农杆菌介导atpcs1和cyp78a5基因转化紫花苜蓿再生体系的研究

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1、农杆菌介导AtPCSl和CYP78A5基因转化紫花苜蓿再生体系的研究指导教师签字：逝!复二答辩委员会成员签字：金!主z虚盆塑圣趣聋趔躯≥恶麦青岛科技大学研究生学位论文农杆菌介导AtPC,SI和CYP78A5基因转化紫花苜蓿再生体系的研究摘要本研究利用农杆菌介导法将AtPCSl和CYP78A5两个目的基因转入紫花苜蓿愈伤组织，并通过紫花苜蓿再生得到含有AtPCSl和CYP78A5目的基因的植株。再生植株具有富集重金属和有机污染物的能力，可以用来修复复合污染的土壤。螯合肽合成酶基因AtPCSl是与重金属富集相关的

2、基因，细胞色素氧化酶基因CYP78A5是与有机物抗性、积累相关的基因。目前，国内外尚未出现同时利用这两个基因进行土壤修复的报道。实验构建含有AtPCSl、C冲7醐5基因的植物双元表达载体：用目的基因替换表达载体pBll21上的Gus基因，构建P35S．AtPCSl(CYP78A5)．T35S表达盒，然后通过冻融法将表达载体pBll21．AtPCSl、pBll21．CYP78A5转入农杆菌LBA4404中。实验用含有AtPCSl、CYP78A5目的基因的农杆菌浸染紫花苜蓿下胚轴，通过组织培养，筛选出抗性愈伤组织

3、，并诱导生芽生根，构建并优化了适合“三得利”紫花苜蓿的遗传转化再生体系。经共培养、选择培养最终获得了200株抗卡那霉素的转基因植株。筛选出的抗性植株进行了DNA，RNA，蛋白质水平检测后，对转基因植株的抗重金属和有机物功能进行了鉴定。结果表明所获得抗性紫花苜蓿植株整合了外源目的基因AtPCSl和C冲7黝5并进行了有效表达。关键词：紫花苜蓿AtPCSl基因CYP78A5基因农杆菌介导法土壤修复农杆菌介导AtPCSl和CYP78A5基因转化紫花苜蓿再生体系的研究II青岛科技大学研究生学位论文STUDIES0NI也

4、GENERATIONSYSTEMANDTRANSFORMATIONOF彳理)(：SJANDC】P76Ⅵ5GENESBYAGROBACTERIUMINALFALR～ABSTRACTInthisstudy，wetransducedAtPCSlandCYP78A5genesintoalfalfacallususingAgrobacterium-mediatedtransformation，andobtainedalfalfaplantscontainingAtPCSlandCYP78A5genesthroughth

5、eregeneration．Regeneratedplantshavethecapacityoftheenrichmentofheavymetalsandorganicpollutants．ThereforetheyCancontrolandrepairsoilpollution．AtPcs1geneisinterrelated讹theaccumulationofheavymetalsandC即7剐5geneisinterrelatedwimtheaccumulationoforganicpollutants

6、．Alldidn’tseethesamereportaboutthisresearchcurrently．Inthispaper．weconstructedabinaryexpressionvectorwhichcarryingAtPCsigeneandcYP78A5gene：theGusgeneinthevectorPBI121wasreplacedbytheexogenousgeneatfirst，andconstructP35S-AtPCSl(CYP78A5)-T35Sexpressioncassett

7、es，whichCanbeexpressedhighlyinthealfalfa．Then，wetransducedtherecombinationplasmidsintotheAgrobacteriumtumefaciensLBA4404bythefreezethawingmethod．WeusedAgrobactefiumcontainingAtPCSlandCYP78A5genestodisseminatethehypocotylofalfalfa，thenthroughtissueculture，se

8、lectedresistantcallus．Bydifferentiation，budding，rooting，weoptimizedandconstructedthemostsuitablegenetictransformationregenerationsystemforalfalfa．Inoculatedcalluswereculturedsuccessivelyoncocultivemedi