基于rna干扰技术的加工番茄抗cmv、tomv的研究

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1、分类号：密级：无学号：2009207011单位代码：10759石河子大学博士学位论文基于RNA干扰技术的加工番茄抗CMV、ToMV的研究学位申请人乔亚红指导教师向本春教授郑银英副教授申请学位门类级别农学博士学科、专业名称作物遗传育种研究方向植物分子育种与荒漠半荒漠地区作物种质创新所在学院农学院中国·新疆·石河子2013年6月TheStudiesonTransgenicMaterialsofProcessingtomatoagainstCMVandToMVinxinjiangADissertationSubmitt

2、edtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsFortheDegreeofDoctorofAgricultureByQiaoYahong(Cropgeneticandbreeding)Dissertationsupervisor:Professor.XiangBenchunProfessor.ZhengYinyingJune,2013石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作

3、及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。研究生签名：时间：年月日使用授权声明本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查阅。有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。研究生签名

4、：时间：年月日导师签名：时间：年月日摘要植物病毒病是近年来严重危害加工番茄的主要病害之一，这与加工番茄种植面积不断扩大、栽培时间持续和重茬地大面积增加密切相关。黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)和番茄花叶病毒（Tomatomosaicvirus，ToMV）是严重危害加工番茄的两个主要病毒。在实际生产中，这两种病毒往往复合侵染加工番茄，使加工番茄上出现严重的条斑坏死症状，果实则表现为僵小畸形，表面易形成褐色斑块。严重影响加工番茄的产量和品质。多年来，人们一直都在努力地寻找解决病毒病对农作

5、物的危害方法，而抗病毒育种是目前解决这一难题的主要策略，由于传统育种方法费时费力等局限性，从而大大地限制了育种工作的进程。近年来，随着植物基因工程技术的快速发展，尤其是RNAi技术的发展为解决这一难题开辟了一条新的途径。本研究以从加工番茄上分离出来的黄瓜花叶病毒分离物NS0-4和番茄花叶病毒分离物SCS-2的全长基因序列设计干扰靶序列，利用RNAi技术构建了一条抗CMV和ToMV加工番茄的技术体系。本文的主要研究内容如下:1.RNAi载体的构建：利用软件对CMV分离物NS0-4和ToMV分离物SCS-2全长基因序

6、列进行分析，设计干扰片段，通过同位酶(BamHI/BglII)将两个干扰片段的序列进行拼接，同时以一段大小为266bp的核苷酸序列为内含子，构建了4个RNAi载体（pBi35STC4、pBi35STC9、pBi35STC12和pBi35STC14）。2.烟草遗传转化的研究：分别将4个重组质粒通过电击的方法导入农杆菌GV3101中，通过菌落PCR鉴定，表明重组质粒已被成功导入到农杆菌中。然后利用农杆菌介导的叶盘法转化普通烟（Nicotianatabacum），经过卡那霉素（50mg/L）筛选及PCR鉴定，结果表明在

7、转pBi35STC4的56株再生烟草植株中，有32株为转基因烟草；在转pBi35STC9的44株再生烟草植株中，有28株为转基因烟草；在转pBi35STC12的58株再生烟草植株中，有35株为转基因烟草；在转pBi35STC14的50株再生烟草植株中，有30株为转基因烟草。3.烟草上RNAi效果的初步评价：将转基因烟草、野生型烟草进行如下3种处理：第一种处理只接种CMV；第二种处理只接种ToMV；第三种处理同时接种CMV和ToMV。通过症状观察及RT-PCR检测，结果显示在接种20d野生型烟草100%均表现出了不

8、同程度的病毒症状，在接种30d，转pBi35STC9烟草中近50%表现出了不同程度的病毒症状，而其余50%的烟草在40d后也表现出不同的病毒症状；而转pBi35STC4、pBi35STC12和pBi35STC14烟草中，有10%～30%则在接毒40d表现出了病毒症状，结果表明在T0代转基因烟草中，转pBi35STC4、pBi35STC12和pBi35STC14烟草可延迟病