钝顶螺旋藻耐盐相关基因启动子区域的结构与功能分析

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1、万方数据论文题目：鲤亟螺旋蘧耐垫担差基因启动王区域的结构皇功能盆板答辩委员会主席：虫型院j匕立基因组硒塞压翅松生数援答辩委员会委员：虫型院j匕京微生物盟宜逝田主渲塾握遇趔医型太堂附属筮二医院挞囱阳数拯遏州医型太堂附属箍二医陵王明出塾拯湿划医抖太堂奎劲松麴援万方数据温州医科大学硕士学位论文目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1Abstract⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．6一材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯81材

2、料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．82方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1O二结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．191RuBisCO基因启动子序列的预测结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯192成功构建pMDl8-pro：：gfp重组质粒⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一194步移缺失突变引物的结果示意图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．215成功构建步移缺失突变质粒⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．226各缺失突变体GFP的荧光检测结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．237RuBisCO基因核心启动子区结构⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯258定点突

3、变分析．35区六核苷酸(TTGACT)的精确位置⋯⋯．25三分析与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．27一J、结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．31参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯33附录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．35致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．36综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．37学位论文独创性声明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯48㈣9mⅢm4I呲4Ⅲ眦Ⅲ眦●I㈣9眦6㈣2眦Y万方数

4、据温州医科大学硕士学位论文钝顶螺旋藻耐盐相关基因启动子区域的结构与功能分析中文摘要目的螺旋藻(Spirulina)是一类进化历史悠久、含叶绿素a(但不形成叶绿体)、能进行产氧性光合作用的大型原核生物。其抗逆性强，在热泉、盐水湖及其他恶劣环境中，是唯一或主要的光养生物；螺旋藻已被广泛应用于基础研究，如光合作用、细胞分化与氮的固定、碳源与氮源的利用、抗环境胁迫以及分子进化等领域。本课题通过研究螺旋藻耐盐碱基因启动子的结构及与调控基因功能的关系，揭示螺旋藻耐盐碱的分子机理。鉴定螺旋藻抗逆相关基因，可为植物基因工程育种提供新的功能基因，也为培育抗逆性增强的螺旋藻新品种、挖掘其他藻类抗逆功能相

5、关基因奠定基础，具有重要的科学意义，将产生一定的社会效益。方法1设计引物，提取螺旋藻总DNA，通过PCR方法扩增钝顶螺旋藻RuBisCO基因5’端上游启动子区域199bp的片段(pro)；设计扩增绿色荧光蛋白(GFP)基因引物，以携带GFP基因的质粒为模1板扩增GFP基因；以RuBisCO基因启动子区域片段和绿色荧光蛋白基因(咖)片段为模板，通过重组PCR技术，得到含启动子区域和GFP基因的DNA片段。2重组PCR产物与pMDl8．T载体相连接。连接产物转化入感受态大肠杆菌JMl09。限制性核酸内切酶酶切鉴定重组克隆片段，最后测序验证目的基因。3检测不同盐浓度下pMDl8-pro：：

6、gfp／E．coBJMl09转化子的荧光强度。4利用生物信息学方法对这一启动子区域中可能存在的转录起始位点进行预测，使用步移缺失设计引物以获得10段长度不等的pro-gfp片段，再克隆入pMDl8．T载体并导入感受态大肠杆菌JMl09。5培养并观察各突变个体中的绿色荧光蛋白表达情况。6定点突变分析．35区六核苷酸(TTGACT)的精确位置。结果1螺旋藻耐盐相关基因启动子PCR产物的片段大小为199bp，GFP基因PCR产物的片段大小为717bp，重组PCR的片段大小为916bp，与预期的结果吻合。万方数据温州医科大学硕士学位论文2重组PCR产物和pMD．18T载体成功连接，并成功转化

7、入感受态大肠杆菌JMl09，经双酶切鉴定和测序鉴定，序列正确无误。3实验结果显示LB液体培养基含0．2M、0．4M、0．6M和0．8MNaCl条件下，pMDl8-pro：：gfp／E．coliJMl09转化子GFP的荧光水平均高于正常培养条件对照组(0．02MNaCI)，表明该启动子可以被高浓度的盐所诱导。4PCR扩增得到了上述重组产物的10条步移缺失片段，成功构建10个缺失突变表达质粒并转化入感受态大肠杆菌JMl09。5突变体1-9均能发出绿色荧光，而突