金银花、红花和槐米的显微量化研究

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金银花、红花和槐米的显微量化研究广州中医药大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是个人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经特别加以注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明并致谢。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。关于学位论文使用授权的声明本人完全了解广州中医药大学有关保留使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门机构送交论文的复印件和电子版，允许被查阅和借阅。本人授权广州中医药大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。(保密论文在解密后应遵守此规定)论一糯产受够 广州中医药大学2014届硕士学位论文摘要目的：(1)利用显微量化法对金银花进行产地区分并对不同类型的掺杂模型进行鉴别；(2)利用显微量化法对红花进行产地区分并对掺杂模型进行鉴别；(3)利用显微量化法对槐米进行产地区分并对不同类型的掺杂模型进行鉴别。方法：药材粉碎，全部过筛后置烘箱烘干至恒重。将琼脂和羟乙基纤维素混合液于95℃水浴加热10min后，加入精确称取的药材粉末。涡旋混匀后，于冰水中冷却固定即完成制样。每一批次药材平行制作3个样品。使用自制的取样器，准确抽取0．02mL样品于载玻片上，滴加水合氯醛试液，盖一卜盖玻片即完成临时装片。每个样品平行制片8片。在载有样品的玻片上均匀选取若干视野(10xlO)，对视野电三种显微挂：'、-_h。，—_，’-，一征物进行计数。采用轮廓分析的统计方法对三利，特征物考察指标进行分析。结果：(1)三批不同产地的金银花的三种考察指标有显著差异，金银花与山银花的三种考察指标也有显著差异，该方法对非植物性和非药用部位的杂质的最低检出限是5％(质量分数。以一卜．同)。(2)三批不同产地的红花三种考察指标有显著差异，该方法对非植物性杂质的最低检出限是7％并检测出未知掺杂量样品其杂质含量在60％--+65％。(3)三批不同产地的槐米三指标有显著差异，槐花与槐米的三种考察指标有显著差异，该方法对非植物性和非药用部位的杂质的最低检出限是5％。、、—一，‘、-_，————————、_／结论：多指标显微量化法能较全面反映金银花、红花和槐花的显微特征，可用于产地的分类和鉴别，也可作为同科不同属药材(金银花与山银花)和不同花期药材(槐米与槐花)的鉴别手段，为提高花类中药材鉴别和质量控制水平奠定基础。关键词：显微量化；多指标；金银花；红花；槐米 金银花、红花和槐米的显微量化研究ThestudyofMicroscopiCQuantitativeMethodofFlosLoniceraeJaponicasFlosSophoraeandFlosCarthamiSpeciaIty：ChineseMateriaMedicaAuthor：RuChenTutor：WenbiaoLuAbsIractObjective(1)microscopicquantitativemethodcanbeusedtoanalysethehabitatofPlosLonfceraeJaponicaeandidentifythedifferenttypesofdopedmodel：(2)microscopicquantitativemethodcanbeusedtoanalysethehabitatofFlosCarthamiandidentifythedifferenttypesofdopedmodel：(3)microscopiCquantitativemethodcanbeusedtoanalysethehabitatofF／OSSophoraeandidentifythedifferenttypesofdopedmodel．MethodsAftersieving，thepowderedmedicinalmaterialSwouldbedriedtoconstantweight．TheAgarandhydroxyethylcellulosemixturewaskeptin95℃waterbathfor10min．Themedicinalmaterialsandtheadjuvantmaterialsweremixedthroughvortexvibration，andthenrefrigeratedintogelsamples．Eachmaterialwasmadeinto3samplesparallelly．0．02mLofeachsamplewasaddedontheslideaccuratelybyself—madesampler．MixChloralhydratetestsolutiondropwisewiththesample，andthencoverglass．Eachsamplewasmadeinto8piecesoftemporaryslideparallelly．Pollengrains，non—glandularhairsandvesselSinthesampleswereobservedandcountedwithamicroscope(10x10)．SPSSStatisticalsoftwarewasusedtoanalysethedata．Results(1)ThethreeindicatorsofFlosLoniceraeJaponicaewhichfromthreedifferentproducingareahadsignificantdifferences，ThethreeindicatorsotFiOSLoniceraeJaponicaeandFlosLoniceraehadsignificantdifference．Theminimumdetectionlimitofimpuritieswas5％bythemethod：(2)ThethreeindicatorsofFiosCarthamiwhichfromthreedifferentproducingareahadsignificantdifferences，，Theminimumdetection1imitofimpuritieswas7％bythemethod．Themethoddetectedthedopingsamplesthatwithamountof 广州中医药大学2014届硕士学位论文impuritiesin60％～65％．(3)ThethreeindicatorsofFlosSophoraewhichfromthreedifferentproducingareahadsignificantdifferences，ThethreeindicatorsofFlosLoniceraeJaponicaeandfloweringFlosLoniceraehadsignificantdifference，Theminimumdetectionlimitofimpuritieswas5％bythemethod．ConclusionThemulti——indexquantizationmethodcancomprehensirelyreflectthesimilaritiesanddifferencesofmicroscopiCcharacteristicsofFlosLoniceraeJaponicae，FlosSophoraeandFlosCarthamifromdifferenthabitats．andwouldbeappliedtotheidentificationandclassificationofhabitatofFlosLonicoraeJaponicae，PlosSophoraeandFlosCarthamiandtheirqualitycontr01Keywords：microscopicquantitative，multi—index，FlosLoniceraeJaponicae,NosSophorae,FtosC0nhamiV 金银花、红花和槐米的显微量化研究目录广州中医药大学学位论文原创性声明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯IlAbstract．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．⋯．．．．．．．．．．．．⋯⋯．．．．．．．．．．III目录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯V引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1第一章文献研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2第二章金银花的显微量化研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯9第一节金银花显微量化方法条件优选⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．10笫二节金银花显微量化方法学考察⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯13第三节金银花显微特征数P(个／mg)的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．15第四节不l一产地的金银花样品的显微量化研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯16第五节显微量化法鉴别金银花与1lI银花⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．18第六节显微量化法鉴别添加一i同类型杂质的余银花⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．20第七节小节与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯29第三章红花的显微量化研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一30第一节红花显微量化方法条件优选⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．31第二节红花显微量化方法学考察⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．34第三节红花显微特征数P(个／rag)的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．36第四1，不同产地的红花样品的显微量化研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．37第血节显微量化法鉴别添加非植物性杂质的红花⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．39第六节显微量化法测定新疆红花中的杂质含量⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．44第七节小节与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯48第三章槐米的显微量化研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯49第一节槐花显微量化方法条件优选⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．50第一节槐米显微量化方法学考察⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯s3第二：1，槐米显微特征数P(个／rag)的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．55第四节彳i同产地的槐米样品的显微量化研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．56第五节显微量化法鉴别槐花与槐米⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．58第六节显微量化法鉴别添力¨卅i同类型杂质的槐米⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．60第七节小节与讨沦⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯69结语⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一70附录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．72V 广州中医药大学2014届硕士学位论文在校期间发表论文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一73致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一74V 金银花、红花和槐米的显微量化研究引言金银花为忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或初开的花，主产于河南、山东，被誉为清热解毒的良药⋯。红花又名黄蓝、刺红花及红花草，为菊科植物红花的干燥花【21。主产于云南、浙江、河南、四川、新疆等地，以河南封丘、延津所产红花为地道产品【31。槐米为豆科植物槐的干燥花蕾，其干燥的花称槐花，具有凉血止血、清热泻火之功效【4】o中药有广泛应用与悠久历史，其质量与疗效有相当密切关系【5】。中药材的基原、产地、采收期、炮制方法、储藏温湿度与中药饮片质量有直接的关系【6】。然而，市面流通的药材品质却参差不齐。其中混伪品、代用品的滥用、各种手段的掺杂、采摘部位未按药典规定进行等现象比较严重，使中药的质董问题首当其冲【7’8】。根据对金银花、红花、槐米粉末显微观察，分别取具有生物学稳定的特性，而且数量众多，易于观察汁数的特征物作为指标。金银花与槐米以花粉粒、非腺毛、导管作为指标，红花以花粉粒、分泌细胞和导管作为指标。利用显微量化法对其进行研究。该法具有仪器易普及、试药易得、操作简便等优点，是一种摔制中药材质量、确保临床用药安全的较好的方法。 广州中医药大学2014届硕士学位论文第一章文献研究中药显微量化法成本较低，操作简便，结果可靠性大，在最近几年己被应用到中成药和珍贵的药材的含量测定。根据应用的参比物的不同，该方法被分成参比物显微定量法和非参比物显微定量法两大部分[1,21。一、参比物显微定量法1916年，英国的牛物学家Wallis用直接计数法测出石松孢子平均含有94000个／mg孢子，因此他以石松孢子为参考标准，创立了石松孢子法(Lycopodiumsporemethod)【3】。它以石松孢子为参比物，测定混合粉末中生药的含量或者生药粉末中掺杂物的含量。该法冈具有操作成本低、简便、快速等优点，先后被应用于多利一生药、香料和食物的粉末纯度鉴定14～1。幽l～研究始丁八十年代，在中药显微鉴定的基础上首创中成药显微定量法。而后，黄素副61、刘训红等学者考虑与石松孢子相似性质的孢子代替石松孢子，他们以海金沙孢子或蒲黄花粉粒代替石松孢子作为参比物，进行了显微定量研究。海金沙孢子较人，适用于较低倍镜(10xlO)下测定女II导管、非腺毛等这类体积较人的显微特征；蒲黄花粉粒适用于较高倍镜(10x40)下测定体积较小的显微特币F，如淀粉粒、花粉粒等[6,71。其一般步骤‘81如下：(1)对参比物的纯化处理将海金沙孢子、蒲黄花粉粒进行水洗后干燥过筛即得。(2)参比物显微特征常数的测定按照Wallls计数法测出海金沙孢子的显微特征常数(平均值)为4500(个／mg)；蒲黄花粉粒显微特征常数(平均值)为270000(个／mg)。(3)实际测定可按下列计算方式求算纯净药材显微特物数量(P)个／mg及成药中该药材的百分含量：定量药材实测显微特征数(ns)×称取参比物重量(W)x4500(或270000)P：一参比物实测显微特征数(n)×被定量药材重(Ws)nsxWx4500(或270000)含量％=nxWsxP参比物显微定量法在实际应用中存在两个缺点‘91：(1)该法在操作过程易产生称量误差：(2)实际操作不可能完全做到被检测药材粉末与参比物混合得绝对均匀。囚此，目前显微定量法多采用非参比物显微定量法。(4)在中成药定量中的研究与应用 金银花、红花和槐米的显微量化研究据文献报道，应用显散定量法己对中成药22个品种21味药材进行了显散定量的研究，取得了初步成果。现将研究概况列表如表1【，1：表1参比物显微定量法的应用研究简表中成药名称定量药材显微特征物显微特征常熟(个／rag)参比物定量标准乌贝散浙贝母淀粉粒133918蒲黄花粉粒左金丸吴茱萸非腺毛549海金沙孢子贝羚散羚羊角碎片5692+91海金沙孢子疏风活络丸马钱子毛肋276．7±7．4海金沙孢子蛇胆川贝散暗紫贝母淀粉粒181038+4323蒲黄花粉粒梭砂贝母淀粉粒251397±4323蒲黄花粉粒二、非参比物显微定量法根据很多中药的某些显微特征物数量较固定，有研究者采用被测药材自身的显微特征物代替参比物创立了非参比物显微定量法。结合现代的统计学方法，可使得该方法检测到的结果更加准确、可靠。但非参比物显微定量法要求被测药材特征物物数量稳定且有特异性。该方法的计算方式：×·VP=——V1·W×·V样品含量％=×100％V1‘W‘PP：每毫克药材所含显微特征物数量(个／rag)x：一片盖玻片下药材的显微特征数(个)V：混悬液的总体积(mL)v，：每片盖玻片下药材的混悬液体积(mL)w：药材称取量(mg)(1)根据不同品种中药的显微特征有明显差别，对药材进行真伪鉴定的应用。如张洪春【加】，尹海波，王婷等学者，以草酸钙簇晶为参比物对老鹳草类药材进行比较鉴别，发现老鹳草9个品种的显微特征常数差别较大。具体应用详见下表2：表2显微定量法鉴别易混淆中药的应用研究简表定量药材显微特征物显微特征常数(个／mg)第一作者9种老鹳草¨叫簇晶人参与西洋参⋯1簇晶槐花及花蕾“川花粉粒2267．4，2263．3，2607．4，1242．9，3639．7，张洪春1062．2，2078．3，836．03267．938+_1．817±0．9张瑜华238869罗文蓉 广州中医药大学2014届硕士学位论文(2)利用中药材的显微特征来找出其与药材的主要成分的相关性的应用。如苑冬敏n5|，刘扬，栾晓静等，利用黄柏石细胞的显微特征常数；同时用HPLC法测定黄柏盐酸小檗碱的含量，分析结果表明，它们之间有极显著的相关性。杨建瑜等学者n棚以牡丹皮药材中的草酸钙簇晶为显微特征物，应用显微定量法检测出每毫克牡丹皮药材的显微特征物，然后用HPLC法对牡丹皮中丹皮酚进行检测，最后对丹皮酚含量和草酸钙簇晶常数作相关性分析。结果表明，牡丹皮中丹皮酚含量与每毫克药材所含草酸钙簇晶个数呈负相关、中相关。梁鹂等n71将测得的槐米粉末中花粉粒的显微特征数值与总黄酮含量进行统计分析。结果显示二者有显著的相关性。陈聪慧，康廷国n踟用显微定量法测得金银花中花粉粒和非腺毛的显微特征数，用HPLC法测得金银花中的绿原酸含量，二者的结果统计分析显示有显著相关性。(3)利用中药材的显微特征定量，测出中成药、民族药和蒙成药中某一药材含量的应用。对于以药材粉末入药且有效成分尚不清楚的中成药定量，显微定量法有着独特的优势n引，依据显微特征常数与百分含量得到标准曲线，如果测得中成药中某药材的显微特征数，就可以求得中成药中该药材的百分含量。如李娜等学者晗01用显微定量法对六味地黄丸中的山茱萸进行研究，以山茱萸中的果皮表皮细胞为显微特征物，测得单味山茱萸药材每毫克显微特征常数，再对六昧地黄丸中的山茱萸进行含量测定，结果让人满意。具体应用如下表3：表3非参比物显微定量法的应用定量药材显微特征物显微特征常数(个／mg)中成药名称天花粉汜1羚羊角他2黄柏旧31人参m1全蝎心j1天麻m1猪牙皂陋i大黄乜刚黄连∞1石细胞40IJ．m以上碎片纤维与石细胞之和簇晶横纹肌纤维木化厚壁细胞石细胞簇晶石细胞14．546176±539．0516．07±O．829．66±0．562．36±1．1661．42±1．3545±14915±25消渴生津胶囊羚羊清肺丸知柏地黄丸兴格各其一满都拉脐风散天麻丸脐风散，惊风散牛黄解毒丸香连丸 金银花、红花和槐米的显微量化研究(4)利用中药材的显微特征定量，判别中药炭药的质量的应用中药材炮制与否，其内部的显微特征具有异同点。采用显微定量法分别检测生品与炮制品的显微特征数，通过比较两组数据可为炮制品的质量标准提供依据。具体应用详见下表4：表4显微定量法判别炭药的应用综上所述，非参比物显微定量法减少了参比物法实验操作中多次称量和混匀程度所造成的误差。而且，数理统计的计算方法使结果更加精确可靠。三、发展趋势与展望(1)发展趋势中药显微定量法的发展趋势是从中药材的单个显微特征指标检测向着多个显微特征指标的综合评价的方向发展，更有以人工主观判定到利用科学数据定点鉴别分析和超级计算机超高速地模拟解决方案及解决问题。近年来，随着显微镜技术的发展(放大的倍数越大与分辨率越高越清晰)，以及计算机系统的完善(CPU的运算能力增强与软件的开发)，借助计算机结合显微镜技术来探究微粒的形态与数量规律也越来越明确。 广州中医药大学2014届硕士学位论文(2)存在的问题与展望中药显微定量是有别于化学方法的一种新的研究路线，开创了中药含量测定新方向，特别是为有效成分尚不清楚的药材的含量测定提供了一种可能的检测方法。但是显微定量操作过程中药材的前处理、稀释剂配方、药粉与辅料混匀方法、取样工具、计算方式、实验人员操作熟练程度、放置时间与温度以及仪器精密度等诸因素均影响实验结果I孙。所以该法应用研究尚属探索阶段，还未被系统地应用于中药鉴定研究中，还需进一步深入研究，如同一商品不同品种药材显微特征常数的研究，同一品种不同产地，或同一品种不同采收期，或不同生长期的显微特征常数的研究等，均有待深入探索和研究i19．391。 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第二章金银花的显微量化研究金银花的性状特征：药材呈棒状，上粗下细，略弯曲。长2～3cm，上部直径约3mm，下部直径约1．5mm。表面黄白色或者绿白色(贮久色渐深)，密被短柔毛。花萼绿色，先端5裂，裂片有毛，长约2mm。花开放后花冠筒状，先端二唇形；雄蕊5枚，附于筒壁，黄色；雌蕊1枚，子房无毛。偶见叶状苞片。气清香，味淡、微苦【7J。金银花的粉末特征：浅黄色。①花粉粒黄色，球形，直径60"-'70um，外壁具细剌状突起，萌发孔3个；②腺毛的头部呈倒圆锥形或呈倒三角形，头部多细胞(10。30个)，腺柄多细胞(2～6个)；③非腺毛为单细胞，一种长而弯曲，壁较薄，有微细疣状突起：另一种短，壁稍厚，具壁疣，有的具单或双螺纹；④薄壁细胞中含有细小草酸钙簇晶，直径6""45I．tm；⑤柱头顶端表皮细胞呈绒毛状f7]。(10xlO放大倍率)非腺毛花粉粒导管图1金银花粉末苫 广州中医药大学2014届硕士学位论文第一节金银花显微量化方法条件优选一、实验材料所购得的金银花和山银花样品，均经过广州中医药大学中药学院中药鉴定教研室黄海波副教授鉴定为正品药材。样品来源情况见表1。表1金银花和山银花来源情况二、试剂与仪器实验所用试剂与仪器见表2与表3。表2实验的试剂仪器名称仪器型号生产公司三、正交实验在显微测试样品的制备过程中，影响本实验显微定量常数的因素主要有药材称取量(mg)、药材粉碎粒度(目)以及琼脂浓度(g／mL)。根据预试结果，各设3个水平，详见表4。表4．因素水平表 金银花、红花和槐米的显微量化研究本实验以显微特征物花粉粒数目的相对标准偏差(RSD)为考察指标，采用正交设计试验法考察显微定量的优化条件。(一)实验方法1．样品的制备取山东产金银花3份，粉碎后分别过80目、100目、120目筛(每一份都全部过筛)。将药材粉末置烘箱恒温烘干全恒重后，-丁．干燥器保存。取19羟乙基纤维素隅J用热水溶解后冷却超声除去气泡最后用蒸馏水定容至lOOmL。精密称取琼脂粉加入lOml纤维素水溶液，于95"C水浴加热lOmin(30"(7室温)。精密称取金银花药材粉末于5mlEP管，加入上述羟乙基纤维素琼脂混合液约4ml。将EP管于涡旋仪上混匀，使药材在辅料中分布均匀，静止片刻使涡旋产生的气泡上浮到表面后，迅速浸入冰水使其冷却固定。整个制备的时间不宜过久，要使样品在浸入冷水前是流动性较好的状态，确保辅料能均匀分散药粉。每批药材样品平行制备3份测试样品。2．临时装片的制备使用改装后气相进样器(见附录图1)取样，它的开u于管身’卜．方，直径为1．5毫米，通过活塞前端的橡皮塞。口J．完全将样品推出进样器，再配合使用解剖针：降样品转移到载玻片上(置于装有70℃热水的铁盒子上)。滴加水合氯醛试液辅以解剖针将样品在载玻片上铺展开，盖上盖玻片，临时装片就制备好了。装片应无外溢，无气泡。所用盖玻片规格一致。每个测试样品平行制片8张。3．显微计数在载有金银花粉末的玻片上均匀选取若干视野(10xlO放大倍率)，对视野中的花粉粒进行计数，花粉粒以结构完整的为计数目标物。每片计一个总数值，每个样品以8张片的计算值计算RSD％。(二)金银花正交实验结果根据因素水平表制备9份样品，并制片计数，结果如表5。表5．金银花药材正交设计实验的结果 广州中医药大学2014届硕士学位论文从表5的数据可看出，各因素水平K1，K2，K3的比较，KAI>KA2>KA3，KBI>KB3>KB2，Kcl>Kc3>Kc2，故初步可得出该方案的优化条件为：药材称取量150mg，粉碎过100口筛，琼脂基底浓度为1．25％。(三)正交设计验证实验根据正交优化条件：药材称取量150mg，粉碎过100目筛，琼脂基底浓度为1．25％，平行制样3份，每份制各8片临时片。于每一片上取相同个数的均匀视野，对视野内的金银花花粉粒进行计数。计算每片的总值和每份样品的RSD％。结果见表6。表6正交设计验证实验验证结果中，3份样品的平均值较接近，RSD％都在10％以内，正交试样结果的精密度较理想，对金银花的显微量化研究可按照正交实验得出的优化结果进行操作。 金银花、红花和槐米的显微量化研究第二节金银花显微量化方法学考察一、线性范围考察分别精密称取90mg，1lOmg，130mg，150mg，170mgLIJ东产金银花100目粉末共5份，按正文实验方法每份制片8片，观察并计量花粉粒数目。以药材重量(g)为横坐标，花粉粒个数为纵坐标，计算回归方程，绘制标准曲线。结果见图2。图2金银花粉末取样量与花粉粒数目线性关系图结果说明金银花粉末取样量在90“170rag之间，与其花粉粒数目呈良好的线性关系。二、准确度考察(回收率)取药材与槐花药材粉末(过100目筛，烘干至恒重)适量混匀，配成金银花重量占73％，86％，100％含量的样品，按照实验设计优选方案进行花粉粒观察与计数，并与线性范围考察中标准曲线的计算值进行比较。结果见表7。表7．金银花药材显微定量法准确度考察结果准确度考察实验的回收率：97．08％，97．52％，97．89％，|旦I收率的RSD=O．42％。三、重复性考察取山东产金银花药材粉末3份，按照正交实验优选方案进行实验，各平行制片8张，观察花粉粒并计数，测定结果见表8。表8金银花药材显微定量法重复性考察结果 广州中医药大学2014届硕士学位论文三份样品的实验结果：i=216，RSD：O．80％。四、中间精密度考察取山东产金银花药材粉末3份，按照『F交实验优选方案由3名实验室实习生利用不同仪器进行实验，每份样品平行制片8张，观察花粉粒并计数，测定结果见表9。表9金银花药材显微定量法中间精密度考察结果三份样品的实验结果：i=226，五、测定时间对实验结果的影响取山东产金银花药材粉末1份，RSD：4．00％。按照正交实验优选方案进行实验，平行制片8张，间隔8小时观察一次花粉粒并计数，共3次，测定结果见表10。表10金银花药材显微定量法在不同时间观察的结果三次实验结果：i=222，RSD％：4．93％。则临时片在16小时内计数，其花粉粒数目无明显变化。14 金银花、红花和槐米的显微量化研究第三节金银花显微特征数P(个／mg)的测定一、求样品中药材粉末的质量分数q取19羟乙基纤维素用热水溶解后冷却超声除去气泡最后用蒸馏水定容至lOOrnL。精密称取0．259琼脂粉加入lOml羟乙基纤维素水溶液，称量其质量M1后于9S℃水浴加热lOmin(30。C室温)。精密称取150rag金银花粉末药粉于5mlEP管，加入上述羟乙基纤维素琼脂混合液约4ml。待琼脂羟乙基纤维素混合液冷却至室温后再称量质量M：。所用琼脂羟乙基纤维素混合液的质量为M广Mz。则样品中药材粉末的质量分数q=1501150+(M1一M2)。二、求样品的平均密度p(mg·gL‘1)采用取样器从装有制成的样品EP管的上、中、下三个位置分别取20pL样品，精密称量其质量，求算出该样品的平均密度P(mg·gL。1)。三、求每个样品供测试的药材粉末质量W(mg)和显微特征数P(个／mg)的测定利用剩余样品制8片临时片，在载有样品的玻片上均匀选取若干视野(10xlO放大倍率)，对视野中的花粉粒、非腺毛和导管分别进行计数。花粉粒以结构完整的为计数目标物，非腺毛以尖头为计数目标物，导管以50pm及以上的长度为计数目标物。盖玻片面积与所测视野面积之比计作R，本实验R=3．3333。分别将8片的花粉粒、非腺毛和导管总数按以下计算方法得出P(个／mg)。形=矿×P×g：尸=万A×Rw一每个样品(8片临时装片，下同)供测试的药材粉末质量(mg)，P一每毫克药材中显微粒子的个数(个／mg)，V一每个样品取样体积(1aL)，P一样品密度(mg·此。1)，q一样品中药材粉末的质量分数，A一每个样品所测视野面积中显微粒子的计数值(个)，R一盖玻片面积与所测视野面积之比。 广州中医药大学2014届硕士学位论文第四节不同产地的金银花样品的显微量化研究一、不同产地金银花三指标的测定取150mg，100目山东、河南和广西三个产地的金银花药材粉末按上述实验方法进行实验，每个产地的样品平行制3个样品，每个样品平行制8片临时片。测定并计算每份样品所用琼脂羟乙基纤维素混合液的质量和样品平均密度，最后求算出每个样品(8片临时装片，下同)供测试的药材粉末质量W(mg)。结果见表11。表11三个产地的金银花药材供测试的粉末质量W(rag)将不同产地样品的花粉粒、非腺毛和导管计数值A代入式子算出P(个／mg)及P的RSD％。结果见表12。表12不同产地金银花P(个／mg)值注：A的单位为个，P的单位为个／mg二、不同产地金银花三指标的统计分析使用SPSSl7．0软件，对不同产地金银花样品的花粉粒、非腺毛和导管P(个／mg)做轮廓分析Ⅲ。三个产地金银花三个指标均数变化趋势图如图3。 金银花、红花和槐米的显微量化研究图3不同产地金银花的三指标均数变化趋势图统计分析结果：三个产地趋势图的平行分析P=O．000，重合分析P=O．017，即三个产地的金银花样品有显著差异。 广州中医药大学2014届硕士学位论文第五节显微量化法鉴别金银花与山银花一、金银花与山银花三指标的测定各取3份150mg，100目广西产山银花粉末，以1．25％浓度的琼脂纤维素混合液为分散液按照上述正文实验方法制成样品。每份样品平行制片8片。测定并计算每份样品所用琼脂羟乙基纤维素混合液的质量和样品平均密度，最后求算出每个样品(8片临时装片，下同)供测试的药材粉末质量(mg)。结果见表13。表13山银花供测试的药材粉末质量W(mg)将山银花样品的花粉粒、非腺毛和导管计数值A代入式子算出P(J卜／mg)及P的RSD％。结果见表14。表14山银花的P(个／呕)值注：Am单位为个。P的单位为个／mg。二、金银花与山银花三指标的统计分析使用SPSSl7．0软件，将三个不同省份共9份金银花样品和3份广西产山银花样品的花粉粒、非腺毛和导管P(个／mg)做轮廓分析。它们的三个指标均数变化趋势图如图4。 金银花、红花和槐米的显微量化研究图4金银花与山银花三个指标均数变化趋势图统计分析结果：三个产地趋势图的平行分析P=O．000，重合分析P=O．006，即金银花样品与山银花样品有显著差异。 广州中医药大学2014届硕士学位论文第六节显微量化法鉴别添加不同类型杂质的金银花一、显微量化法鉴别添加非植物性杂质(玻璃粉)的金银花(一)添加玻璃粉的山东产金银花的显微量化研究1．将玻璃粉过180目筛，烘干置恒重，并将其与100目山东产金银花粉末混合，配置成玻璃粉杂质含量分别是3％、S％和7％的混合粉末。每份混合粉末精密称取150mg样品按上述正文实验方法进行测定。每份混合粉末平行制样3份，每份制片8片。测定并计算每份样品所用琼脂羟乙基纤维素混合液的质量和样品平均密度，最后求算出每个样品供测试的药材粉末质量W(mg)。结果见表15。表15三个不同玻璃粉掺杂量的金银花样品供测试的粉末质量W(mg)2．将不同玻璃粉含量的混合粉末的花粉粒、非腺毛和导管计数值A代入式子算出P(J卜／mg)及P的RSD％。结果见表16。表16含3％、596jTc7s玻璃粉的槐米P(个／mg)值注：Am单位为个，P的单位为个／mg。20 金铝花、红花和槐米的显微量化研究3．使用SPSSl7．0软件，将三个不同玻璃粉含量金银花样品和不掺杂的金银花样品的花粉粒、非腺毛和导管P(个／mg)分别做轮廓分析。它们的三个指标均数变化趋势图如图5，图6，图7。图53％玻璃粉含量金银花和不掺杂的金银花三个指标均数变化趋势图图65％玻璃粉含量金银花和不掺杂的金银花三个指标均数变化趋势图 广州中医药大学2014届硕士学位论文个图77j‘玻璃粉含量金银花和不掺杂的金银花三个指标均数变化趋势图统计分析结果：含3％玻璃粉的金银花样品与不掺杂金银花样品平行分析P=O．395，重合分析P=O．082，即含3％玻璃粉的金银花样品与不掺杂金银花样品没有显著差异。含5％玻璃粉的金银花样品与不掺杂金银花样品平行分析P=O．098，重合分析P=O．017，即含5％玻璃粉的金银花样品与不掺杂金银花样品有显著差异。含7％玻璃粉的金银花样品与不掺杂金银花样品平行分析P=O．008，重合分析P=O．001，即含7％玻璃粉的金银花样品与不掺杂金银花样品有显著差异。故显微量化法对金银花中添加的非植物性杂质的最低检出限是5％。(二)采用广西和河南产金银花验证杂质最低检出限1．分别取广西和河南产金银花粉末和玻璃粉粉末配置成玻璃粉含量为5％的混合粉末。每份混合粉末精密称取1SOmg样品按上述正文实验方法进行测定。每份混合粉末平行制样3份，每份制片8片。测定并计算每份样品所用琼脂羟乙基纤维素混合液的质量和样品平均密度，最后求算出每个样品供测试的药材粉末质量W(mg)。见表17。表17三个不同玻璃粉掺杂量的金银花样品供测试的粉末质量W(rag) 金锶花、红花和拽涞的显微童化研究2．将不同产地的5％玻璃粉含量的混合粉末的花粉粒、非腺毛和导管计数值A代入式子算出P(个／mg)及P的RSD96。结果见表18。表18含3％、5％和7％玻璃粉的金银花P(个／唱)值注：A的单位为个，P的单位为个／Ⅲg。3、使用SPSSl7．0软件，将不同产地的5％玻璃粉含量的金银花样品分别对应和不掺杂的金银花样品的花粉粒、非腺毛和导管P(+／rag)分别做轮廓分析。它们的三个指标均数变化趋势图如图8，图9。图85％玻璃粉含量的广西金银花与广西金银花三个指标均数变化趋势图 广州中医药大学2014届硕士学位论文图95％玻璃粉含量的河南金银花与河南金银花三个指标均数变化趋势图统计分析结果：含5％玻璃粉的广西金银花样品与不掺杂广西金银花样品平行分P=O．170，重合分析P=O．015，即含5％玻璃粉的广西金银花样品与不掺杂广西金银花样品有显著差异。含5％玻璃粉的河南金银花样品与不掺杂河南金银花样品平行分析P=O．281，重合分析P=O．010，即含5％玻璃粉的河南金银花样品与不掺杂河南金银花样品有显著差异。故显微量化法对金银花中添加的非植物性杂质的最低检出限是5％。一、显微量化法鉴别添加非药用部位杂质(忍冬枝叶)的山东产金银花(一)显微量化法鉴别添加忍冬枝叶的金银花1．取金银花枝叶粉碎、过100目筛，烘干置恒重，并将其与100目山东产金银花粉末混合，配置成枝叶杂质含量分别是3％、5％和7％的混合粉末。每份混合粉末精密称取150mg样品按上述正文实验方法进行测定。每份混合粉末平行制样3份，每份制片8片。测定并计算每份样品所用琼脂羟乙基纤维素混合液的质量和样品平均密度，最后求算出每个样品供测试的药材粉末质量W(rag)。结果见表19。表19三个不同枝叶掺杂量的金银花样品供测试的粉末质量W(呕) 金银花、红花和槐米的显微量化研究2．将不同枝叶含量的混合粉末的花粉粒、非腺毛和导管计数值A代入式子算出P(个／mg)及P的RS蹦。结果见表20。表20含3％、5％和7％枝叶的金银花P("／'／rag)值注：A的单位为个，P的单位为个／mg。3．使用SPSSl7．0软件，将三个不同枝叶含量金银花样品和不掺杂的金银花样品的花粉粒、非腺毛和导管P(个／mg)分别做轮廓分析。它们的三个指标均数变化趋势图如图10，图1l，图12。图103％枝叶含量金银花和不掺杂的金银花三个指标均数变化趋势图25 广州中医药大学2014届硕士学位论文图115％枝叶含量金银花和不掺杂的金银花三个指标均数变化趋势图图127％枝叶含量金银花和不掺杂的金银花三个指标均数变化趋势图统计分析结果：含3％枝叶的金银花样品与不掺杂金银花样品平行分析P=O．411，重合分析P=O．411，即含3％枝叶的金银花样品与不掺杂金银花样品没有显著差异。含5％枝叶的金银花样品与不掺杂金银花样品平行分析P=O．086，重合分析P=O．002，即含5％枝叶的金银花样品与不掺杂金银花样品有显著差异。含7％枝叶的金银花样品 金银花、红花和槐米的里微量化研究与不掺杂金银花样品平行分析P=O．081，重合分析P=O．015，即含7％枝叶的金银花样品与不掺杂金银花样品有显著差异。故金银花掺杂枝叶超过5％时即可被检测出。(二)利用掺杂枝叶的河南、广西产金银花验证显微量化法的最低检出限1．分别取河南和广西产金银花粉末和金银花枝叶粉末配置成枝叶杂质含量分别是s％的混合粉末。每份混合粉末精密称取1SOmg样品按上述正文实验方法进行测定。每份混合粉末平行制样3份，每份制片8片。测定并计算每份样品所用琼脂羟乙基纤维素混合液的质量和样品平均密度，最后求算出每个样品供测试的药材粉末质量W(mg)。见表21表21三个不同枝叶掺杂量的金银花样品供测试的粉末质量W(嘿)2．将不同产地的5％枝叶含量的混合粉末的花粉粒、非腺毛和导管计数值h代入式子算出P(个／mg)及P的RSD％。结果见表22。表22含5％枝叶不同产地的金银花P(Ji"／mg)值注：A的单位为个，P的单位为个／mg。3．使用SPSSl7．0软件，将不同产地的5％枝叶含量的金银花样品分别对应和不掺杂的金银花样品的花粉粒、非腺毛和导管P(个／mg)分别做轮廓分析。它们的三个指标均数变化趋势图如图13，图14。27 广州中医药大学2014届硕士学位论文图135％枝叶含量河南金银花和不掺杂的河南金银花三个指标均数变化趋势图图145％枝叶含量广西金银花和不掺杂的广西金银花三个指标均数变化趋势图统计分析结果：含5％枝叶的河南金银花样品与不掺杂河南金银花样品平行分P--O．780，重合分析P=O．020，即含5％枝叶的河南金银花样品与不掺杂河南金银花样品有显著差异。含5％枝叶的广西金银花样品与不掺杂广西金银花样品平行分析P=O．140，重合分析P=O．026，即含5％枝叶的广西金银花样品与不掺杂广西金银花样品有显著差异。故显微量化法对金银花中添加的植物性杂质的最低检出限是5％。 金银花、红花和槐米的显微量化研究第七节小节与讨论l本文通过预实验，选定金银花的花粉粒、非腺毛以及导管作为指标，这三个特征物形态特异，便于观察并与其他特征物区别开来，它们的数量在金银花显微量化研究最优取样量150毫克的情况下，计数的数值也在较适宜的范围内。因此，花粉粒、非腺毛以及导管可作为金银花显微量化研究的定量指标。2忍冬科植物的花蕾或带初开放的花多含绿原酸。所以本实验探讨的显微量化法为金银花与山银花的质量控制提供了一种有别于化学方法的新道路。3产地因素对中药饮片的质量有极大的关系，本实验探讨了不同产地金银花在显微特征上的差异点，为金银花药材质量控制提供依据。4本实验探讨了两种不同类型杂质添加到金银花药材中时，显微量化方法对杂质的最低检出限，为鉴别金银花药材掺杂与否提供手段。 广州中医药大学2014届硕士学位论文第三章红花的显微量化研究红花的性状特征：红花为不带子房的管状花，长1---,2cm；表面红黄色或红色：柱头长圆柱形，顶端微分叉；花冠筒细长，先端5裂，裂片呈狭条形，长5～8cm；雄蕊5枚，花药聚合成筒状，黄白色；质柔软；气微香，味微苦。红花的粉末特征：橙红色。①花粉粒球形、橄榄形或椭圆形，直径约60pm，外壁具疣状雕纹及短刺，萌发孔3个；②花各部均有呈长管道状分泌细胞，细胞内充满淡黄色至红棕色物，分泌细胞直径5,--,66pm；③花瓣顶端表皮细胞分化成乳头状绒毛：④柱头表皮细胞分化成圆锥形末端较尖的单细胞毛[101。—一‘(10xlO放大倍率)矽。／花粉粒分泌细胞导管图15红花粉末 金银花、红花和槐米的显微量化研究第一节红花显微量化方法条件优选一、实验材料所购得的红花样品，均经过广州中医药大学中药学院中药鉴定教研室黄海波副教授鉴定为正品药材。样品来源情况见表23。表23金银花和山银花来源情况二、试剂与仪器实验所用试剂与仪器见表23与表24。表23实验的试剂表24实验的仪器三、正交实验在显微测试样品的制备过程中，影响本实验显微定量常数的因素主要有药材称取量(mg)、药材粉碎粒度(目)以及琼脂浓度(g／m1)各3个水平，详见表25。表25因素水平表 广州中医药大学2014届硕士学位论文本实验以显微特征物花粉粒数目的相对标准偏差(RSD)为考察指标，采用正交设计试验法考察显微定量的优化条件。(一)实验方法1．样品的制备取四川产红花3份，粉碎后分别过80目、100目、120目筛(每一份都全部过筛)。将药材粉末置烘箱恒温烘干至恒重后，于干燥器保存。取19羟乙基纤维素用热水溶解后冷却超声除去气泡最后用蒸馏水定容至lOOml．。按因素水平表精密称取琼脂粉加入lOml纤维素水溶液，于95*(2水浴加热lOmin(30℃室温)。按因素水平表精密称取红花花粉末药粉于5mlEP管，加入上述羟乙基纤维素琼脂混合液约4ml。将EP管十涡旋仪上混匀，使药材在辅料中分布均匀，静止片刻使涡旋产生的气泡上浮到表面后，迅速浸入冰水使其冷却固定。整个制备的时间不宜过久，要使样品在浸入冷水前是流动性较好的状态，确保辅料能均匀分散药粉。每批药材样品平行制备3份测试样品。2．临时装片的制备使用改装后气相进样器(见附录图1)取样，它的开口于管身下方，直径为1．5毫米，通过活塞前端的橡皮塞可完全将样品推出进样器，再配合使用解剖针将样品转移到载玻片上(置于装有70。C热水的铁盒子上)。滴加水合氯醛试液辅以解剖针将样品在载玻片上铺展开，盖上盖玻片，临时装片就制备好了。装片应无外溢，无气泡。所用盖玻片规格一致。每份样品平行制片8张。3．显微计数在载有红花粉末的玻片上均匀选取若干视野(10x10放大倍率)，对视野一”的花粉粒进行计数，花粉粒以结构完整的为计数目标物。每片计一个总数值，每个样品以8张片的计算值计算RSD％。(二)红花正交实验结果根据因素水平表制备9份样品，并制片计数，结果如表26。表26红花药材正交设计实验的结果 金银花、红花和槐米的显微量化研究从表5的数据可看出，各因素水平K1，K2，K3的比较，KAI>KA2>KA3，KB3>KB2>KBl，Kc3>Kc2>Kcl，故初步可得出该方案的优化条件为：药材称取量105mg，粉碎过80目筛，琼脂基底浓度为0．50％。(二_二)正交设计验证实验根据正交优化条件：药材称取量105mg，粉碎过80目筛，琼脂基底浓度为0．50％，平行制样3份，每份制备8片临时片。于每一片上取相同个数的均匀视野，对视野内的红花花粉粒进行计数。计算每片的总值和每份样品的RSD％。结果见表27。表27正交设计验证实验验证结果中，3份样品的平均值较接近，RSD％较稳定，正交试样结果的精密度较理想，对红花的显微量化研究可按照正交实验得出的优化结果进行操作。 广州中医药大学2014届硕士学位论文线性范围考察第二节红花显微量化方法学考察分别精密称取45mg，65mg，85mg，105mg，125mg四川1红花80目粉末共5份，按正文实验方法每份制片8片，观察并计量花粉粒数目。以药材重量(g)为横坐标，花粉粒个数为纵坐标，计算回归方程，绘制标准曲线。结果说明红花粉末取样量在45“125mg之间，与其花粉粒数目线性关系良好，结果见图16。图16红花粉末取样量与花粉粒数目线性关系图■、准确度考察(回收率)取四川药材与槐花药材粉末(过80目筛，烘干至恒重)适量混匀，配红花重量占60％，80％，100％含量的样品，按照实验设计优选方案进行花粉粒观察与计数，并与线性范围考察中标准曲线的计算值进行比较。结果见表28。表28红花药材显微定量法准确度考察结果准确度考察实验的回收率：103．03％，109．87％，104．61％，回收率的RSD=3．38％。三、重复性考察取四川产红花药材粉末3份，按照正交实验优选方案进行实验，各平行制片8张，观察花粉粒并计数，测定结果见表29。表29红花药材显微定量法重复性考察结果试验号药材称量(mg)2-(个)RSD％ 金银花、红花和槐米的显微量化研究三份样品的实验结果：i=294，RSD：O．90％。四、中间精密度考察取四川红花药材粉末3份，按照正交实验优选方案由3名实验室实习生利用不同仪器进行实验，每份样品平行制片8张，观察花粉粒并计数，测定结果见表30。表30红花药材显微定量法中间精密度考察结果三份样品的实验结果：i=289，RSD=O．599％。五、测定时间对实验结果的影响取四川I红花药材粉末1份，按照正交实验优选方案进行实验，平行制片8张，间隔8小时观察一次花粉粒并计数，共3次，测定结果见表3l。表31红花药材显微定量法在不同时间观察的结果三次实验结果：2-=274，RSD％：2．97％。则临时片在16小时内计数，其花粉粒数目无明显变化。 广州中医药大学2014届硕士学位论文第三节红花显微特征数P(个／mg)的测定一、求样品中药材粉末的质量分数q取19羟乙基纤维素用热水溶解后冷却超声除去气泡最后用蒸馏水定容100mL。精密称取O．109琼脂粉加入10raL羟乙基纤维素水溶液，称量其质量M1后于95℃水浴加热lOmin(30。C室温)。精密称取1SOmg红花粉末药粉于5mlEP管，加入上述羟乙基纤维素琼脂混合液约4ml。待琼脂羟乙基纤维素混合液冷却至室温后再称量质量Mz。所用琼脂羟乙基纤维素混合液的质量为M。一M：。则样品中药材粉末的质量分数q=150／150+(M广M2)：二、求样品的平均密度P(mg·gL。1)采用取样器从装有制成的样品EP管的上、中、下三个位置分别取209L样品，精密称量其质量，求算出该样品的平均密度P(mg·HL。1)。三、求每个样品供测试的药材粉末质量W(mg)和显微特征数P(个／rag)的测定利用剩余样品制8片临时片，在载有样品的玻片上均匀选取若干视野(10x10)，对视野中的花粉粒、分泌细胞和导管分别进行计数。花粉粒以结构完整的为计数目标物，分泌细胞以501．tm及以上的长度为计数目标物，导管以50I-tm及以上的长度为计数目标物。盖玻片面积与所测视野面积之比计作R，R=3．3333。分别将8片的花粉粒、分泌细胞和导管总数按以下计算方法得出P(个／mg)。W：}’×P×g；P：—A—×R∥w一每个样品(8片临时装片，下同)供测试的药材粉末质量(mg)，P一每毫克药材中显微粒子的个数(个／mg)，V一每个样品取样体积(uL)，P一样品密度(mg·pL一1)，q一样品中药材粉末的质量分数，A一每个样品所测视野面积中显微粒子的计数值(个)，R一盖玻片面积与所测视野面积之比。 金银花、红花和槐米的显微量化研究第四节不同产地的红花样品的显微量化研究一、不同产地红花三指标的测定取105mg，80目四川、新疆和河南三个产地的红花药材粉末按上述正文实验方法进行实验，每个产地的样品平行制3个样品，每个样品平行制8片临时片。测定并计算每份样品所用琼脂羟乙基纤维素混合液的质量和样品平均密度，最后求算出每个样品(8片临时装片，下同)供测试的药材粉末质量W(rag)。结果见表32。表32三个产地的红花药材供测试的粉末质量W(rag)将不同产地样品的花粉粒、分泌细胞和导管计数值A代入式子算出P(个／mg)及P的RSD％。结果见表330．表33不同产地红花P(个／mg)值注：A的单位为个，P的单位为个／mg。二、不同产地红花三指标的统计分析使用SPSSl7．0软件，对不同产地红花样品的花粉粒、分泌细胞和导管P(个／mg)做轮廓分析。三个产地红花三个指标均数变化趋势图如图17。37 广州中医药大学2014届硕士学位论文图17三个不同产地红花三个指标均数变化趋势图统计分析结果：三个产地趋势图的平行分析P=O．000，重合分析P=O．001，即三个产地的红花样品有显著差异。 金银花、红花和槐米的显微量化研究第五节显微量化法鉴别添加非植物性杂质的红花一、显微量化法鉴别添加非植物性杂质的最低检出限(一)添加玻璃粉的四川产红花的显微量化研究1．取玻璃粉、过180目筛，烘干置恒重，并将其与80目四川产红花粉末混合，配置成玻璃粉杂质含量分别是3％、5％和7％的混合粉末。每份混合粉末精密称取105mg样品按上述正文实验方法进行测定。每份混合粉末平行制样3份，每份制片8片。测定并计算每份样品所用琼脂羟乙基纤维素混合液的质量和样品平均密度，最后求算出每个样品供测试的药材粉末质量W(mg)。结果见表34。表34三个不同玻璃粉掺杂量的红花样品供测试的粉末质量W(mg)2．将不同玻璃粉含量的混合粉末的花粉粒、分泌细胞和导管计数值A代入式子算出P(／i"／mg)及P的RSD96。结果见表35。表35含5％、7X和10％玻璃粉的红花P(个／mg)值注：A的单位为个，P的单位为个／mg。 广州中医药大学2014届硕士学位论文3．使用SPSSl7．0软件，将三个不同玻璃粉含量红花样品和不掺杂的红花样品的花粉粒、分泌细胞和导管P(个／mg)分别做轮廓分析。它们的三个指标均数变化趋势图如图18，图19，图20。图185％玻璃粉含量红花和不掺杂的红花三个指标均数变化趋势图个图197％玻璃粉含量红花和不掺杂的红花三个指标均数变化趋势图 金银花、红花和槐米的显微量化研究图20109‘玻璃粉含量红花和不掺杂的红花三个指标均数变化趋势图统计分析结果：含5％玻璃粉的红花样品与不掺杂红花样品平行分析P=O．414，重合分析P=O．216，即含5％玻璃粉的红花样品与不掺杂红花样品没有显著差异。含7％玻璃粉的红花样品与不掺杂红花样品平行分析P=O．051，重合分析P=O．000，即含7％玻璃粉的红花样品与不掺杂红花样品有显著差异。含10％玻璃粉的红花样品与不掺杂红花样品平行分析P=O．005，重合分析P=O．000，即含105玻璃粉的红花样品与不掺杂红花样品有显著差异。故显微量化法对红花中添加的非植物性杂质的最低检出限是7％。(二)采用新疆和河南产红花验证杂质最低检出限1．取新疆产和河南产红花粉末分别添加玻璃粉配置成玻璃粉杂质含量分别是7％的混合粉末。每份混合粉末精密称取105mg样品按上述正文实验方法进行测定。每批混合粉末平行制样3份，每份制片8片。测定并计算每份样品所用琼脂羟乙基纤维素混合液的质量和样品平均密度，最后求算出每个样品供测试的药材粉末质量W(mg)。见表36。表36不同产地7％玻璃粉掺杂量的红花样品供测试的粉末质量W(唱)41 广州中医药大学2014届硕士学位论文7％玻璃粉河南3105．05727．31．80％201．01902．935242．将不同产地的7％玻璃粉含量的混合粉末的花粉粒、分泌细胞和导管计数值A代入式子算出P(个／mg)及P的RSD96。结果见表37。表37含7％玻璃粉新疆和7％玻璃粉河南红花P(个／鸭)值注：Am单位为个，P的单位为个／mg。3．使用SPSSl7．0软件，将不同产地的5％玻璃粉含量的红花样品分别对应和不掺杂的红花样品的花粉粒、分泌细胞和导管P(√F／mg)分别做轮廓分析。它们的三个指标均数变化趋势图如图2l，图22。图217％玻璃粉含量新疆红花和不掺杂的新疆红花三个指标均数变化趋势图42 金铝花、红花和槐米的显微量化研究个图227％玻璃粉含量河南红花和不掺杂的河南红花三个指标均数变化趋势图统计分析结果：含7％玻璃粉的新疆红花样品与不掺杂新疆红花样品平行分析P=O．050，重合分析P=O．001，即含7％玻璃粉的新疆红花样品与不掺杂新疆红花样品有显著差异。含7％玻璃粉的河南红花样品与不掺杂河南红花样品平行分P=O．276，重合分析P=O．000，即含7％玻璃粉的河南红花样品与不掺杂河南红花样品有显著差异。结果说明该方法对红花中掺杂玻璃粉的检测最低检出限是7％。43 广州中医药大学2014届硕士学位论文第六节显微量化法测定新疆红花中的杂质含量一、未知杂质含量的新疆红花的检测1．取玻璃粉、过180目筛，烘干置恒重，并将其与含有非植物性杂质(含量未知)的80目新疆红花粉末混合，配置成混合粉末。每份混合粉末精密称取105mg样品按上述正文实验方法进行测定。每批混合粉末平行制样3份，每份制片8片。测定并计算每份样品所用琼脂羟乙基纤维素混合液的质量和样品平均密度，最后求算出每个样品供测试的药材粉末质量w(mg)。结果见表38。表38未知玻璃粉掺杂量的红花样品供测试的粉末质量W(哩)2．将不同玻璃粉含量的混合粉末的花粉粒、分泌细胞和导管计数值A代入式子算出P(个／mg)及P的RSD％。结果见表39。表39含未知含量玻璃粉的红花P(个／呕)值注：A的单位为个，P的单位为个／mg。二、杂质含量60％、65％和7096的新疆红花的三指标检测1．取玻璃粉、过180目筛，烘干置恒重，并将其与80目新疆红花粉末混合，配置成杂质含量60％、65％和70％混合粉末。每份混合粉末精密称取105mg样品按上述正文实验方法进行测定。每份混合粉末平行制样3份，每份制片8片。测定并计算每份样品所用琼脂羟乙基纤维素混合液的质量和样品平均密度，最后求算出每个样品供测试的药材粉末质量W(mg)。结果见表40。表40未知玻璃粉含量的红花样品供测试的粉末质量W(mg) 金银花、红花和槐米的显微量化研究2．将不同玻璃粉含量的混合粉末的花粉粒、分泌细胞和导管计数值A代入式子算出P(个／mg)及P的RSD％。结果见表4l。表41不同玻璃粉含量的的红花P(个／鸭)值注：A的单位为个，P的单位为个／mg。三、将未知杂质含量样品与已知杂质含量样品数据进行统计分析使用SPSSl7．0软件，将未知杂质含量的样品分别与杂质含量60％、65％和70％的样品的的花粉粒、分泌细胞和导管P(-个／mg)分别做轮廓分析。它们的三个指标均数变化趋势图如图23、图24、图25。图236溅玻璃粉含量新疆红花和未知掺杂量新疆红花三个指标均数变化趋势图45 广州中医药大学2014届硕士学位论文图2465％玻璃粉含量新疆红花和未知掺杂量新疆红花三个指标均数变化趋势图图2570％玻璃粉含量新疆红花和未知掺杂量新疆红花三个指标均数变化趋势图统计分析结果：未知掺杂量红花样品与6005玻璃粉含量新疆红花平行分析P=O．396，重合分析P=O．121，即未知掺杂量的红花样品与60％玻璃粉含量新疆红花样品没有显著差异。未知掺杂量的红花样品与65％玻璃粉含量新疆红花平行分析P=O．843，重合分析P=O．656，即未知掺杂量的红花样品与65％玻璃粉含量新疆红花 金银花、红花和槐米的显微量化研究没有显著差异。未知掺杂量的红花样品与70％玻璃粉含量新疆红花平行分析P=O．176，重合分析P=O．038，即x％玻璃粉的红花样品与70％玻璃粉含量新疆红花样品有显著差异。即未知掺杂量的红花样品中含有红花35％"-'40％之间。 广州中医药大学2014届硕士学位论文第七节小节与讨论1本文通过预实验，选定红花的花粉粒、分泌细胞以及导管作为指标，这三个特征物形态特异，便于观察并与其他特征物区别开来，它们的数量在红花显微量化研究最优取样量105毫克的情况下，计数的数值也在较适宜的范围内。因此，花粉粒、分泌细胞以及导管可作为金银花显微量化研究的定量指标。2产地因素对中药饮片的质量有极大的关系，本实验探讨了不同产地红花在显微特征上的差异点，为红花药材质量控制提供依据。3本实验探讨了红花药材中被添加非植物性杂质时显微量化方法对杂质的最低检出限和测定杂质含量，为鉴别红花药材掺杂与否提供手段。 金银花、红花和槐米的显微量化研究第三章槐米的显微量化研究槐花性状：皱缩而卷曲，花瓣多散落，完整者花萼钟状，黄绿色，先端5浅裂；花瓣5，黄色或黄白色，1片较大，近圆形，先端微凹，其余4片长圆形。雄蕊10枚，其中9枚基部联合，花丝细长。雌蕊圆柱形，弯曲。体轻。气微清香，味微苦。槐米性状：呈卵形或椭圆形，似米粒，长2一---6mm，直径约2m。花萼下部有数条纵纹。萼的上方为黄白色未开放的花瓣。花梗细小。体轻，手捻即碎。气微香，味微苦涩。槐花粉末黄绿色，花粉粒类球形或钝三角形，直径14,---,19l-Im，具3个萌发孔。非腺毛多为1个细胞，少为2---3个细胞，长86"--660Pen，，直径7～23岫，壁厚9岫，具不规则角质螺纹，有时壁上可见微小疣状突起。萼片表皮细胞表面观多角形，壁平直或稍弯曲，可见非腺毛及毛脱落痕迹；气孔不定式，副卫细胞4"--'8个。花冠表皮细胞表面观呈类多角形或不规则形，壁稍弯曲，表面有细密弯曲的角质纹理。花粉囊内壁细胞性状不规则，具螺状、网状增厚壁。草酸钙方晶主为不规则长方棱形n妇。见图26。(10xlO放大倍率)花粉粒非腺毛导管图26槐花粉末雹 广州中医药大学2014届硕士学位论文第一节槐花显微量化方法条件优选一、实验材料所购得的槐花样品，均经过广州中医药大学中药学院中药鉴定教研室黄海波副教授鉴定为正品药材。样品来源情况见表42。表42槐米和槐花来源情况二、试剂与仪器实验所用试剂与仪器见表43与表44。表43实验的试剂三、正交实验样品制备过程中，影响本实验显微定量常数的因素主要有药材称取量(mg)、药材粉碎粒度(目)以及琼脂浓度(g／m1)，各3个水平，详见表45。表45因素水平表 金银花、红花和槐米的显微量化研究31501202．00％本实验以显微特征物花粉粒数目的相对标准偏差(RSD)为考察指标，采用正交设计试验法考察显微定量的优化条件。(一)实验方法1．样品的制备取安徽产槐米3份，粉碎后分别过80目、100目、120目筛(每一份都全部过筛)。将药材粉末置烘箱恒温烘干至恒重后，于干燥器保存。取19羟乙基纤维素用热水溶解后冷却超声除去气泡最后用蒸馏水定容至lOOmL。按因素水平表精密称取琼脂粉加入10ral纤维素水溶液，于95。C水浴加热lOmin(30℃室温)。因素水平表精密称取槐米药粉于SmlEP管，加入上述羟乙基纤维素琼脂混合液约4ml。将EP管于涡旋仪上混匀，使药材在辅料中分布均匀，静止片刻使涡旋产生的气泡上浮到表面后，迅速浸入冰水使其冷却固定。整个制备的时间4i宜过久，要使样品在浸入冷水前是流动性较好的状态，确保辅料能均匀分散药粉。一批药材样品平行制各3份样品。2．临时装片的制备使用改装后气相进样器(见图1)取样，它的开Lj于管身’卜．方，直径为1．5毫米，通过活塞前端的橡皮塞‘口J．完全将样品推出进样器，再配合使用解剖针将样品转移到载玻片上(置于装有70℃热水的铁盒子上)。滴加水合氯醛试液辅以解剖针将样品在载玻片上铺展开，盖上盖玻片，临时装片就制备好了。装片应无外溢，无气泡。所用盖玻片规格一致。每个样品平行制片8张。3．显微计数在载有槐米粉末的玻片上均匀选取若干视野(10xlO放大倍率)，对视野中的花粉粒进行计数，花粉粒以结构完整的为计数目标物。每片计一个总数值，每个样品以8张片的计算值计算RSD％。(二)金银花正交实验结果根据因素水平表制备9份样品，并制片计数，结果如表46。表46槐米药材正交设计实验的结果 广州中医药大学2014届硕士学位论文从表5的数据可看出，各因素水jf，K1，K2，K3的比较，KA3>KAI>KA2，KBI>KB2>KB3，Kc3>Kcl>Kc2，故初步可得出该方案的优化条件为：药材称取量100mg，粉碎过120目筛，琼脂基底浓度为1．25％。(三)正交设计验证实验根据正交优化条件：药材称取量100mg，粉碎过120目筛，琼脂基底浓度为1．25％，平行制样3份，每份制备8片临时片。于每一片上取相同个数的均匀视野，对视野内的槐米花粉粒进行计数。计算每片的总值和每份样品的RSD％。结果见表47。表47正交设计验证实验．验证结果中，3份样品的平均值较接近，RSD％都在10％以内，正交试样结果的精密度较理想，对槐米的显微量化研究可按照正交实验得出的优化结果进行操作。 金银花、红花和槐米的显微量化研究第二节槐米显微量化方法学考察一、线性范围考察分别精密称取60mg，80mg，lOOmg，120mg和140mg共5组槐米100目粉末共5份，按正文实验方法每份制片8片，观察并计量花粉粒数目。以药材重量(g)为横坐标，花粉粒个数为纵坐标，计算回归方程，绘制标准曲线。结果说明槐米粉末取样量在90“170mg之间，与其花粉粒数目线性关系良好，结果见图27。图27槐米粉末取样量与花粉粒数目线性关系图■、准确度考察(回收率)取海金沙与槐米药材粉末(过120日筛，烘干至恒重)适量混匀，配成按重量计算槐花占50％，70％，90％含量的样品，按照实验设计优选方案进行花粉粒观察与计算。并与线性范围考察中标准曲线的计算值进行比较。结果见表48。表48槐米药材显微定量法准确度考察结果从表48数据可以看出，实验结果与计算值的显微特征常数较接近，准确度考察实验的回收率分别是：104．58％，104．33％，97．59％，RSD=3．88％。这说明从混合品测出的显微特征常数是准确的。三、重复性考察 广州中医药大学2014届硕士学位论文取安徽产槐米药材粉末3份，按照正交实验优选方案进行实验，各平行制片8张，观察花粉粒并计数，测定结果见表49。表49槐米药材显微定量法重复性考察结果二三份样品的实验结果：万=708，RSD％=I．84％。四、中间精密度考察取安徽产槐米药材粉末3份，按照正交实验优选方案由3名实验室实习生利用不同仪器进行实验，每份样品平行制片8张，观察花粉粒并计数，测定结果见表50。表50槐米药材显微定量法中间精密度考察结果三份样品的实验结果：i=775，RSD％=4．00％。五、测定时间对实验结果的影响取安徽产槐米药材粉末1份，按照正交实验优选方案进行实验，平行制片8张，间隔8小时观察一次花粉粒并计数，共3次，测定结果见表51。表51槐米药材显微定量法在不同时间观察的结果三次实验结果：2=735，RSD％：2．52％。则临时片在16小时内计数，其花粉粒数目无明显变化。 金银花、红花和槐米的显微量化研究第三节槐米显微特征数P(个／mg)的测定一、求样品中药材粉末的质量分数q取19羟乙基纤维素用热水溶解后冷却超声除去气泡最后用蒸馏水定容至lOOmL。精密称取0．259琼脂粉加入lOml羟乙基纤维素水溶液，称量其质量Ml后于95℃水浴lOmin(30℃室温)。精密称取lOOmg槐米粉末药粉于5mlEP管，加入上述羟乙基纤维素琼脂混合液约4ml。待琼脂羟乙基纤维素混合液冷却至室温后再称量质量Mz。所用琼脂羟乙基纤维素混合液的质量为M，一Mz。则样品中药材粉末的质量分数q=150／150+(M1一M2)。二、求样品的平均密度p(mg·此。1)采用取样器从装有制成的样品EP管的上、中、下三个位置分别取209L样品，精密称量其质量，求算出该样品的平均密度P(mg·laL‘1)。三、求每个样品供测试的药材粉末质量W(mg)和显微特征数P(个／mg)的测定利用剩余样品制8片临时片，在载有样品的玻片上均匀选取若干视野(10xlO)，对视野中的花粉粒、非腺毛和导管分别进行计数。花粉粒以结构完整的为计数目标物，非腺毛以尖头为计数目标物，导管以50pm及以上的长度为计数目标物。盖玻片面积与所测视野面积之比计作R，R=3．3333。分别将8片的花粉粒、非腺毛和导管总数按以下计算方法得出P(个／mg)。W=y×p×g：尸=万A×Rw一每个样品(8片临时装片，下同)供测试的药材粉末质量(mg)，P一每毫克药材中显微粒子的个数(个／mg)，V一每个样品取样体积(pL)，P一样品密度(mg·此q)，q一样品中药材粉末的质量分数，A一每个样品所测视野面积中显微粒子的计数值(个)，R一盖玻片面积与所测视野面积之比。 广州中医药大学2014届硕士学位论文第四节不同产地的槐米样品的显微量化研究一、不同产地槐米三指标的测定取lOOmg，120目安徽、河南和河北三个产地的槐米药材粉末按上述正文实验方法进行实验，每个产地的样品平行制3个样品，每个样品平行制8片临时片。测定并计算每份样品所用琼脂羟乙基纤维素混合液的质量和样品平均密度，最后求算出每个样品(8Yr临时装片，下同)供测试的药材粉末质量w(rag)。结果见表52。表52三个产地的槐米药材供测试的粉末质量W(mg)将不同产地样品的花粉粒、非腺毛和导管计数值A代入式子算出P(个／mg)及P的RSD％。结果见表53。表53不同产地槐米P(个／mg)值注：Am单位为个，P的单位为个／mg。二、不同产地槐米三指标的统计分析使用SPSSl7．o$2件，对不同产地槐米样品的花粉粒、非腺毛和导管P(个／mg)做轮廓分析。三个产地槐米三个指标均数变化趋势图如图28。 金银花、红花和槐米的豆微量化研究图28不同产地槐米的三指标均数变化趋势图统计分析结果：三个产地趋势图的平行分析P=O．000，重合分析P=O．000，即三个产地的槐米样品有显著差异。57 广州中医药大学2014届硕士学位论文第五节显微量化法鉴别槐花与槐米份样品所用琼脂羟乙基纤维素混合液的质量和样品平均密度，最后求算出每个样品(8片临时装片，下同)供测试的药材粉末质量(mg)。结果见表54。表54槐花供测试的药材粉末质量W(rag)将槐花样品的花粉粒、非腺毛和导管计数值A代入式子算出P(个／mg)及P的RSD％。结果见表55。表55槐花的P(q'／mg)值注：A的单位为个，P的单位为个／mg。二、槐花与槐米三指标的统计分析使用SPSSl7．0软件，将相同省份的槐花样品和槐米样品的花粉粒、非腺毛和导管P(个／mg)做轮廓分析。它们的三个指标均数变化趋势图如图5。图29槐米与槐花三指标均数变化趋势图 金银花、红花和槐米的显微量化研究统计分析结果：三个产地趋势图的平行分析P=O．001，重合分析P--O．000，即槐花样品与槐米样品有显著差异。‘弓旱苎1菩．≮- 广州中医药大学2014届硕士学位论文第六节显微量化法鉴别添加不同类型杂质的槐米一、显微量化法鉴别添加非植物性杂质(玻璃粉)的槐米(一)添加玻璃粉的安徽产槐米的显微量化研究1．取玻璃粉、过180目筛，烘干置恒重，并将其与120目安徽产槐米粉末混合，配置成玻璃粉杂质含量分别是3％、5％和7％的混合粉末。每份混合粉末精密称取lOOmg样品按上述正文实验方法进行测定。每份混合粉末平行制样3份，每份制片8片。测定并计算每份样品所用琼脂羟乙基纤维素混合液的质量和样品平均密度，最后求算出每个样品供测试的药材粉末质量w(mg)。结果见表56。表56三个不同玻璃粉掺杂量的槐米样品供测试的粉末质量W(mg)2．将不同玻璃粉含量的混合粉末的花粉粒、非腺毛和导管计数值A代入式子算出P(个／rag)及P的RSD％。结果见表57。表57含3％、5％和7％玻璃粉的槐米P(个／mg)值注：A的单位为个，P的单位为个／mg。60 金银花、红花和槐米的显微量化研究3．使用SPSSl7．0软件，将三个不同玻璃粉含量槐米样品和不掺杂的槐米样品的花粉粒、非腺毛和导管P(个／mg)分别做轮廓分析。它们的三个指标均数变化趋势图如图30，图31，图32。图303％曩芝璃粉含量槐米样品和不掺杂的槐米样品三指标均数变化趋势图图315％玻璃粉含量槐米样品和不掺杂的槐米样品三指标均数变化趋势图61 广州中医药大学2014届硕士学位论文图325％玻璃粉含量槐米样品和不掺杂的槐米样品三指标均数变化趋势图统计分析结果：含3％玻璃粉的槐米样品与不掺杂槐米样品平行分析P=O．543，重合分析P=O．837，即含3％玻璃粉的槐米样品与不掺杂槐米样品没有显著差异。含5％玻璃粉的槐米样品与不掺杂槐米样品平行分析P=O．026，重合分析P=O．006，即含5％玻璃粉的槐米样品与不掺杂槐米样品有显著差异。含7％玻璃粉的槐米样品与不掺杂槐米样品平行分析P=O．015，重合分析P=O．003，即含7％玻璃粉的槐米样品与不掺杂槐米样品有显著差异。故显微量化法对槐米中添加的非植物性杂质的最低检出限是5％。(二)采用河北和湖北产槐米验证杂质最低检出限1．分别取河北和湖北产槐米粉末和槐的枝叶粉末配置成枝叶杂质含量分别是5％的混合粉末。每份混合粉末精密称取lOOmg样品按上述正文实验方法进行测定。每份混合粉末平行制样3份，每份制片8片。测定并计算每份样品所用琼脂羟乙基纤维素混合液的质量和样品平均密度，最后求算出每个样品供测试的药材粉末质量W(mg)。见表58。表585％玻璃粉掺杂量的不同产地槐米样品供测试的粉末质量W(mg) 金银花、红花和槐米的显微量化研究2．将不同产地的5％玻璃粉含量的混合粉末的花粉粒、非腺毛和导管计数值A代入式子算出P(个／mg)及P的RSD％。结果见表59。表595炳2璃粉掺杂量的不同产地槐米样品P(个／呱)值注：A的单位为个，P的单位为个／rag。3．使用SPSSl7．0软件，将不同产地的5％玻璃粉含量的槐米样品分别对应和不掺杂的槐米样品的花粉粒、非腺毛和导管P(个／mg)分别做轮廓分析。它们的三个指标均数变化趋势图如图33，图34。图345％玻璃粉含量的河北槐米与不掺杂河北槐米的三指标均数变化趋势图 广州中医药大学2014届硕士学位论文图355％玻璃粉含量的湖北槐米与不掺杂湖北槐米的三指标均数变化趋势图统计分析结果：含5％玻璃粉的河北槐米样品与不掺杂河北槐米样品平行分析P=O．010，重合分析P=O．002，即含5％玻璃粉的河北槐米样品与不掺杂河北槐米样品有显著差异。含5％玻璃粉的湖北槐米样品与不掺杂湖北槐米样品平行分P=O．062，重合分析e=O．031，即含5％玻璃粉的湖北槐米样品与不掺杂湖北槐米样品有显著差异。结果说明，显微量化法对槐米中的非植物性杂质的最低检出限是5％。二、显微量化法鉴别添加非药用部位杂质(槐的枝叶)的槐米(一)添加枝叶的安徽产槐米的显微量化研究1．取槐的枝叶粉碎、过120目筛，烘干置恒重，并将其与120目安徽产槐米粉末混合，配置成枝叶杂质含量分别是3％、5％和7％的混合粉末。每份混合粉末精密称取lOOmg样品按上述正文实验方法进行测定。每份混合粉末平行制样3份，每份制片8片。测定并计算每份样品所用琼脂羟乙基纤维素混合液的质量和样品平均密度，最后求算出每个样品供测试的药材粉末质量W(mg)。结果见表60。表60三个不同枝叶掺杂量的槐米样品供测试的粉末质量W(mg) 金银花、红花和槐米的显微量化研究2．将不同枝叶含量的混合粉末的花粉粒、非腺毛和导管计数值A代入式子算出P(4"ling)及P的RSD％。结果见表61。表61含3％、5X和7X枝叶的槐米P(个／吣)值注：A的单位为个，P的单位为个／mg。3．使用SPSSl7．0软件，将三个不同枝叶含量槐米样品和不掺杂的槐米样品的花粉粒、非腺毛和导管P(个／mg)分别做轮廓分析。它们的三个指标均数变化趋势图如图36，图37，图38。凰⋯3％囫{{j《{．导叶花粉粒非募毛导管图363％枝叶含量的槐米与不掺杂的槐米样品兰指标均数变化趋势图65 广州中医药大学2014届硕士学位论文图375X枝叶含量的槐米与不掺杂的槐米样品三指标均数变化趋势图图385％枝叶含量的槐米与不掺杂的槐米样品三指标均数变化趋统计分析结果：含3％枝叶的槐米样品与不掺杂槐米样品平行分析P=O．248，重合分析P=O．218，即含3％枝叶的槐米样品与不掺杂槐米样品没有显著差异。含5％枝叶的槐米样品与不掺杂槐米样品平行分析P=O．048，重合分析P=O．017，即含5％枝叶的槐米样品与不掺杂槐米样品有显著差异。含7％枝叶的槐米样品与不掺杂槐米样品 金银花、红花和槐米的里微量化研究平行分析P=O．010，重合分析P=O．001，即含7％枝叶的槐米样品与不掺杂槐米样品有显著差异。(二)采用河北和湖北产槐米验证杂质最低检出限1．分别取河北和湖北产槐米粉末和槐的枝叶粉末配置成枝叶杂质含量分别是5％的混合粉末。每份混合粉末精密称取lOOmg样品按上述正文实验方法进行测定。每份混合粉末平行制样3份，每份制片8片。测定并计算每份样品所用琼脂羟乙基纤维素混合液的质量和样品平均密度，最后求算出每个样品供测试的药材粉末质量W(mg)。见表62。表62两个产地5，‘j支叶掺杂量的槐米样品供测试的粉末质量W(mg)2．将不同产地的5％枝叶含量的混合粉末的花粉粒、非腺毛和导管计数值A代入式子算出P(个／mg)及P的RSD％。结果见表63。表63两个产地5％枝叶掺杂量的槐米样品P(个／呕)值注：A的单位为个，P的单位为个／mg。3．使用SPSSl7．0软件，将不同产地的5％枝叶含量的槐米样品分别对应和不掺杂的槐米样品的花粉粒、非腺毛和导管P(个／mg)分别做轮廓分析。它们的三个指标均数变化趋势图如图39，图40。 广州中医药大学2014届硕士学位论文图395％枝叶含量的河北槐米与不掺杂河北槐米的三指标均数变化趋势图图405％枝叶含量的湖北槐米与不掺杂湖北槐米的三指标均数变化趋势图统计分析结果：含5％枝叶的河北槐米样品与不掺杂河北槐米样品平行分析P=O．007，重合分析P=O．003，即含5％枝叶的河北槐米样品与不掺杂河北槐米样品有显著差异。含5％枝叶的湖北槐米样品与不掺杂湖北槐米样品平行分P=O．005，重合分析P--O．000，即含5％枝叶的湖北提米样曼璺不掺杂湖北槐米样品有显著差异。结果说叽显微且化法对槐米中世竺竺竺竺吵最低检出限是矾。＼、，／／ 金银花、红花和槐米的显微量化研究第七节小节与讨论1本文通过预实验，选定槐花的花粉粒、非腺毛以及导管作为指标，这三个特征物形态特异，便于观察并与其他特征物区别开来，它们的数量在金银花显微量化研究最优取样量100毫克的情况下，计数的数值也在较适宜的范围内。因此，花粉粒、非腺毛以及导管可作为金银花显微量化研究的定量指标。2药材的采摘期对中药饮片的质量有极大的关系，本实验探讨了不同采摘期槐花与槐米在显微特征上的差异点，为二者药材质量控制提供依据。3产地因素对中药饮片的质量有极大的关系，本实验探讨了不同产地槐米在显微特征上的差异点，为槐米药材质量控制提供依据。4本实验探讨了两种不同类型杂质添加到槐米药材中时，显微量化方法对杂质的最低检出限，为鉴别槐米药材掺杂与否提供手段。 广州中医药大学2014届硕士学位论文皇±；五当日盾由实验结果可以看出，显微量化法可区分出购得的山东、河南和广西三产地的金银花，四川、新疆和河南产的红花，安徽、湖北和河北产的槐米。对于添加的非植物性和非药用部位的杂质超过最低检出限的样品，显微量化法可以鉴别出来并且可以检测出药材含量大概范围。该方法可鉴别区分同科的金银花和山银花以及同植物不同成熟期的花与花蕾。可见采用多指标计量方法能较全面反映金银花、红花和槐花药材的显微特征，使样品之间的异同点在量化的指标下更加鲜明。显微量化法的关键在于对药材显微特征物中选取可量化的指标。指标的选取主要考虑几点：(1)被选取的显微特征物要易于观察，形状较完整。如花粉粒、星状毛等。(2)数量要多。槐花中的花柱碎片形状特异但数量极少故不被选作指标。(3)便于定量。像纤维、薄壁细胞等一类组织有形态特征明显数量也多，但在粉碎过程Il，成为大小不，‘的碎片，难以定量而不被选作指标。在实际操作中，可以参考RSD％来评价指标的适宜性。在检测多指标的基础上对数据进行轮廓分析，可以同时比较多个指标，从综合的层面上对两样品进行比较分析，使得结果更加准确rⅡJ‘靠。综上所述，显微量化法-口j．作为金银花、红花和槐米质量标准研究的新方向，为提高它们鉴别和质量控制水平奠定基础。70 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广州中医药大学2014届硕士学位论文致谢本研究及学位论文是在我的导师卢文彪副教授的悉心指导下完成的。在三年的研究生生涯里，老师不仅指导我的实验更悉心培养我各方面的能力。记得研一时第一次带本科生实验课和第一次带教本科毕业生完成本科论文，我的心情是既激动又紧张，有时甚至手足无措。但在老师的指导与帮助下，我完满完成了任务。在接下来的两年里，我明显地发现自己在完成同样的任务时，更加地得心应手。我明白是老师的苦心安排与悉心培养使得我的综合能力得到提升。平时，老师除了给我们讲实验的内容，还会时时教导我们为人处世的道理。在此，非常感谢导师卢文彪副教授对我栽培与指导!同时，我也非常感谢实验室的建红师妹，给予我许多的帮助。还有实验室的全体人员，你们都是我研究生生涯里的重要的一部分。最后，谢谢我的父母。谢谢你们·1路陪伴与呵护。相信我终有。‘天会长成‘‘棵“大树”，给予别人帮助与保护。至此，是一次结束也是一个新开始!