应用GFP标记基因研究RNAi载体的抑制效果

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1、应用GFP标记基因研究RNAi载体的抑制效果作者：谢书阳王萍玉岳真李有杰张公【摘要】目的用绿色荧光蛋白（GFP）反映RNA干扰（RNAi）载体的转染率，以研究RNAi载体的抑制效果。方法将GFP基因和RNAi片段（特异性针对Bcl2基因）连接至pC1载体上，构建共表达载体GFP/RNAi及其对照载体，转染293细胞，用荧光显微镜、流式细胞仪检测细胞的GFP转染率，并用TRPCR分析RNAi抑制Bcl2mRNA表达的效果。结果在293细胞中，GFP的转染率可达85%以上，此时观察到RNAi有效的抑制了Bcl2mRNA的表达。结论在RNAi实验时，可选用GFP等标

2、记基因作为载体转染率的判断标准，以进一步判断RNAi的作用效果。构建的RNAi载体有效的抑制了Bcl2的表达，为下一步抑制肿瘤细胞的生长提供科学资料。【关键词】绿色荧光蛋白；RNA干扰；Bcl2；细胞转染【Abstract】ObjectiveStudyingthesuppressioneffectofRNAibyusinggreenfluorescenceprotein(GFP)toreflectthetransfectionrate.MethodsGFPgeneandRNAisegmentspecifictoBcl2genewasinsertedintopC1

3、vectortoconstructthecoexpressionvector(GFP/RNAi),after293cellsweretreatedwithGFP/RNAivector,thetransfectionratewasestimatedfromGFPbyusingfluorescencemicroscopyaswellasFACSanalysis,and9thesuppressionofBcl2mRNAexpressionwasdetectedbyRTPCR.ResultsThetransfectionratewasabove85%fromdetect

4、ionofGFPpositivecells,andtheBcl2mRNAexpressionwasalsodecreasedto50%asitscontrolgroup.ConclusionThemarkergene(suchasGFP)maybeusedtoreflecttransfectionrateinRNAiexperiment,becausethetransfectionrateisimportantfortheinhibitiveeffectofRNAi.ThesuppressionofBcl2expressioniscrucialtoinhibitp

5、roliferationoftumorcells.【Keywords】GFP,RNAi,Bcl2,Geneexpression绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)是来源于发光水母(aequoreavictoria)的一种功能独特的蛋白质。GFP受光激发产生荧光是一个特异性的独立过程，在异源细胞内融合表达后可自发环化成熟，自发产生荧光且对异源细胞内的生理过程无干扰，可应用于活体细胞的适时检测。GFP是一种稳定蛋白，即使在较高浓度的强毒性药剂(如HCI胍、尿素、硫酸盐等)中延长孵育时间，荧光仍可持续存在［1］。研究证明EGFP是一种良好

6、的报告基因和筛选标志［2］，为进一步研究应用最广泛的哺乳动物细胞表达系统奠定了基?１狙芯垦∮肎FP作为标记基因，构建GFP/RNAi表达载体，用GFP的转染率反映细胞转染率，进一步判断RNAi对目的基因的作用效果，为体外进行RNAi实验提供科学的依据。1材料与方法1.1材料9脂质体2000购自Invitrogen公司，pC1载体购自Promega公司，RNA提取试剂盒购自UGENE公司，NheI、SalI等酶、逆转录酶购自TaKaRa公司，293细胞株购自中科院上海细胞生物研究所，DMEM培养基、胎牛血清购自GIBCO公司，GFP表达载体（Invitrogen）。测

7、序及引物合成由山东吉正科技有限公司完成。1.2方法1.2.1RNAi元件的设计和实验所用载体：依赖RNA聚合酶Ⅲ的H1启动子通过PCR从人基因组DNA中扩增获得［3］。Bcl2干扰片段的设计参考Tiscornia等报道［4］进行。正向片段序列为：5’AGCTCCCGCGATAGTGATGAAGTACATCTTCAAGAGAGATGTACTTCATCACTATCTTTTTGGAAAA3’，反向片段序列为5’CTAGTTTTCCAAAAAGATAGTGATGAAGTACATCTCTCTTGAGATGTACTTCATCACTATCGGG3’；两片