青菜离体再生和农杆菌介导遗传转化影响因子的研究

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1、浙江大学硕士学位论文青菜离体再生和农杆菌介导遗传转化影响因子的研究姓名：范正琪申请学位级别：硕士专业：生物物理学指导教师：崔海瑞2002.5.1中文摘要本文研究了青菜的再生体系和农杆菌介导转化几种重要因子的影响，并首次探讨了辐射处理对青菜再生和遗传转化的影响。为建立青菜的高频再生体系，对影响青菜再生的因素进行了分析。在青菜的离体培养过程中，外源激素对再生有着至关重要的作用。在所用的15种激素组合中，MS培养基中附加5mg／L6-BA和O．5mgrcNAA可以使再生频率达到最高。在培养基中添加AgN03对子叶离体再生具有明显的促进作

2、用，5～7．5mg／L的AgN03可以显著提高再生频率。不同苗龄的外植体其再生频率存在很大的差异，而且随基因型的不同而变化。最适苗龄一般在无菌苗培养3～6天，矮抗青为3天，上海青为4天，苏卅1青为6天。对子叶、子叶柄、带柄的子叶、下胚轴四种外植体的再生能力进行了比较，发现带柄的子叶再生频率最高，可作为建立青菜再生体系的适宜外植体。基因型对再生也有重要的影响，不同基因型的再生能力有很大差异。在所用的5个青菜品种中，以香港菜心的再生频率最高，为78％，其它依次为苏州青、矮抗青、上海青、高桦白菜。il为了能有效地杀除共培养后残余的农杆菌

3、和筛选转化体，测定了青菜对5种抗生素的敏感性。经实验证明，离体培养的子叶对潮霉素的敏感性大于卡那霉素。因此，在青菜的遗传转化中应使用潮霉素作为筛选转化体，浓度以25mg／L为宜。在所用的羧苄青霉素、氨苄青霉素、头孢霉素三种抑菌抗生素中。根据它们对芽再生的影响，应首选羧苄青霉素。为建立农杆菌介导青菜转化的稳定体系，以gus基因瞬时表达频率为指标，对影响转化频率的几个重要因子进行了优化。}通过对菌液浓度、感染时间、共培养时间的梯度实验得出，菌液浓度为OD600=O．5、＼感染10～15分钟、共培养5天时，gus瞬时表达频率达到最高。不

4、同的农杆菌其转化效果不同，在所用的2个农杆菌菌株中，用EHAl05转化时，gus瞬时表达频率高于LBA4404。同一菌株与不同的质粒缀合，其转化频率也有差异，在菌株EHAl05与3种质粒pKUB、pKUC和pKSB的组合中，以EHAl05(pKUC)的转化频率最高。基因型对转化频率也有重要的影响，在所用的5个青菜品种中，以高桦白菜的gus瞬时表达频率最高，为54％，其它依次为上海青、苏州青、矮抗青、香港菜心。／Ill本文还研究了Y射线辐射处理对青菜离体再生和转化的影响。在再生试验时，分别采用了T射线处理外植体的供体——无菌苗和培养

5、中的外植体。发现用1～5Gv的剂量处理外植体能明显促进不定芽的再生。在转化时，分别对在感染前和感染后对外植体进行了辐射处理。结果表明在感染后用低剂量处理有助于gus瞬时表达的提高。这一结果证明，在进行青菜的组织培养和转化时，辅以低剂量的Y射线处理，可以提高再生和转化频率。关键词：青菜；再生：农杆菌介导转化；辐射／AbstractTheregenerationsystemandeffectsofkeyfactorsontransformationmediatedbyAgrobacteriuminChinesecabbage(Bras

6、sicacampestrisSSpchinensis上)werestudied，andalsotheeffectsofirradiationontheregenerationandtransformationwereexploredinthisthesis．SomefactorsshowingeffectsonregenerationweretestedforestablishmentoftheregenerationsysteminChinesecabbage．Intheprocessofinvitroculture，hormo

7、nesplayedanimportantrole．Among15combinationsofdifferentconcentrationof6-BAwithNAA，thecombinationof5mg／LBAand0．5mg／LNAAshowedthehighestrateofshootregeneration．AgN03showedobviouseffectspromptingshootregenerationandanadditionof5-75mg，Linthemediumcouldsignificantlyincreas

8、eregenerationfrequency．ExplantsfromdifferenttimeofculturedseedlingsshowedgreatdifferenceinregenerationrateThesuitableseedlin