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《农杆菌介导iaam 基因黄瓜遗传转化体系的建立》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、农杆菌介导iaaM基因黄瓜遗传转化体系的建立苏绍坤,刘宏宇,秦智伟*（（东北农业大学园艺学院，黑龙江哈尔滨150030）收稿日期：2004-03-21基金项目：国家高科技研究发展计划(863)资助项目(2002AA27013)作者简介：苏绍坤(1978-),男,黑龙江人,硕士研究生,研究方向为蔬菜分子遗传育种。*通讯作者E-mail:qzw303@126.com摘要：以已经建立的高频黄瓜再生体系为基础,从影响黄瓜转基因体系的农杆菌侵染时间,共培养时是否加入乙酰丁香酮等因素优化了黄瓜遗传转化体系;将单性结实基因iaaM以农杆菌介导法导入到东
2、农649品种黄瓜子叶节中,经过不定芽诱导和生根等过程获得了转基因株系,通过特异性引物的PCR鉴定,40个株系扩增出iaaM目的基因片段。PCR-Southern检测为阳性。转基因阳性植株移栽到温室中,其果实经检测80%为单性结实黄瓜。关键词：黄瓜;单性结实基因iaaM;遗传转化;抗性鉴定转基因技术在黄瓜上的应用一直受再生频率和遗传转化频率低的限制,国内外从事黄瓜体外再生研究主要是从原生质体培养和体细胞悬浮培养入手[1-2],这些方法同样难以提高遗传转化频率。因此,建立一个高效的再生及遗传转化体系对黄瓜转基因研究具有十分重要的意义。黄瓜在我
3、国栽培广泛,在蔬菜生产和国民经济中均占有一定的地位。我国保护地栽培的面积正不断扩大,目前,黄瓜的栽培面积仅次于番茄居第二位,所用的品种多为长春密刺、津春系列和津优系列等,这些品种在其开花坐果期往往受到低温的影响或遇到多阴连雨的天气将导致授粉受精不良、结果率低、果实易表现畸形而导致减产和降低果实的商品性。若进行人工授粉或饲放蜜蜂授粉,则增加生产成本,降低效益,而单性结实品种可以克服以上缺陷。本实验将单性结实基因iaaM导入黄瓜中,增加子房中生长素的含量,提高转基因植株的单性结实率,不仅为黄瓜的育种提供了单性结实能力的新材料,而且还为分子水平
4、上的黄瓜果实发育研究打下基础,为甜瓜,西瓜等其它园艺作物的单性结实研究提供参考。1材料与方法1.1植物材料及无菌苗培养黄瓜亲本品种649由东北农业大学园艺学院瓜类课题组提供;黄瓜种子在50%次氯酸钠中消毒10min,在70%酒精中消毒30s,无菌水冲洗5~6次,然后接种于琼脂固体培养基。在组织培养室中培养得无菌苗。1.2根癌农杆菌及其质粒采用根癌农杆菌LBA4404菌株,其中含质粒pCAM-2A12iaaT,该质粒带有单性结实基因iaaM和抗卡那霉素(Km)筛选的新霉素磷酸转移酶NptⅡ基因,基因表达由启动子2A12调控。1.3菌株的培养
5、将农杆菌划线培养在含有50mg·L-1卡那霉素和50mg·L-1链霉素,50mg·L-1利福平的YEB培养基上,长出菌落后,挑取单菌落接种于10mLYEB液体培养基中,28℃振荡培养,过夜。取5mL接种于50mLYEB液体培养基中振荡培养,进行2次活化。OD600=0.5～0.6时即可用于侵染。1.4影响根癌农杆菌转化效果的因素以649为主要试材,取3d苗龄的子叶节为外植体,与OD600=0.5～0.6的菌液真空侵染7min,在黑暗下共培养2d后,转入筛选培养基进行选择培养。其间继代2~3次。在以下影响因子的设计处理中,分别以某一因子为变
6、量,以对应因子作对照,其它因子以上述转化程序为标准,观察各影响因子对转化频率的影响。所有实验处理均设3次重复。1.4.1预培养和共培养方式外植体在预培养培养基上预培2d后进行侵染转化,设不预培养对照;共培养分光培和暗培两种,观察对转化频率的影响。1.4.2不同共培养基对转化频率的影响共培养培养基pH分别为5.2,5.4,5.8。1.4.3侵染时间和侵染方式分别设3,7,15min,真空侵染和摇动侵染观察对转化的影响。1.4.4卡那霉素筛选浓度确定初步筛选试验:将子叶节接种到含卡那霉素浓度0,25,50,75,100mg·L-1的芽诱导培养
7、基上进行培养,10d继代1次,3周后统计分化结果。最终筛选浓度确定:以初步筛选结果较好的浓度为中心,设置第2次浓度梯度,共设为5个梯度,方法同上。3周后调查结果,以完全抑制子叶节分化为最佳的筛选浓度。1.5抗性植株的分子检测1.5.1PCR检测植物总DNA的提取用CTAB方法[3]。用特异性引物对植株进行PCR扩增。1.5.2PCR-Southern杂交分析用地高辛杂交试剂盒。取转化植株基因组及非转化基因组为阴性对照,阳性质粒为阳性对照,用从质粒上酶切下来的目的基因标记探针,通过DNA电泳、转膜、预杂交、杂交、显色等步骤对抗性植株进行检测
8、。2结果与分析2.1预培养和不同共培养方式对转化效率的影响在子叶节浸染农杆菌之前预培养2d,芽再生频率为36.5%,不进行预培养,直接用根癌农杆菌感染的子叶再生绿芽频率为19.7%(图1)。表
