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《猪圆环病毒2型orf2和猪繁殖与呼吸综合征病毒orf5重组杆状病毒疫苗的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、!62!生物技术中国畜牧兽医2010年第37卷第9期猪圆环病毒2型ORF2和猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5重组杆状病毒疫苗的研究张翔峰,何逸民,曹宗喜,孔留五,张得玉,秦宏阳,张桂红(华南农业大学兽医学院,广州510642)摘要:参照GenBank上收录的基因组序列自行设计引物,分别扩增猪圆环病毒2型ORF2和猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5。将外源基因分别插入经改造的杆状病毒穿梭载体pFVC,获得3种重组质粒pFVCORF2、pFVCORF5、pFVCORF5ORF2。将重组质粒pFVCORF2、pFVCORF5、
2、pFVCORF5ORF2分别转入带有杆状病毒骨架的DH10BacTME.coli感受态细胞中。提取高质量的重组质粒rBacmidORF2、rBacmidORF5、rBacmidORF5ORF2,将重组质粒转染Sf9细胞,获取重组病毒rAcORF2、rAcORF5、rAcORF5ORF2。通过间接免疫荧光检测证实了外源基因正确表达。重组杆状病毒rAcORF2、rAcORF5、rAcORF5ORF2对BALB/c小鼠的免疫试验结果显示,rAcORF2、rAcORF5、rAcORF5ORF2均能够刺激
3、小鼠机体产生免疫应答,产生抗体,并能持续较长时间。关键词:猪圆环病毒2型;猪繁殖与呼吸综合征病毒;重组杆状病毒;BALB/c小鼠免疫试验中图分类号:S852.65文献标识码:A文章编号:16717236(2010)09006205猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种重1.1质粒载体、菌株及试验动物PCR克隆载体要的猪病原体,首次分离于荷兰,后又在美国分离到pMD18T购自大连宝生物公司。经改造的穿梭载该病毒(Tischer等,1982)。目前在新型疫苗的研制体pFVC、感受态细胞、E.co
4、liTop10、DH5和上,主要是采用PRRSV的ORF5基因,研究结果表E.coliDH10Bac,均由华南农业大学兽医学院农业明,该基因所编码的糖蛋白GP5是病毒的主要免疫部动物疫病防控重点开放实验室保存。6周龄雌性健原性蛋白,又称E蛋白,可诱导机体产生中和抗体康SPF级BALB/c小鼠,购自广东省实验动物中心。和保护性免疫(Allan等,1998)。猪圆环病毒(por1.2毒株PCV2GZ株和PRRSVXH株均由华cinecircovirus,PCV)是目前世界上发现的最小动南农业大学兽医学院禽病实验室分离保存。物病
5、毒之一,病毒粒子直径只有17nm,无囊膜。根1.3细胞Sf9昆虫细胞,由华南农业大学兽医学据PCV在致病性、抗原性及核苷酸序列上的差异,院农业部动物疫病防控重点开放实验室保存。可将其分为PCV1和PCV2两种类型,PCV1无致1.4引物设计根据PRRSV、PCV2已知序列,应病性,PCV2有致病性(Choic等,2000)。PCV2的用PrimerPremier5.0软件设计合成2对带有相应ORF2基因编码的Cap蛋白是病毒的衣壳蛋白,以酶切位点的引物,引物序列见表1。其为目的基因构建重组疫苗是当前的研究热点。昆1.5P
6、CV2的ORF2和PRRSV的ORF5基因及虫杆状病毒表达载体系统是一个利用杆状病毒作为ORF2ORF5基因的杆状病毒转移载体的构建用外源基因的载体通过感染昆虫细胞或者昆虫幼虫来高保真酶扩增PRRSV的ORF5和PCV2的ORF2表达外源蛋白的系统,该表达载体系统自开发成功基因。纯化后用Hind和Afl酶切后插入相同以来,得到了迅速的发展,已被证明为高效的真核表内切酶处理的pFVC载体,构建质粒pFVCORF5/达系统之一(胡少敏等,2004)。ORF2、pFVCORF5ORF2。将PCR和双酶切鉴定1材料与方法正确
7、的阳性质粒转化DH10Bac感受态细胞,PCR检测菌液,碱裂解法提取重组质粒。收稿日期:201004301.6转染及重组病毒的鉴定根据参考文献提供作者简介:张翔峰(1981-),男,河南人,硕士生,主要从事病毒的方法进行。取阳性重组质粒转染Sf9昆虫细胞,分子生物学研究。观察细胞病变,提取病毒DNA。用PCR鉴定为阳通信作者:张桂红。Email:guihongzh@scau.edu.cn性的重组病毒感染昆虫细胞扩大培养收获上清液。基金项目:国家现代生猪现代农业产业技术体系项目(nycytx009);家畜重要病毒基因工程疫
8、苗研究和创制(2006AA10A21.7重组杆状病毒目的基因的表达将重组杆状04);国家高技术研究发展计划(863计划)项目。病毒转染BHK21细胞,用间接免疫荧光检测目的中国畜牧兽医2010年第37卷第9期生物技术!63!表1含有酶切位
