phev感染对小胶质细胞的激活及其分泌炎症因子的影响研究

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1、PHEV感染对小胶质细胞的激活及其分泌炎症因子的影响研究StudyonmicrogliaactivationandassociatedproductionofinflammatoryfactorsinducedbyPHEVinfection作者姓名：唐志文专业名称：临床兽医学指导教师：靳朝教授学位类别：农学硕士答辩日期：2015年6月5日本研究由国家自然科学基金项目资助（项目编号：31472194和31172291）TheresearchwassupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina（No.31472194a

2、nd31172291）中文摘要PHEV感染对小胶质细胞的激活及其分泌炎症因子的影响研究为了探究嗜神经性冠状病毒-猪血凝性脑脊髓炎病毒（PHEV）感染过程中小胶质细胞的应答反应，本研究分别将PHEV接种小鼠和小胶质细胞（BV2细胞）进行了体内和体外实验，以验证PHEV感染对小胶质细胞的激活及其分泌炎症因子的影响，为更全面地揭示PHEV感染过程中小胶质细胞发挥的免疫功能及其内在机制奠定基础。体内实验以PHEV易感的BALB/c小鼠为实验动物模型，以小胶质细胞表面特异性标记物Iba1蛋白为检测对象，利用荧光定量PCR、WesternBlot、免疫组化和间接免疫荧光等方法，分别从基

3、因转录水平、蛋白表达水平和组织学水平对PHEV感染后不同时间点小鼠脑内小胶质细胞的增殖、活化情况进行了检测分析，同时还利用基因芯片技术对PHEV感染后小鼠大脑皮质的多种炎症因子表达情况进行了检测。结果表明，滴鼻途径接种PHEV成功建立PHEV感染小鼠脑组织模型，为探究PHEV感染后脑内小胶质细胞是否发生激活提供坚实基础。与空白对照组相比，接毒组小鼠脑组织内的Iba1基因、蛋白表达量均有升高，且均随着感染时间延长而增大。将采集的小鼠脑组织制作石蜡切片进行免疫组化和间接免疫荧光检测，结果证实PHEV的感染激活了小胶质细胞，表现为细胞数量增多，呈聚集样分布；同时细胞形态变化也很明

4、显，胞体变大并呈阿米巴状。上述实验证实PHEV感染后小鼠脑内小胶质细胞发生了明显增殖、活化现象，且小胶质细胞的激活可能是持续性进行的，伴随PHEV感染的整个发病过程。基因芯片结果证实PHEV感染后小鼠大脑皮质内IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-α、IFN-β、CXCL10、CCL2等炎症因子表达出现不同程度的上调，特别是CXCL10、CCL2表达量在PHEV感染后变化极为显著。体外实验选择与原代小鼠小胶质细胞特征相似的BV2细胞为研究对象，对PHEV是否感染BV2细胞和PHEV刺激后BV2细胞Iba1、多种炎症因子及多种细胞信号通路相关蛋白表达情况进行了检测，并分析

5、了它们之间的内在联系。间接免疫荧光结果表明接种PHEV后BV2细胞中未检测到明显的PHEV病毒粒子，但标记Iba1的红色荧光强度出现一定程度的增强；荧光定量PCR结果表明，IPHEV活毒株、灭活毒株接种BV2细胞后，病毒基因表达均随接种时间延长而逐渐降低，这可能和病毒粒子发生降解和病毒未感染BV2细胞而不能进行复制均有关系；因此，我们认为PHEV不能感染BV2细胞。荧光定量PCR证实PHEV活毒株、灭活毒株均可刺激BV2细胞Iba1基因表达上调；WesternBlot结果证实PHEV刺激后BV2细胞Iba1蛋白表达显著性上调；上述实验证实PHEV虽不能感染BV2细胞，但能有

6、效刺激BV2细胞发生活化。荧光定量RCR结果表明，PHEV刺激BV2细胞活化后，IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-α和IFN-β等炎症因子表达出现不同程度的上调，而CXCL10、CCL2表达变化不显著。ELISA结果表明PHEV刺激BV2细胞分泌IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-α增加。此外，对某些细胞信号通路相关蛋白进行了荧光定量PCR检测，结果显示，虽然PHEV刺激BV2细胞表达TLR4、TLR9和RIG-I变化不显著，但TLR7、MyD88、MDA5、NF-κB、ASC、Caspase-1等表达显著性上调，为揭示其介导BV2细胞表达上述炎症因子的内在机

7、制奠定基础。PHEV刺激BV2细胞IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-α、IFN-β等炎症因子的表达与PHEV感染后小鼠大脑皮质结果趋于一致，均出现显著性上调，但BV2细胞表达不明显的CXCL10、CCL2在小鼠大脑皮质中表达尤为明显，说明小胶质细胞作为CNS中炎症因子的重要来源，在PHEV引发的病毒性脑炎进程中发挥重要作用；但毕竟小胶质细胞在CNS中含量较少，其他胶质细胞、神经元细胞、甚至某些透过血脑屏障的外周免疫细胞也参与CNS的炎性进程，故阐明小胶质细胞在PHEV引发的病毒性脑炎中发挥的作用还需更深入的