5种紫花苜蓿愈伤组织诱导研究

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1、http://www.paper.edu.cn5种紫花苜蓿愈伤组织诱导研究段翠清甘肃农业大学农学院，兰州（730070）E-mail：6316934dcq2004@163.com摘要：以甘农1号紫花苜蓿、新疆大叶紫花苜蓿、阿尔冈金紫花苜蓿、陇中紫花苜蓿、公农一号紫花苜蓿的下胚轴和子叶为外植体，研究了MSA2，MSB2，MSC2三种培养基对愈伤组织诱导的影响。结果表明：不同外植体间的愈伤组织诱导率差异显著，以下胚轴的愈伤诱导效果比以子叶的愈伤诱导效果好，不同品种间愈伤组织诱导差异显著，阿尔冈金紫花苜蓿愈伤诱导最好；对于下胚轴，改良2,4-D(2mg/L)+6-BA(

2、0.5mg/L)+蔗糖(30g)+琼脂(7.5g)为最佳愈伤组织诱导培养基；而对于子叶，改良2,4-D(2mg/L)+6-BA(0.25mg/L)+蔗糖(30g)+琼脂(7.5g)为最佳愈伤组织诱导培养基。关键词：紫花苜蓿；子叶；下胚轴；愈伤组织；培养基近年来随着分子生物学的发展而兴起的转基因技术的研究，要求植物组织培养操作技术[1]达到更高的水平。豆科牧草是最具有经济价值和营养价值牧草之一。紫花苜蓿具有饲用价值好、蛋白质含量高(约占干物质的20%)及在生长期间不用大量施用N肥等特点，在畜牧业[1~2]生产中长期以来发挥着重要作用，被人们冠以“牧草之王”的美誉。但

3、是苜蓿的遗传改良工作有必要继续加强，苜蓿属内有60多个种，具有丰富的遗传资源，且野生苜蓿在抗逆性、适应性等方而均优于栽培种苜蓿。如将其优良性状转移到后者就能进一步扩大苜蓿的种植范围，提高产草量为生产服务。苜蓿常规有性杂交往往得不到杂交种子或杂种不育，存在着不亲和现象，生物技术的发展促进了远缘间遗传物质的重组研究。另外将一些优良基因导入或通过物理化学手段诱变培养优质高产多抗新品种是现代育种科学的发展方向，基因片段的转[3]入及诱变处理对象多是具有分化再生能力的愈伤组织。目前我国启动的“林草转基因重大研究项目”中，也将苜蓿作为重要的试验材料之一。因此，苜蓿愈伤组织诱导

4、的试验研究意义重大。1文献回顾苜蓿生物技术的应用研究，国际上始于60年代末。70年代初国外就从苜蓿的愈伤组织成功诱导出了植株，这一成果成为组织培养技术在苜蓿研究上的里程碑。苜蓿的组织培养最早见于美国科学家Saunders陇东苜蓿的报道，他们采用的外植体包括花药、胚珠、子叶、胚轴，首先采用含有2.0mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D），萘乙酸（NAA）和激动素（KT）[4]的改良培养基，使上述器官产生愈伤组织。Saunders和Bingham随后发现了生长调节剂[4~5]对愈伤组织芽分化的影响，他们强调了在愈伤诱导中2,4-D的效应。也有学者指出诱导培养基上

5、高浓度的2,4-D和低浓度的KT，使产生的愈伤组织转移到再生培养基上后产生大量的无根苗。相反，在低2,4-D浓度，高激动素浓度的诱导培养基上产生的愈伤组织，当转[6]移到再生培养基上时则形成了大量的根。我国的苜蓿生物技术研究始于80年代初，1981年中国科学院植物生理研究所杨燮荣教授在国内首次利用紫花苜蓿叶片、叶柄、茎段为外植体，采用MS+2,4-D的培养基成功诱导出了愈伤组织，并分化出苗，经过180天，获得了苜[7]蓿的再生植株。1985年，中国农业科学院畜牧研究所的李聪等人，利用植物细胞组织培养技术，进行了苜蓿抗盐的细胞筛选，获得了耐盐细胞系和再生植株，并从中

6、筛选出耐盐植株[8]。在苜蓿的原生质体培养方面，1982年中国科学院遗传研究所吕德扬研究员从苜蓿原生质-1-http://www.paper.edu.cn[9]体再生植株成功。1989年中国科学院遗传研究所黄绍兴等人已成功将GUS基因整合到紫[10]花苜蓿的核基因组上，并得到表达。2000年，吕德扬等得到了苜蓿高含硫氨基酸蛋白转[11]基因植株。[4]对于苜蓿组织培养的研究20世纪70年代以来取得了很多成果。除上面提到的Saunders[12]外，王瑞云等通过调节2,4-D浓度，以七个品种子叶为外植体进行的愈伤组织诱导研究。时永杰等对苜蓿子叶、下胚轴、茎、叶、花序

7、、子房、花药等进行离体培养，并诱导分化成[13]苗。王姝杰通过调节2,4-D和KT浓度，以阿尔贡奎因紫花苜蓿下胚轴为外植体进行愈伤[14]诱导的研究。在诸多再生体系建立和育苗试验中，愈伤诱导是必要的前期工作。因此，进行了紫花苜蓿的愈伤组织诱导，以期为建立紫花苜蓿高频再生组织培养体系提供依据。2材料和方法2.1供试材料2.1.1植物材料紫花苜蓿品种：甘农1号紫花苜蓿，新疆大叶紫花苜蓿，陇东紫花苜蓿，阿尔冈金紫花苜蓿，陇中紫花苜蓿，公农一号紫花苜蓿。取其无菌苗的下胚轴和子叶。2.1.2培养基基础培养基：MS培养基。添加的两种激素：2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸），6

8、-BA（6