当归芍药散对激活的小胶质细胞tlr4_nf-κb信号通路及介导神经炎症反应的影响

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1、分类号：___________密级：__________UDC：___________当归芍药散对激活的小胶质细胞TLR4/NF-κB信号通路及介导神经炎症反应的影响姓名：丁瑞瑞学号：2111548037院系：中药学院学位类型：专业学位专业：中药学研究方向：中药质量分析与评价导师：曾宇副教授论文提交日期：2018年5月30日论文答辩日期：2018年5月21日学位授予单位：广东药科大学二〇一八年五月I广东药科大学硕士研究生学位论文THEINFLUENCEOFDSSTOAVTIVATEDMICROGLIACELLSANDNEUROINFLAMMATIO

2、NVIATLRs/-κBPATHWAYCandidate：DINGRUIRUIStudentID：2111548037Affiliation：SchoolofTraditionalChineseMedicineAcademicDegreeApliedfor：professionaldegreeofTCMSpeciality：AnalysisofTCMSupervisor：Prof.ZengYuAssistantSupervisor：DayofDefence：May2018Degree-Conferring-Institution：Guangdong

3、PharmaceuticalUniversityMay2018II当归芍药散对激活的小胶质细胞TLR4/NF-κB信号通路及介导神经炎症反应的影响中文摘要目的：阿尔兹海默病（Alzheimer’sdisease，AD）是一种神经退行性疾病，小胶质细胞在其发展进程中起着至关重要的作用。小胶质细胞过多的激活持续释放出炎症因子，引起神经炎症的发生和神经元损伤。通过抑制小胶质细胞过度激活，从而减轻神经炎症的发生和神经元的损伤。课题组前期研究发现当归芍药散（Dangguishaoyao-San，DSS）具有改善痴呆小鼠的学习记忆能力，保护神经的作用。本研究采

4、用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和β淀粉样蛋白（amyloidβ-peptide42，Aβ42）激活的小胶质细胞来揭示当归芍药散抑制小胶质细胞神经炎症反应的分子机制，为其发展成为防治AD的中药复方提供理论依据。方法：实验一当归芍药散对LPS诱导小胶质细胞活化的抑制效应：（1）采用MTT法检测不同浓度DSS对BV2小胶质细胞存活率的影响；（2）建立LPS诱导的小胶质细胞模型，采用Elisa法检测DSS预处理前后小胶质细胞释放炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS）的量；（3）采用qPCR法检测炎症反应相关膜蛋白受

5、体TLR2、TLR4及炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOSmRNA表达量；（4）采用Westernblot法检测TLR4/NF-κB信号通路中TLR2、TLR4、IL-1β、I广东药科大学硕士研究生学位论文IL-6、p-IκB和p-p65蛋白表达量；（5）采用LSCM法检测转录因子p65核转位现象。实验二当归芍药散对Aβ42诱导小胶质细胞活化的抑制效应：进一步实验采用寡聚化Aβ42活化BV-2小胶质细胞，进而探讨DSS是否通过TLR4/NF-κB信号通路抑制小胶质细胞的激活抑制神经炎症的发生。（1）首先建立Aβ42诱导的小胶质细胞炎症

6、模型，采用Elisa法检测DSS预处理前后小胶质细胞释放炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS）的量；（2）采用qPCR法检测炎症反应相关膜蛋白受体TLR2、TLR4，炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS基因mRNA表达量；（3）采用Westernblot法检测TLR4/NF-κB信号通路中TLR4、p-p65蛋白表达量；（4）采用LSCM法检测转录因子p65核转位现象。结果：MTT实验表明DSS浓度低于1.16mg/mL时，BV2小胶质细胞的存活率达到90%以上，高于2.32mg/mL时显著降低小胶质细胞BV2的存活率

7、。炎症造模试剂脂多糖的浓度为1µg/mL，作用24h，观察给药前后对细胞存活率并无显著影响。通过Elisa法测定IL-1β、IL-6、TNF-α和iNOS分泌量可以确定LPS浓度为1µg/mL，作用时间为24h，造模成功。给药处理后DSS显著降低了LPS诱导的IL-1β、IL-6、TNF-α和iNOS的分泌量。进一步qPCR检测结果显示，与LPS模型组比，DSS显著降低炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS及TLR2、TLR4基因表达量。WB结果显示，与LPS模型组作对比，DSS处理后膜蛋白受体TLR2、TLR4及炎症因子IL-1β、I

8、L-6、p-IκB、p-p65蛋白表达量显著下降。此外，LSCM实验发现DSS显II广东药科大学硕士研究生学位论文著抑制转