巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展.ppt

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1、巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展生科院杨军宿主系统载体系统转化系统表达系统蛋白修饰与分泌系统Content一、前言二、毕赤酵母简介三、毕赤酵母表达系统四、毕赤酵母表达系统优化启动子选择外源基因的特性基因剂量mRNA的非翻译区翻译后修饰产物的稳定性发酵条件五、前景展望在过去的数十年中，遗传学家致力于DNA的鉴定和基因重组的研究，而重组有机体主要应用于蛋白质的生产。由于一些蛋白具有巨大的商业价值，因此大多数研究致力于寻找能够高效生产有功能蛋白的途径。随着蛋白质工程和DNA重组技术的发展，诸多有应用潜力的蛋白分子有待开发，不同在蛋白在不同系统

2、中表达水平有显著差异，目前应用的表达系统包括细菌、酵母、昆虫、哺乳动物细胞等表达体系。其中酵母表达系统相对于其他表达系统有以下优点：不存在原核表达系统的内毒素难以除去的问题，也不存在哺乳动物细胞表达系统的病毒和支原体污染等问题；并能够对目的蛋白进行类似高等真核生物的信号肽剪切、二硫键形成、糖基化等过程的翻译后蛋白加工。在酵母表达系统中，巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris,Pp)表达外源基因最理想。下面就巴斯德毕赤酵母表达的特点和研究进展作一简要综述。前言巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能够在低廉的甲醇培养基中生长，甲醇能高效

3、诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达，因此生长迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所属强启动子、表达的可诱导性是巴斯德毕赤酵母表达系统的三大优势。由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以外源基因的表达序列一般整合入受体的染色体DNA上，因此能够稳定遗传。目前已有500多种外源蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中获得成功表达。二、巴斯德毕赤酵母简介Pichiapastoris甲醇代谢途径目前广泛应用于外源基因表达和研究的毕赤酵母宿主菌有两种主要类型：营养缺陷型宿主菌和蛋白酶缺陷型宿主菌三、毕赤酵母表达系统宿主系统营养缺陷型：GS115（his4）

4、最常用，此菌株的组氨酸脱氢酶基因突变，因此不能合成组氨酸，在不含组氨酸的培养基上不能生长，以此作为筛选标记。但由于自身合成蛋白酶对外源蛋白有降解，因此产物存在不均一的问题。其中KM71和SMD1168最常用，KM71（his4arg4aox1Δ::SARG）的AOX1部分缺失，并且被S.cerevisiae的ARG4取代。因此AOX1（强启动子）基因不能编码醇氧化酶，只能依靠AOX2基因（弱启动子）编码醇氧化酶，因此KM71为甲醇利用缓慢型（Muts）。蛋白酶合成缺陷型SMD1168（pep4Δ::URA3his4ura3）由于pep

5、4部分缺失，不能合成蛋白酶A，而蛋白酶B和羧肽酶Y由蛋白酶A激活，因此可以有效减少对外源蛋白的降解。但生产缓慢，导致蛋白产量上不去。载体系统由于毕赤酵母没有稳定的游离型载体，故应用整合型载体，通过同源重组整合到酵母染色体来实现稳定表达，整合位点一般是在AOX1或HIS4处，因此，载体上带有HIS4和AOX1基因的部分序列；还包括MCS和大肠杆菌复制所必需的元件，如复制起始位点，氨苄抗性基因；用于分泌表达的载体上还包括有信号肽序列。Generaldiagramofap.pastorisexpressionvector.YFG,’Your

6、FavoriteGene’;*,sitesforcassetteamplification胞内表达型载体分泌表达型载体转化程序重组子在酵母细胞中的命运用于转化子筛选的基因标记转化系统主要有三种方法：原生质体法：早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质体转化法，在Ca2+和PEG的存在下，转化细胞可达原生质体总数的1-2%；离子溶液法:酵母的完整细胞经碱金属离子（如Li+等）、PEG、热休克处理后，也可高效吸收质粒DNA。103~104个转化子/μgDNA；电穿孔法(electroporation)：酵母菌原生质体和完整细胞均可

7、在电击条件下吸收质粒DNA。105个转化子/μgDNA。转化程序导入毕赤酵母的重组质粒能通过同源重组整合到染色体上，不同的整合方式可产生不同表型的转化子：（1）同源双交换：表达载体线性化后，两端分别为5’AOX1和3’AOX1序列，与基因组的同源序列发生双交换后，导致毕赤酵母基因组内AOX1编码区被表达单元所替换，胞内醇氧化酶只能来自AOX2基因，酶活性大大降低。因此转化子表现为甲醇利用缓慢，表型为Muts。重组子在酵母细胞中的命运（2）特异性的单交换：表达载体在5’AOX1或3’AOX1处线性化后，与染色体基因组中的相应序列发生同源

8、重组，整合入AOX1基因的上游或下游。由于AOX1基因未被破坏，仍具有活性，所以转化子能正常利用甲醇，表型为Mut+，在甲醇为唯一碳源的培养基中正常生长。通常有5%-10%转化子出现多拷贝整合，可用重组子上标记基因（如G