’AGCTCCCGCGATAGTGATGAAGTACATCTTCAAGAGAGATGTACTTCATCACTATCTTTTTGGAAAA3’，反向片段序列为5’CTAGTTTTCCAAAAAGATAGTGATGAAGTACATCTCTCTTGAGATGTACTTCATCACTATCGGG3’；两片段缓慢退火后，将干扰片段克隆到T载体上，得到干扰载体Ti，并测序证明干扰片段序列正确。然后利用BamHI将RNA干扰序列及H1启动子克隆至pC1载体上，同时利用XbaI和SalI将GFP基因克隆至CMV启动子构建GFP/RNAi载体（图1），并构建对照载体GFP/C

5、ontrol。pCMV:人巨细胞病毒启动子；pH1:H1启动子；RNAi:特异性针对Bcl2序列的干扰片段；GFP:绿色荧光蛋白基因。图1载体及其结构1.2.2细胞培养及转染：293细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2条件下培养。然后，将1μgGFP/RNAi干扰载体，采用脂质体方法转染到293细胞中，细胞转染方法按厂家说明进行。如表1所示。表1293细胞转染剂量分组GFP/RNAi(μg)GFP/Control(μg)293blank（空白对照组）--293GFP/Control（对照组）-05293GFP/RNAi（干扰组）05-

6、1.2.3细胞GFP检测与分析1.2.3.1荧光显微镜观察：细胞转染72h后，胰酶消化后，PBS洗一次，用细胞计数板将各实验组细胞浓度调至一致，用荧光显微镜（Leica，DMRXA2）观测荧光。1.2.3.2FACS分析：收集细胞，用PBS洗涤，加鞘液后，用流式细胞仪（BectonDickinsonFACSCalibur）分析细胞GFP表达情况。1.2.4Bcl2表达的检测：RTPCR分析：提取293细胞总RNA，进行逆转录反应，然后通过PCR扩增Bcl2及参照基因GAPDHcDNA。Bcl2扩增引物为5’TTGCCACGGTGGTGGAGGA3’和5’AC

7、AGCCAGGAGAAATCAAACAG3’；GAPDH扩增引物为5’GTCTTCACCACCATGGAGAAGG3’和5’GCCTGCTTCACCACCTTCTTGA3’。PCR条件为：94℃变性4min，然后94℃1min,56℃45s,72℃1min,共24个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物用2%的凝胶进行电泳分析。2结果2.1RNAi抑制NIH3T3细胞目的基因表达情况2.1.1转染率的观察：NIH3T3细胞转染GFP/RNAi和GFP/Control载体后，荧光显微镜观察发现，GFP表达数量较强，