我国新城疫强毒的分子特征及其快速检测技术的研究与应用

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1、分类号密级UDC单位代码10435硕士学位论文我国新城疫强毒的分子特征及其快速检测技术的研究与应用MolecularCharacteristicsandRapidDiagnositicTechnologyofVirulentNDVinChina研究生姓名罗瑶瑶指导教师单虎教授刘华雷研究员张乐萃教授学科专业预防兽医学研究方向动物传染病防治与生物制品学中国.青岛2018年6月MolecularCharacteristicsandRapidDiagnositicTechnologyofVirulentNDVinChinaThesiss

2、ubmittedtoQingdaoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofAgronomyLuoYaoyao（CollegeofVeterinaryMedicine）Supervisor：Prof.ShanHuRes.LiuHualeiProf.ZhangLecuiQingdao,ChinaJune,2018独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢

3、的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得青岛农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：年月日关于论文使用授权的说明本人完全了解青岛农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意青岛农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议

4、)研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日青岛农业大学硕士学位论文摘要我国新城疫强毒的分子特征及其快速检测技术的研究与应用摘要新城疫（Newcastledisease,ND）是由新城疫病毒（Newcastlediseasevirus,NDV）强毒引起的一种禽的急性、高度接触性传染病。ND传播迅速，死亡率高，给养禽业造成巨大的经济损失。因此，有必要针对我国近年来流行的新城疫病毒进行基因组扩增和遗传进化分析，在深入分析其分子特征的基础上建立一种快速、灵敏、高效的特异性诊断和检测方法。为分析近年来我国新城疫强毒的感染情况，自20

5、14-2017年在国内部分地区开展了新城疫监测计划，从部分地区活禽市场成功分离到60株新城疫强毒株。根据其分离的时间、地理、宿主分布的差异性选取了15株代表性强毒株，并对病毒的基因组进行了测序和遗传进化分析。15株代表强毒株的基因组长度均为15192bp，基因的排列顺序为1121173’-NP-P-M-F-HN-L-5’。病毒分离株F蛋白裂解位点为R-R-Q（R）-K-R-F，具有新城疫病毒强毒株典型的分子特征。遗传进化分析结果显示15株病毒均属于ClassII，其中10株为VIb亚型，VIIb和VIId亚型各1株，VIIh亚型

6、有3株。表明我国目前流行新城疫病毒的优势基因型以VI和VII型为主，其中在我国鸡群中流行毒株为基因VII型，而VI型是近年来在我国鸽群流行的主要优势基因型。基于新城疫强毒F蛋白裂解位点分子特征设计特异性引物及Taqman探针，建立了一种检测新城疫强毒的一步法实时荧光定量RT-PCR。通过体外转录法制备的cRNA标准品作为阳性模板绘制标准曲线以及临床样品的检测绘制出ROC曲线，完成各项诊断2指标的评价。结果显示：该方法的标准曲线为Y=-3.390X＋38.23，相关系数R为0.9999。灵敏度试验显示，该方法可以检测出模板最低浓度

7、为2copies/uL，比常规RT-PCR高10倍。特异性试验显示该方法具有良好的特异性，与常见禽病病毒无交叉反应。重复性试验的组内和组间的变异系数分别低于1%和1.5%。通过检测1974份临床样品绘制ROC曲线显示，ROC曲线下面积为0.9861，当YoudenIndex为93.12时，cutoff值设为35，诊断的敏感性和特异性分别为94.82%、98.3%，与病毒分离方法的Kappa系数为0.919。以上结果表明，本研究建立的方法敏感性高、特异性强、重复性好、诊断准确性极好，给实验室提供一种快速、实用的检测临床样品的方法。

8、关键词：新城疫病毒；遗传进化分析；荧光定量RT-PCR；诊断方法评价I青岛农业大学硕士学位论文AbstractMolecularCharacteristicsandRapidDiagnositicTechnologyofVirulentNDVinChinaAbs