巨龙竹种子_小穗外植体愈伤组织的诱导培养

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种子净度分析台http://www.zj-top.com/巨龙竹种子、小穗外植体愈伤组织的诱导培养*1,211耿树香,普晓兰,王曙光(11西南林学院,云南昆明650224;21云南省林业科学院,云南昆明650204)摘要:通过对巨龙竹种子和小穗两种外植体愈伤组织初导培养基和增生培养基的筛选及防褐化处理试验,结果表明,巨龙竹种子和小穗初导培养基最优组合为3/4MS+3mg/L2,4-D+013mg/LKT+25g/L,MS+3mg/L2,4-D+013mg/LKT+25g/L;其种子和小穗的增生培养基最优组合分别为MS+(3~5mg/L)2,4-D+013mg/LKT、MS+3mg/L2,4-D+013mg/LKT;在特定培养条件下,对褐变有一定程度的控制。关键词:巨龙竹;种子;竹穗;MS培养基;愈伤组织培养中图分类号:S79519;S72213文献标识码:A文章编号:1672-8246(2006)04-0078-06AStudyonCallusInductionCultureofDendrocalamussinicus1,211GENGShu-xiang,PUXiao-lan,WANGShu-guang(11SouthwestForestryCollege,KunmingYunnan650224,P1R1China;21YunnanAcademyofForestry,KunmingYunnan650204,P1R1China)Abstract:ExperimentofcallusinductioncultureofDendrocalamussinicusincludingmediumscreeningandbrown-preventedwasconductedbyusingseedandsmallbamboospikeasexplants1Theexperimentalresultsshowedthattheoptimummediaforcallusinductionofseedsandsmallbamboospikewere3/4MS+(3~5mg/L)2,4-D+013mg/LKTandMS+3mg/L2,4-D+013mg/LKTrespectively,therateofcallusinductionachieved100%1TheoptimummultiplicationmediawereMS+(3~5mg/L)2,4-D+013mg/LKTandMS+3mg/L2,4-D+013mg/LKTrespectively1Theexperimentalresultsalsoindicatedthatcultureunderdarkcond-ition,thebrownphenomenoncouldbesomewhatprevented1Keywords:Dendrocalamussinicus;seed;smallbamboospike;MS;callusculture[9]20世纪80年代以来,不少国家与地区开始把acuminatn)、龙头竹(B1vulgaris)、龙竹(Dendrocal-[10]组培方法应用于竹类繁殖,认为是快速发展竹类的amusgiganteu)等进行了组织培养的研究。分别一条新途径。现今印度、我国台湾、新加坡、马来以种子的种子胚及胚状茎轴,嫩梢竹枝小段,侧嫩西亚、泰国、日本、比利时、菲律宾、尼泊尔、苏梢顶芽,茎节间组织切段,空心茎休眠芽,幼竹笋格兰等国家或地区,先后对牧竹属(Dendrocala-叶箨基部小块,花药花序等为外植体,应用添加了[1]mus)、莿竹属(Bambusa),绿竹属(Dendrocalam-各种不同浓度激素的MS或改良MS培养基、改良[2][11][12][3]opsis)、刚竹属(Phyllostachys)和赤竹属(Sasa)中White、BM和B5培养基,通过固体或液体[3]的一些竹种,如牡竹(Dendrocalamusstrictus)、悬浮培养或原生质体培养等方法,诱导出愈伤组织[4]白绿竹(B1oldhamii)、吊丝球竹(Dendrocalamop-或丛芽,并在多个竹种上培养出小植株。还对某些[5][6][13]sisbeecheyana)、凤凰竹(B1multiplex)、人面竹种的试管开花进行了研究,并获得成功。竹子[7][8](P1Aurea)、赤竹(S1pygmaea)、马甲竹(B1tulda)、组培在我国相对起步较晚,迄今为止,只有印度莿版纳甜龙竹(Dendrohamiltonii)、墨西哥雨竹(Otatea竹(Bambusaarundinacea)、黄竹(Dendrocalamus*收稿日期:2006-09-12第一作者简介:耿树香(1978-),女,云南宣威人,硕士,主要从事林木细胞与分子生物技术的研究。 第4期[14][15]membranceus)、麻竹(D1latiflorus)和勃氏甜织诱导的主要影响因素及最适初导培养基。[16]竹(D1brandsii)壮绿竹(D1validus)等少数竹种的组培获得成功。表1正交试验因素水平表巨龙竹(Dendrocalamussinicus)是禾本科(Gra-Tab11Factorsandlevelsoforthogonalexperimentmineae)竹亚科(Bambusoideae)牧竹属(Dendrocala-2,4-DKT蔗糖改良MS-1-1-1水平/mg#L/mg#L/g#Lmus)大型热带丛生竹,是世界上干形最大的工业(A)(B)(C)(D)用材竹种。但其受生长特性的限制,只生长于云南11201320的局部地区,不耐寒冷,且本竹种具有大多数竹类23/4301525植物所具有的共性)))败育,种子产量极低,因而31/2411030阻碍了该竹种的发展。本项目对巨龙竹的组培技术注:MS为Murashige&Skoog;2,4-D为2,4-二氯苯氧乙酸;KT进行了研究,从中对巨龙竹愈伤组织及其增殖所用为激动素(6-呋喃氨基嘌呤),下表同。培养基的选择、激素的使用及变褐等问题进行了探113两种外植体愈伤组织增生培养基的筛选试验讨。及防褐化处理诱导巨龙竹愈伤组织的基本培养基,经正交实1材料与方法验选择后进一步进行巨龙竹愈伤组织的增生培养,111取材与消毒并选择合适的愈伤组织增生培养基。把消毒好的巨2005年8月从云南沧源的班老与班洪乡采到龙竹外植体(种子及小穗)于同一天分别接种在6220粒巨龙竹种子及一些未开花的小穗,小穗置于种培养基内,种子有48瓶;小穗有40瓶;每瓶4个材料。冰箱(4e)保存备用。(1)选取饱满、发育完全、污染较轻的种子,接种后放入26?2e恒温培养箱中进行暗培养。削去其长花柱一端的较多茸毛,经蒸馏水清洗后,每隔15天继代一次,较大的愈伤组织切离外植体,用2%~215%的NaCl溶液消毒15min,蒸馏水接种到增生培养基上。继代培养8代左右,分别调清洗3次后,用淡红色的高锰酸钾水溶液浸泡催芽查各不同培养基愈伤组织出现的天数,以比较各种12~16h。接种前,在超净工作台上再用2j的诱导培养基和选择合适的外植体。对已诱导出愈伤HgCl2溶液消毒30min,用无菌水清洗5次后接种。组织并褐化的巨龙竹种子有16瓶,小穗的为20瓶,消毒时,加3~4滴吐温作表面活化剂,并摇动,每瓶4个材料,在不同培养基中进行增生培养,并使材料能均匀消毒。对其褐化的巨龙竹愈伤组织进行防褐化处理。(2)小穗用自来水冲洗干净,蒸馏水清洗3次后,在超净工作台上再用75%的酒精浸泡0152结果与分析min,以2j的HgCl2溶液消毒30min,用无菌水清洗5次后接种。211两种外植体愈伤组织初导培养基的筛选结果112两种外植体愈伤组织初导培养基的筛选试验初导培养基筛选正交试验及分析结果见表2。影响巨龙竹愈伤组织产生的因素很多,如所取表2中,其极差计算公式:Rj=max(Kj1Kj2,,的外植体,基本培养基的种类,2,4-D的用量,Kjm)-min(Kj1Kj2,,Kjm)计算得R值,试验蔗糖的用量,KT的用量,培养基的pH值等。结果表明巨龙竹种子各R值,RB>RA>RC>RD,采用改良MS、3/4MS和1/2MS(大量元素的所以因素对试验指标影响的主次顺序为B>A>C用量为全MS的3/4,其他母液的用量不变。1/2MS>D,即:2,4-D用量>改良MS>KT用量>蔗类推)做基本培养基,加入不同浓度的细胞分裂素糖用量。而巨龙竹小穗各R值中RB>RC>RA>(BA或KT),外加20~30g/L蔗糖为碳源,凝固RD,所以因素对试验指标影响的主次顺序为B>C剂琼脂为518~615g/L,pH值为518~612。>A>D,即:2,4-D用量>KT用量>改良MS>用正交试验选择其最优组合,即用4因素3水蔗糖用量。4平的L9(3)正交表安排此实验,见表1。用极差Kjm为第j列因素m水平所对应的试验指标和。分析选择试验参数。选择巨龙竹种子及小穗愈伤组从表2中可得巨龙竹种子初导培养基中A2、B2、 西部林业科学2006年C2、D2分别为A、B、C、D的优水平,而A、B、的优水平。而A、B、C、D4因素的优水平组合C、D4因素的优水平组合A2B2C2D2为最优水平组A1B2C2D2为最优水平组合,即巨龙竹小穗愈伤组合,即种子初导培养基为3/4MS+3mg/L2,4-D织的初导培养基的最佳配方为MS+3mg/L2,4-D+013mg/LKT+25g/L蔗糖。而巨龙竹小穗的初+013mg/LKT+25g/L蔗糖。导培养基中A1、B2、C2、D2分别为A、B、C、D表2初导培养基筛选正交试验结果Tab12Orthogonalexperimentalresultsofinductionculturemediumscreening因素出愈率/%处理改良MS(A)2,4-D/mg#L-1(B)KT/mg#L-1(C)蔗糖/g#L-1(D)种子(小穗)11(1)1(2)1(013)1(20)5415(4812)21(1)2(3)2(015)2(25)70(5512)31(1)3(4)3(110)3(30)6612(4714)42(3/4)1(2)2(015)3(30)6715(4811)52(3/4)2(3)3(110)1(20)6915(4819)62(3/4)3(4)1(013)2(25)6912(4816)73(1/2)1(2)3(110)2(25)6513(4512)83(1/2)2(3)1(013)3(30)69(5114)93(1/2)3(4)2(015)1(20)6813(4810)Kj119017(15018)18713(14115)19217(14812)19213(14511)Kj220612(14516)20815(15515)20518(15113)20415(149)Kj320216(14416)20317(14410)201(14115)20217(146190)Kj16316(5013)6214(4712)6412(4914)6411(4814)Kj26817(4815)6915(5118)6816(5014)6812(4917)Kj36715(4812)6719(4810)67(4712)6716(4910)优水平A2(A1)B2(B2)C2(C2)D2(D2)Rj511(211)711(416)414(312)411(113)注:出愈率为愈伤组织出现的百分率=出现愈伤组织的接种材料数/接种材料总数@100%。初导培养基筛选因素的主次顺序,种子为BACD,小穗为BCAD。在表2巨龙竹愈伤组织增生培养基中添加KT,浓度范围内都能诱导愈伤组织产生,但对于愈伤组易使愈伤组织基部变黑,致使愈伤组织的增生受到织的形成及愈伤组织的质地都宜采用较低浓度的一定程度的抑制,因此,诱导愈伤组织产生的关键2,4-D。一般采用MS+3mg/L2,4-D+013mg/L主要不在于生长素与细胞分裂素的比例,而在于选KT作为巨龙竹愈伤组织的基本培养基。择合适浓度的2,4-D。虽然2,4-D在3~10mg/L表3巨龙竹种子及小穗愈伤组织增生培养结果Tab13Resultsofcallusmultiplicationcultureofseedsandsmallbamboospike时间/d试验种子愈伤组织生长状况小穗愈伤组织生长状况7~15加KT不加2,4-D愈伤组织未出现愈伤组织未出现有的胚轴表面长出愈伤组织,有的直接从种子胚愈伤组织水渍化,易褐化,且生15加2,4-D,不加KT一端长出,愈伤组织萌发较早的开始长出子叶长缓慢大部分种子长出愈伤组织,萌发较早且长出子叶大部分小穗出现愈伤组织,脆,15~30加2,4-D,加KT的种子未形成愈伤组织易褐化整个小穗都膨大,仅小穗的顶部>30加2,4-D,加KT愈伤组织继续膨大,易褐化,需继代培养和各小花的外稃没有愈伤组织 第4期耿树香等:巨龙竹种子、小穗外植体愈伤组织的诱导培养212两种外植体愈伤组织增生培养基的筛选织颜色质地不同。由表4结果看出,巨龙竹种子为及防褐化处理结果外植体、基本培养基为MS+(3~5mg/L)2,4-D两种外植体愈伤组织增生培养基的筛选结果见+013mg/LKT所产生的愈伤组织为白色至黄白色,表3、表4。由表3结果显示:使用不加2,4-D,质地疏松,易碎颗粒;小穗为外植体、培养基为只加细胞分裂素KT(012~015mg/L)的MS基本培MS+3mg/L2,4-D+013mg/LKT所产生的愈伤养基,均没有愈伤组织的出现;另外,用不加任何组织为白色至黄白色,质地疏松;其他的不同浓度细胞分裂素、只加2,4-D(3mg/L)所进行的试验,2,4-D及KT结合使用培养基所诱导出的愈伤组织2周后出现愈伤组织,由此看来细胞分裂素对巨龙竹质地不好,均有不同程度的褐变。所以对于巨龙竹种子愈伤组织的诱导效果不佳。对小穗,2,4-D为不同外植体诱导其愈伤组织产生的最适基本培养基3~7mg/L的浓度范围内,在15~30天内都可诱导不同,种子的愈伤组织增生培养基是MS+(3~5出愈伤组织,而且接种几周后,所产生的愈伤组织mg/L)2,4-D+013mg/LKT,小穗为:MS+3出愈率接近,种子的为9010%,小穗的为9115%。mg/L2,4-D+013mg/LKT,见表4。不同巨龙竹外植体及不同培养基产生的愈伤组表4巨龙竹两种外植体愈伤组织增生培养基筛选结果Tab14Resultsofmultiplicationculturemediumscreeningoftwoexplants供试材料培养基愈伤组织质地及色泽种子MS+(3~5mg/L)2,4-D+013mg/LKT愈伤组织白色到黄白色,质地疏松小穗MS+3mg/L2,4-D+013mg/LKT愈伤组织白色到黄白色,质地疏松两种外植体愈伤组织增生培养基防褐化处理结是接近培养基的基部开始变褐变黑,使愈伤组织块果见表5。对已褐化的巨龙竹愈伤组织去除褐化部从白色渐转成灰褐或黄褐色,并向培养基周围扩分进行增生培养,在增生培养基中虽然改善了愈伤散,直至整瓶培养基呈褐色,褐变对细胞有毒害作组织培养的营养环境,但其增生效果并不理想。原用,愈伤组织随着黑褐部分向上蔓延,而变黑死因是竹类含酚多,氧化而引起愈伤组织褐变。首先亡。表5不同防褐化物质对愈伤组织诱导的效果比较Tab15Resultsofmultiplicationculturemediumscreeningoftwoexplants-1培养抗褐剂/%激素/mg#L天然营养物种子愈伤组织小穗愈伤组织-1基号活性炭2,4-DKTBA100/mL#LCW褐变率/%褐变率/%101330133218381520125301310030123712301230138031163913413013603312361250105301301535163315601340133118361470125401310036153315801240138034133811914013603712371210010540130153615351511013501333163914120125501310034123618130125013803814351414150136033163614150105501301537113318注:褐变率为褐化组织出现的百分率=新出现褐化愈伤组织的接种材料数/接种材料总数@100%;基本培养基均为MS+25g/L蔗糖+615%琼脂。BA为6-苄基腺嘌呤;CW为椰乳。 西部林业科学2006年虽然及时切除黑褐部分,更新培养基,可在一个关键因素,因此选择合适光照对愈伤组织诱导极定程度上保持愈伤组织有活力的部分,但增生部分为重要。在暗培养条件下巨龙竹愈伤组织诱导率与需切去部分相同,使愈伤组织长期增长不显著。高,基本不褐化;由于光照可以增强多酚氧化酶的为防止褐变,在培养基中加入吸附剂活性炭,可减活性,光培养条件下愈伤组织诱导率高长势旺盛,轻褐变而不能完全控制褐变,且加入活性炭的各种但褐化严重。培养基中,愈伤组织增生效果均不理想,可能是连综上所述,对于巨龙竹外植体诱导其愈伤组织续使用活性炭,在吸收酚类等有害物质的同时,也产生的最适培养基,种子与小穗的分别是3/4MS大量地吸收了对愈伤组织有用的成份,从而影响了+(3~5mg/L)2,4-D+013mg/LKT、MS+3愈伤组织的增生。愈伤组织生长不良,则更易于竭mg/L2,4-D+013mg/LKT。并置于25~26e暗变。培养条件下,更有利于巨龙竹种子和小穗愈伤组织表5中,巨龙竹两种外植体愈伤组织的诱导培诱导,愈伤组织长势旺盛,褐化程度低,诱导周期养均在25~26e暗条件下培养。因为在暗培养条短,愈伤组织诱导率达100%(除去受污染及死件下,可使一些光诱导参与酚类合成和氧化的酶活亡的外植体)。性减弱,酚类合成减少,氧化物醌类也相应减少,使褐变得到一定程度的控制。参考文献:由于巨龙竹的小穗结构复杂,沾染的微生物也较多,所以试验中小穗的污染率比种子的污染率[1]TsengTC,LiuF,ShaioSY.Isolationofprotoplasts高。一般在小穗的基部开始出现黄色的絮状污染fromcropplants[J].Bot.Bul.lAcad,Sin.,1975(16):55-60.物,之后污染物会逐渐扩散,导致外植体死亡,或[2]HuangLC.MurashigeT.Tissuecultureinvestigation者小穗上出现白色的菌丝使小穗死亡。为小穗的愈ofbambooI.CalluscultureofBambusa,PhyllostachysandSasa伤组织诱导出并开始变黄时需要立即接入新的培养[J].Bot.Bul.lAcad,Sin.,1983(24):31-52.基中,否则容易变褐死亡。最好等愈伤组织长大以[3]RaoIU.RaoIVR,NarangV,Somaticembryogenesis后,再切断进行增殖培养,并可在同一培养基中放andregenerationofplantsintheDendrocalamusstrictus[J].入多块愈伤组织,这样生长效果更好。PlantCellReports,1985(4):191-194.[4]Teh,ML.AndWCChangPlantregenerationthroughsomaticembryogenesisincalluscultureofgreenbamboo(Bam-3结语busaoldhammiiMunro)[J].TheoryApplGenet,1986(73):(1)巨龙竹种子、小穗外植体愈伤组织诱导161-164.[5]Teh,ML.AndWCChangSomticembryogenesisand结果表明:激素组合不同,巨龙竹愈伤组织的诱导subsequentplantregenerationfrominflorescenceofBambusa率也有差异。在无2,4-D时不能诱导出愈伤组oldhammiiMunrovar.beecheyyana[J].PlantCellReports,织;在2,4-D与KT的组合中,2,4-D(2~101986(5):409-411.mg/L)+KT(012~1mg/L)都能诱导出愈伤组[6]HuangLC,WLChenandBLHuangTissueculture织。不同外植体诱导其愈伤组织的培养基也不同,investigationsofbamboo.Ó.Amethodforviableprotoplastsiso-种子与小穗的最适培养基分别是3/4MS+(3~5lationfromBambusacellsofliquidsuspentionculture[J].Bot.mg/L)2,4-D+013mg/LKT、MS+3mg/L2,4-Bul.lAcadmiaSinca,1989(30):49-57.D+013mg/LKT,其愈伤组织诱导率达100%[7]HuangLC,WLChenandBLHuangTissueculture(除去受污染及死亡的外植体),说明2,4-D是比investigationsofbamboo.Ô.Organogenesisleadingtoadvent-itiousshootsandplantsinexcisedshootapices.Invironmentaland较适合巨龙竹诱导愈伤组织的生长调节剂。Experimental[J].Botany,1989(29):307-315.(2)温度对愈伤组织的诱导有明显的影响。[8]WoodySH,GCPhilips,JEWoodsandGBCollinsSo-在低温条件下,诱导率低,生长较慢;高温下,诱maticembryogenesisandplantregenerationfromzygoticembryo导率较高,生长快。但高温下培养比低温下培养的explantinMexicaweepingbambooOtateaacuminataaztecorum褐化程度明显高,这是由于引起褐化的多酚氧化酶[J].PlantCellReports,1992(11):257-261.的活性在高温时较高有关。[9]RoutGR.DasP.Somaticemvryogenensisandinvitro(3)光照也是影响巨龙竹愈伤组织诱导的一floweringof3speciesofbamboo[J].PlantCellReports,1994, 第4期耿树香等:巨龙竹种子、小穗外植体愈伤组织的诱导培养13(12):683-686.[J].竹子研究汇刊,1991,10(4):79-80.[10]Nadgauda,RS,VAParasharamiandAFMascrenhas[14]张光楚,王裕霞.麻竹离体快速繁殖技术的研究Precociusfloweringandseedingbehaviurintissueculturedbam-[J].竹子研究汇刊,1993,12(4):8-15.boo[J].Nature,1990(31):29-34.[15]陈锐亮,杨振德.壮绿竹茎段培养的初步研究[11]AnesA,ela.lEmbryogenesisandplantdevelopment[J].广西热科技,1999,72(3):20-21.inthebambooFhyllostockysviridis(Young)McClure[J].Plant[16]余朝秀,关文灵.野百合组织培养的研究[J].西部celltissueorganculture,1987,10(1):73-77.林业科学,2005,34(2):76-78.[12]ChambersSM,ela.lMicropropagationandinvitro[17]杨玉珍,雷呈,孙天洲,等.文心兰组织培养基激floweringofthebambooDendrocdamushamiltoniiMunro.Plant素选择及组培苗的移植管理技术[J].西部林业科学,2004,cell[J].TissueandOrganCulture,1991(27):45-48.33(1):55-58.[13]阙国宁,诸葛强.竹子愈伤组织培养与植株再生[上接第60页]参考文献:[4]赵西宁,吴发启.土壤水分入渗的研究进展和评述[J].西北林学院学报,2004,19(1):42-45.[1]张建平,刘淑珍.金沙江干热河谷区攀枝花市土地[5]解文艳,樊贵盛.土壤结构对土壤入渗能力的影响退化初探[J].中国沙漠,1998,18(2):149-153.[J].太原理工大学学报,2004,35(4):381-384.[2]郑科,郎南军,郭玉红,等.元谋干热河谷降雨、温[6]何毓蓉,黄成敏,宫阿都,等.金沙江干热河谷典型度、蒸发量的监测分析[J].西部林业科学,2005,34(3):57-区(云南)土壤退化机理研究)母质特性对土壤退化的影响62.[J].西南农业学报,2001(14):9-13.[3]叶仲节,柴锡周.浙江林业[M].杭州:浙江科学技[7]赵琳,郎南军,温绍龙,等.云南干热河谷4种植术出版社,1980.物抗旱机理的研究[J].西部林业科学,2006,35(2):9-16.