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1、62微生物学免疫学进展2004年第32卷第1期X毕赤酵母表达外源基因研究进展3王 勇 综述;刘哲伟 审校(首都儿科研究所,北京 100020)摘 要:毕赤酵母表达系统作为一种新型酵母表达系统,它既有原核生物的特点,又有真核生物的特性,可以对目的蛋白质进行糖基化、二硫键形成等翻译后修饰。在过去的20年中已经有200多种不同蛋白在毕赤酵母中实现了〔1〕成功表达,其中许多已被广泛应用于临床诊断治疗或科研工作中。随着一系列新型酵母表达载体及菌株的构建及发酵技术的不断提高,毕赤酵母越来越吸引着科学家的关注,毕赤酵母己被发展
2、成为一种细胞生物学研究及基因工程生产的模式真核生物。本文总结了毕赤酵母的载体与菌株构建及发酵技术和糖基化等方面近年的主要研究进展。关键词:毕赤酵母;基因表达;发酵;糖基化中图分类号:Q815 文献标识码:A 文章编号:100525673(2004)0120062205 毕赤酵母(Pichiapastoris)是一种嗜甲醇酵母,AOX1可占到细胞分泌总蛋白的30%。1969年OgataK等首次发现它可以在甲醇为唯一碳毕赤酵母作为一种真核表达系统,与原核表达〔2〕源的条件下生长,醇氧化酶(Aleoholox
3、idase,AOX)系统及其它真核表达系统相比,具有一系列独特的是甲醇代谢途径中的第一个酶,它可以将甲醇氧化特性。表一列举了毕赤酵母表达系统的部分优〔3〕〔4〕为甲醛和过氧化氢,在甲醇为唯一碳源的条件下,点。表1 毕赤酵母表达系统的优点工艺学遗传学分子生物学在食品和发酵中常规使用选择性标记翻译后修饰采用高产的工业菌株稳定存在的突变体高效分泌发酵设备简单强启动子己知密码子偏好性培养基廉价易于扩大培养1 载体单交换(Singlecrossover),插入到酵母基因组中;也可由于毕赤酵母内没有稳定的附加体质粒,表达以发
4、生双交换(Doublecrossover)而取代AOX1基因,+s载体主要是可以整合到酵母基因组中的整合型质相应的表现型分别为Mut和Mut。无论外源基因〔5〕粒,其主要元件包括:启动子,信号肽,多克隆位以何种方式发生重组都可以同时有多个拷贝整合到点,终止子,选择标志,以及可以诱导基因发生重组基因组中,而且整合的基因拷贝数不同,表达量也有的同源序列和在大肠杆菌中的复制起点及抗药性基很大差异。通常情况下,拷贝数越多表达量越高,但因。载体转化入酵母后主要以插入或置换两种方式有时拷贝数增多,表达量反而下降。与酵母基因组
5、发生重组。含有AOX1基因序列的表1.1 启动子达载体既可以在酵母基因组AOXl或HIS4位点发生目前应用最多的启动子是AOXl启动子(PAOX1) 收稿日期X:2003202217;修回日期:2003205221 作者简介:王勇,(19752),男,硕士,主要从事基因克隆及表达研究。3通讯作者:E-mail:weiliu@hotmail.com.©1995-2005TsinghuaTongfangOpticalDiscCo.,Ltd.Allrightsreserved.微生物学免疫学进展2004年第32卷第1期
6、63和甘油醛三磷酸脱氢酶(GAP)启动子。PAOX1受甲醇程载体构建时必需考虑的重要因素,目前在毕赤酵的严格调控,在碳源为非甲醇的条件下,AOX1基因母载体中使用最多的选择标记是针对宿主菌营养缺转录的mRNA检测不到,但在甲醇为唯一碳源的培陷的野生型组氨酸脱氢酶基因(HIS4)。通常所用的养基中,AOX1基因编码的mRNA可达到总RNA的酵母菌是组氨酸脱氢酶缺陷型的(HIS4),如GS115、5%,AOX1则占到可溶性蛋白的30%,由此可见甲KM71,只有转化了含HIS4的载体的菌株才可以在醇的出现可以诱导AOX
7、l基因转录水平的提高。在组氨酸缺陷的选择性培养基上生长,但是能在选择PAOX1调控下表达外源基因时可通过调节甲醇而适性培养基中生长的菌株并不一定含有目的基因,+时地控制表达过程,这样可以有效地减轻选择压力,HIS4的转化子中约10%～50%根本不含有其它表保证外源基因的稳定存在。达载体成分,这主要是因为载体上的HIS4基因与基PGAP是Waterham等近年来克隆成功的一个构成因组中的his4位点发生重组导致回复突变所致,利〔6〕用电转化时该比例更高。性表达的启动子,它突出的特点是发酵过程操作毕赤酵母表达系统近年
8、来的主要进展之一就是简便,可以连续表达,无需诱导。入壳多糖酶基因在多拷贝整合克隆的快速筛选技术,在毕赤酵母体内PGAP调控下可以在稀释率为0.83/天的条件下连续〔7〕自发的多拷贝整合频率为1%～10%。近年来Invit2表达超过1个月,表达量稳定在300mg/L。肾转rogen公司开发了一系列含有药物抗性基因的载体,肽蛋白(Renalpeptidetransporter
